JPH03161445A

JPH03161445A - 腎炎治療剤

Info

Publication number: JPH03161445A
Application number: JP29957389A
Authority: JP
Inventors: Kazuya Otsuji; 一也大辻; Yoshio Suzuki; 良雄鈴木
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 1989-11-20
Filing date: 1989-11-20
Publication date: 1991-07-11
Anticipated expiration: 2014-05-24
Also published as: JP2893462B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は腎炎治療剤に関し、更に詳細には、腎炎治療効
果に優れ、かつ副作用の少ない腎炎治療剤に関する。

［従来の技術及び発明が解決しようとする課題］腎炎は
、免疫複合体が腎臓の糸球体に付着することが引金とな
って起こる、いわゆる免疫疾患である。小児の溶連菌感
染後急性糸球体腎炎は、発病中の血圧の管理、安静、保
温等に留意することにより、発病後６カ月までに約８０
％は冶癒する。

しかし、戊人の腎炎及び小児の一部の腎炎においては、
その予後は芳しくなく、急速進行性糸球体腎炎に至って
は、発病後数か月で死亡する症例も認められる。現在、
これら糸球体腎炎の治療は、重篤な副作用を有するステ
ロイド剤に頼っている。

また、ステロイド剤に抵抗性を示す腎炎も存在し、いま
だ決定的な薬剤がないのが現状である。

［課題を解決するための手段］本発明者らはかかる実情において、副作用が少なく、腎
炎治療に有効な薬剤を得るべく鋭意研究を行った結果、
特定の酸性ヘテロ多糖類が著しい抗腎炎活性を有するこ
とを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明はポリアンテス属（Ｐｏｌｉａｎｔｈｅｓ　Ｌ．）に属する植物から誘導
されたカルスか細胞外に分泌する酸性ヘテロ多糖類を含
有することを特徴とする腎炎治療剤を提供するものであ
る。

本発明の有効成分である酸性ヘテロ多糖類は、例えばポ
リアンテス属に属する植物から誘導されるカルスを植物
ホルモン含有培地で培養し、その培養物から採取するこ
とによって製造される（特開昭６４−１０９９７号公報
）。

ポリアンテス属に属する植物としては、例えばチューヘ
ローズ（Ｐｏｌｉａｎｔｈａｓ　Ｔｕｂｅｒｏｓａ　Ｌ
．）が挙げられる。外植片として使用可能な部位として
は、その花、茎、葉、鱗茎、根等の器官または組織の一
部か挙げられるが、特に花の一部が好ましい。

カルス誘導用の基本培地としては、植物組織培養に通常
用いられるＭｕｒａｓｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇの培地、Ｌｉ
ｎｓｍａｉｅｒ−Ｓｋｏｏｇの培地、Ｇａｍｂｏｒｇの
培地、Ｗｈｉｔｅの培地、Ｔｕｌｅｅｋｅの培地、Ｎｉ
ｔｓｃｈ　＆　Ｎｉｔｓｃｈの培地等が用いられる。

この基本培地には、植物ホルモンを添加する必要があり
、植物ホルモンとしては、２．４−ジクロロフェノキシ
酢酸（２．４−Ｄ）　、α−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）
　、インドール酢酸（ＩＡＡ）　、インドール酪酸（　
ＩＢＡ）等のオーキシン類；フルフリルアミノプリン（
カイネチン）、ペンジルアデニン（　ＢＡ）、ジメチル
アミノブリン（２ｉＰ）等のサイトヵニン類が挙げられ
る。その中でも、２．４−Ｄ単独、ＮＡＡとＢＡの組み
合わせまたはＮＡＡとカイネチンの組み合わせが良好な
結果を与える。カルス誘導に必要な植物ホルモン濃度は
、２．４−Ｄ単独の場合は５Ｘ１０−’ＭからＩＸ　ｔ
ｏ−７Ｍ，　ＮＡＡ．ｌ！：ＢＡまたはＮＡＡとカイネ
チンの組み合わせの場合はＮＡＡの濃度は５Ｘ１０−’
ＭからＩＸ　１０−７Ｍ，　ＢＡまたはカイネチンの濃
度はＩＸＩＯ−７Ｍである。

カルス誘導培地には上記の基本培地と植物ホルモンのほ
かに炭素源として糖が加えられる。糖としては、グルコ
ース、フラクトース、マンノース、キシロース、サツ力
ロース、ラムノース、フコース、デンブンなどが挙げら
れるが、通常はサツ力ロースが用いられる。

カルス誘導は固体培地でも液体培地でも可能であるが、
通常は固体培地が用いられる。

誘導されたカルスは上記のカルス誘導培地で同じ形態を
維持したまま１０代以上にわたって継代培養をすること
ができる。継代培養用の培地としては、通常基本培地と
してＬｉｎｓｍａｉｅｒ−Ｓｋｏｏｇの培地、Ｍｕｒａ
ｓｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇの培地が用いられ、植物ホルモン
としてＩＸ１０−’〜ＩＸＩＯ−’Ｍの２．４−Ｄまた
はＩＸＩＯ−’〜ＬＸ　１０”Ｍ（７）ＮＡＡとＬＸ　
１０−’　〜ＩＸ　１０−’ＭのＢＡ，炭素源としては
、グルコース、フラクトース、マンノース、キシロース
、サツ力ロース、ラムノース、フコース、デンプン等が
用いられるが、就中サツ力ロースが好ましく、その添加
量は１〜６重量％（以下、単に％という）が好ましい。

カルスから多糖類を製造するには、カルスを寒天培地等
の固体培地、液体培地で培養するが、就中液体培地で培
養するのが好ましい。基本培地としてはカルス誘導培地
と同様のものが用いられる。

植物ホルモンの種類及び濃度は多糖類の生産性に関係が
あり、例えば２．４−Ｄ，　ＮＡＡ，　ＴＡＡ，　ＩＢ
Ａ等のオーキシン類；カイネチン、ＢＡ，　２ｉＰ等の
サイトカイニン類；ジベレリンＡｓＣＧＡｓ＞等のジベ
レリン類等が使用される。この中で、２．４−ＤＳＮＡ
Ａを単独で、またはＮＡＡとＢＡもしくはカイネチンを
組み合わせて用いるのが好ましい。その濃度は、２．４
−ＤまたはＮＡＡを単独で用いる場合は５Ｘ１０−’Ｍ
から１×１０−’Ｍ，特に５Ｘ１０−’Ｍから５Ｘ１０
−’Ｍが；　ＮＡＡとＢＡまたはＮＡＡとカイネチンを
組合わせて用いる場合には、ＮＡＡ（７１）濃度ハＩ　
Ｘ　１０　−’　ＭカらＩＸＩＯ−’Ｍ，特に１×１０
−’Ｍから５Ｘ　１０−’ＭＸＢＡまたはカイネチンの
濃度は５Ｘ１０−’ＭからＩＸＩＯ−’Ｍ，特ｉ．：Ｉ
Ｘ１０−’Ｍから１×１０−’Ｍが好ましい。

炭素源としては、グルコース、フラクトース、マンノー
ス、キシロース、サツ力ロース、ラムノース、フコース
、デンブンなどが用いられる。多糖類の生産は添加する
炭素源の種類にはあまり強く影響されるものではなく、
通常サツ力ロースが用いられる。炭素源の濃度と多糖類
の生産量との間にもあまり深い関係はないが、一般には
１〜６％が好ましい。

培養法は特に制限されないが、通常、２０〜３０℃の温
度で１５〜３０日間行うのが好ましく、また振とう培養
が好ましい。

このようにして得られた培養物からの多糖類の採取は、
例えば培養物から細胞を遠沈またはろ過等によって除去
したのち、培養液をロータリーエバポレーター等を用い
て濃縮し、濃縮液にエタノールを加えて沈殿させ、沈殿
物を凍結乾燥することによって行われる。

上記多糖類の精製は、通常の多糖類の精製法に従って精
製することができる。例えば、粗精製の上記多糖類を水
に溶解し、遠心分離して不溶物を完全に除去し、透析あ
るいはイオン交換樹脂を用いる方法によって高純度精製
品を得ることもできる。

叙上の方法により得られる多糖類中には、本発明腎炎治
療剤の有効成分である酸性ヘテロ多糖類が含まれている
。このものは、２ＮのＨ．ＳＯ．を用い１　０　０　’
Ｃ、８時間加水分解した後、酢酸エチル：ピリミジン：
酢酸：水＝５：５：１：３の混合比の展開溶媒を用いて
薄層クロマトグラフィーを行い、アニリン：ジフェニル
アミンニアセトン：燐酸試薬で呈色させたところ、アラ
ビノース、マンノース、ガラクトース、グルクロン酸及
びキシロースが検出された。また、ガスクロマトグラフ
ィーによる分析結果からも、これらが構戊糖として含ま
れることが確認された。そして、箱守法によるメチル化
の後のがスクロマト分析（　ＧＣ−ＭＳ法）によれば、
その結合様式と構成比は、Ａｒａｌ−＊　　：　　−３Ａｒａ１→　：　Ｇａｌ１
→　：　−ｅ３Ｍａｎｌ＋　：２２ ↑ →４ＧｌｃＵＡ１→：　ｘｙｏ→＝ｌ．６〜２．４　：
　　１．２〜１．６：３ ↑ １　０〜１．４　：　　１．４〜２．２：１．４〜２．
２　：　　０．１〜０．３であることが認められた。ま
た、グルクロン酸のカルボキシル基はそのＯ〜５０％が
メチルエステル体として存在する。更に、本発明の有効
成分である多糖類は陰イオン交換樹脂等に吸着するので
酸性であると判断された。更にまた、高速液体クロマト
グラフィ−（カラム：東曹製ＴＳＫ　Ｇｅｌ　４０００
ＰＷ，５０００ＰＷ及び６０００ＰＷ）によれば、その
分子量は１０Ｘ　１０’〜２．ＯＸ　１０’であった。

この酸性ヘテロ多糖類は、次の物理化学的性質を有する
。

ｐ　にス・　るｒ″ 水に可溶で、エタノール、エーテル、アセトンに不溶で
ある。

Ｌ豆反葛アンスロン反応：陽性カルバゾール反応：陽性エルソンーモルガン反応：陰性４紅圭斐彪七エタノール沈殿を経たものは白色ないし灰白色粉末であ
る。

透析を経てイオン交換により精製し、凍結乾燥を経たも
のは白色綿状または繊維状である。

庄１０し度［α］乙５，０〜＋２０　（ｃ＝１．０，水溶液），、
　　　スペクトル赤外吸収スペクトルは第１図に示す通りである。

磁　　、トスペクトル＋３Ｃ一核磁気共鳴スペクトルは第２図に示す通りであ
る（溶媒＋　ＤｔＯ，チューブ５ｍｍ，内部標準ジオキ
サン）。

また、本発明に用いる酸性ヘテロ多糖類は、次の繰り返
し構造を有する。

Ｒ　：　　Ｌ−Ａｒａｌ→：　Ｄ−Ｇａｌ（１−＞３）
Ａｒａ１→　：Ｄ−Ｇａｌｌ→　：Ｌ−Ａｒａ（１→３）−Ｌ−Ａｒａｌ→：　Ｘｙｌｌ　
→＝１　２〜１．６　：　　０．８〜１．２　：　　０
．４〜０．８：０．４〜０．８　：　　０．０５〜０．ｌ５本発明の有効戊分である酸性ヘテロ多糖類が新規である
ことは、特開昭６４−１０９９７号ですでに述べた通り
他の多糖類との比較から明らかである。すなわち、本発
明の酸性ヘテロ多糖類に含まれるグルクロノマンナン構
造（−＊２）α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→４）一β一Ｄ−Ｇ
１ｃＵＡ−（１−　）を部分構造として持つ公知多糖と
しては、Ｄｒｏｓｅｒａ　娃匹思Ｂから得られる多糖（
　ＣＨＡＮＮＥら．り環曵セ１Ｌシ抄ユ．１１３巻，１
１３〜１２４頁，　１９８３年）　、Ｄｒｏｓｅｒａ　
ｂｉｎａｔａから得られる多糖（　ＣＨＡＮＮＥら，　
Ｐｈ　ｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　，　２１巻，９号．　２
２９７〜２３００頁，　１９８２年）　、Ｎｉｃｏｔｉ
ａｎａ　ｔａｂａｃｕｍの培養細胞から得られる多糖（
ＭＯＲＩら，ｑリ１旦ｍけ−Ｒｅｓ．９１巻．４９〜５
８頁，　１９８１年；　　ＡＫＩＹＡＭＡら．　Ｌ也−
ｉｃユＢｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　４８巻，２号，　４
０３　〜４０７頁，　１９８４年）などが知られている
。しかしながら、Ｄｒｏｓｅｒａ畦匹川卦及びＤｒｏｓ
ｅｒａ　ｂｉｎａｔｅから得られる多糖類は、主な結合
様式に−２Ｍａｎｌ一及び−４Ｇ１ｃＵＡ１−があり、
−３Ａｒａｌ−がないという点で明らかに本発明の酸性
ヘテロ多糖類と異なる。また、Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａ
ｂａｃｕｍから得られる多糖については、ＭＯＲ　Ｉら
の報告では主な結合様式に−３Ａｒａｌ−がないという
こと、またＡＫＩＹＡＭＡらの報告では主な結合様式に
−４Ｇ１ｃＵＡｌ、−２Ｍａｎ　１−及び−５Ａｒａｌ
−があり、−３Ａｒａｌ−かないという点で本発明に用
いられる酸性ヘテロ多糖類とは明らかに異なる。従って
本発明の有効成分である酸性ヘテロ多糖類は、従来得ら
れていたものとは異なる新規な酸性ヘテロ多糖類である
といえる。

上記酸性ヘテロ多糖類は水溶性であり、生理食塩水等に
溶解して注射剤として、またはカオリン、タルク、乳糖
、デンブン、結晶セルロースなどの担体と混合し、錠剤
、散剤、顆粒剤、カプセル剤等の経口投与剤として投与
される。

投与量は、注射剤の場合は戊年男子ｌ週間あたり１〜２
０ｍｇ，　１回１〜１０ｍｇとするのが好ましく、経口
投与の場合は成年男子１週間あたり１０〜２００ｍｇ，
↓回１０〜１００ｍｇとするのが好ましい。

［発明の効果］本発明腎炎治療剤は、抗腎炎効果に優れるのみならず、
副作用が少なく、腎炎の治療に極めて有効である。しか
も、必須戊分である多糖類は植物組織培養法の応用によ
り均一に製造することかできる。

［実施例］次に、実施例を挙げて更に詳細に説明するが、本発明は
これらに限定されるものではない。

実施例１　　多糖類の製造：ポリアンテス属に属する植物として、チューベ口ーズ（
Ｐｏｌｉａｎｔｈｅｓ　ｔｕｂｅｒｏｓａ　Ｌ．）を用
いた。カルスは滅菌したチューベローズの開花２〜７日
前の蕾みを植物ホルモンとしてＬＸ　１０−’ＭのＮＡ
ＡとＩＸ　１０−’ＭのＢＡを含み、炭素源として３％
のサツ力ロースを含むＬｉｎｓｍａｉｅｒ−Ｓｋｏｏｇ
の培地（寒天培地）を用いて誘導した。誘導されたカル
スは同培地で継代培養した。数代以上に継代し安定化し
たカルスを植物ホルモンとしてＩＸ　１０−’Ｍの２．
４−Ｄを含み、炭素源として５％のサツ力ロースを含む
ＬｉｎｓｍａｉｅｒＳｋｏｏｇの培地（液体培地）に５
％濃度となるよう接種した。培養は暗所にてロータリー
シェーカーを用いて振とう数１２Ｏ　ｒ．ｐ．ｍ．　、
２７±１℃で３０日間行なった。この後、ろ過及び遠心
分離により、培養液から細胞を取り除き、これをロータ
リーエバポレ一ターを用いて濃縮した。この濃縮液に約
３倍量のエタノールを加え、５℃で２４時間静置し沈殿
を得た。この沈殿を遠心分離によって回収し、７０％エ
タノールで３回洗浄した後、凍結乾燥により水分を除去
し、目的とする多糖類を得た。

以上の操作を５回行ない、ロットによる多糖類収量、全
ａｍ、ウロン酸量、蛋白質量、水分量、中性拡組戊比の
変動を比較した。結果を第工表に示す。

第１表＊：ＡｒａをｌＯとしたときのｘｙｔ、Ｍａｎ及びＧａ
ｌの比率第１表より明らかなように、上記製造法により
得られた多砧項は、．完全人工制御下での培養にょって
得られるため、ロットによる多糖類収量、全糖量、ウロ
ン酸量、蛋白質量、水分量、中性糖組戊比の変動は少な
く、均一性の高いものである。

実施例２腎炎の実験モデルとして、抗ＧＢＭ（Ｇｌｏｍｅｒｕｌ
ａＢａｃｅｍｅｎｔ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ）腎炎を用いた
。すなわち、ラットの腎皮質からＧＢＭを調製し（「新
薬開発のための薬効スクリーニング法一最新の動向と実
際Ｖｏｌ．ＩＪ　，小澤光監修，清至書院，　１９８４
．　Ｐ．１４３）　、これをフロインドの完全アジュバ
ントと共にウサギに与え、抗ラットＧＢＭウサギ血清（
以下、抗血清と略す）を得た。この抗血清０．７５ｍｌ
２を体重１６０　−　１８０ｇのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａ
ｗｌｅｙ系ラットの尾静脈より注射し、腎炎を誘発した
。本発明品の投与は、２　０　ｍｇ／ｋｇの投与量で、
抗血清投与日を起点に、■前投与：５日前から１２日後
まで投与■同日投与：Ｏ日から１２日後まで投与■後投
与：１日後から１２日後まで投与の３種とした。抗血清
注射後１日目、５日目及び１０日目に尿を採取し、尿中
の蛋白量を定量した。

結果は、対照群を１００としたときの相対値として第２
表に示した。

第２表第２表から明らかなように、本発明品は投与時期にかか
わらず腎炎の重要な指標である蛋白尿を顕著に抑制した
。

実施例３急性毒性試験：７週令のＩＣＲ系雌マウス５匹を用いて、急性毒性試験
を行なった。実施例１で得た酸性ヘテロ多糖類の１９．
７ｍｇ／ｒｒｆｉ液を約０．４Ｔｎｆｉ採り、２時間間
隔で４回全投与量が１　０　０　０　ｍｇ／ｋｇとなる
ようマウスに腹腔内投与した。

その結果、７日目において全てのマウスが生存しており
、投与後の全身症状にも変化は認められなかった。

【図面の簡単な説明】第１図は、本発明腎炎治療剤の有効戊分である酸性ヘテ
ロ多糖類の赤外線吸収スペクトルを示す図面であり、第
２図はこの多糖類の１３ｃ一核磁気共鳴スペクトルを示
す図面である。以上

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ポリアンテス属（￥Ｐｏｌｉａｎｔｈｅｓ￥　￥
Ｌ．￥）に属する植物から誘導されたカルスが細胞外に
分泌する酸性ヘテロ多糖類を含有することを特徴とする
腎炎治療剤。
（２）アラビノース、マンノース、ガラクトース、グル
クロン酸及びキシロースを構成糖として含有し、それら
の結合様式と構成比がＡｒａ１→：→３Ａｒａ１→：Ｇａｌ１→：▲数式、化
学式、表等があります▼：▲数式、化学式、表等があり
ます▼：Ｘｙｌ１→＝１．６〜２．４：１．２〜２．０
：１．０〜１．８：１．４〜２．２：１．４〜２．２：
０．１〜０．３であり、分子量が１×１０＾４〜２×１
０＾７である酸性ヘテロ多糖類を含有することを特徴と
する腎炎治療剤。