JPH03144360A - カテコールアミン類の分析装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業」−の利用分野ン 本発明は、細孔内部にのみホウ酸基を持つ樹脂を用いて
試料中のカテコールアミン類を分析するカテコールアミ
ン類の分析装置に関する。

〈従来の技術〉 生体試料（血清、血漿、尿等）中のカテコールアミン類
の分析を行うには高速液体クロマトグラフィーを用いて
行われることが多い。しかし、生体試料中には多くの成
分か共存しているため、直接高速液体クロマトグラフィ
ーに注入して分析を行うことは難しく必ず前処理が必要
となっている。

このような前処理法の代表的なものとしては、アルミナ
ゲルを用いた吸着法がある。この吸着法は、試料をアル
ミナカラムに注入しカテコールアミン類を吸着させた後
、カラムを洗浄することでタンパク質等の不要成分を洗
い出し、その後カテコールアミン類をアルミナカラムか
ら脱着させ、高速液体クロマトグラフィーで分析を行う
という方法である。

しかし、この吸着法はカテコールアミン類の回収率が非
常に低く、またアルミナカラムの再生操作が煩雑である
ため、高速液体クロマトグラフィー等に組み込みオンラ
インで前処理を行うことは困難であるという欠点がある
。

上記前処理方法の第２のものは、アガロース等の基材に
ホウ酸官能基を導入した樹脂を用いるものである。この
樹脂は、例えばアルドリッチ社より販売されており、粒
子径０．１〜０．４ｍｍのアガロースゲルにスペーサを
介して２０〜４０μｍ　ｏ　Ｉ　／　ｇのポウ酸が尋人
されているものである。

この樹脂は、主に糖タンパク質類の選択的な補足を目的
につくられたものであるが、カテコール型物質に対して
も特異的な吸着能を示すため、カテコールアミン類の吸
＠樹脂としても使用可能である。このホウ酸導入アガロ
ースゲルを用いた前処理法及び分析法については既にい
くつか報告されている。

しかし、上記ポウ酸導入アガロースゲルを高速液体クロ
マトグラフィー等に組み込みオンラインで前処理を行う
にはいくつかの問題点がある。即ち、γカ１アースゲル
は、アカロースをエピクロロルヒドリン等により架橋し
たもので、非常に軟質であるため、微粒子化による高性
能化をすることはできない、そのため、使用できる粒子
径は大きくなり結果として吸着特性の流速依存性が強く
なる。また、基材の軟質かのために高速液体クロマトグ
ラフィー等で使用するには、ホウ酸ゲルの長期的な安定
性という点で問題である。

一方、ｃｉｓ−グリコール型及びカテコール型物質がホ
ウ酸と弱塩基性緩衝液中で陰イオン性の銘木を形成する
ことは周知であり、ホウ酸基を有する充填剤を用いるこ
とにより、これらのｃｉｓ−グリコール型及びカテコー
ル型物質を吸着・濃縮することが可能であることは容易
に推察できる。このような考えに基づきいくつかの提案
がなされている。

しかし、ホウ酸ゲルに吸着する物質はカテコールアミン
類のみならず、糖類や糖タンパク質も同様に吸着される
。市販されているアガロース−ホウ酸ゲルの場合、糖タ
ンパク質の吸着をスムーズにさせるためスペーサを用い
てホウ酸基を導入しているが、糖タンパク質以外の低分
子物質のみを吸着させるには必ずしもスペーサは有効で
はない。

つまり、試料中のカテコール型低分子物質、例えばカテ
コールアミン類を吸着させようとする場合、試料中に共
存する糖類や糖タンパク質なども同時に吸着されるため
選択的な吸着を行うことができず、余剰成分吸着により
カテコールアミン類の吸着量か成子したり再現性が悪く
なるという問題もある。

このように従来から行われているホウ酸ゲルによるオン
ライン前処理法は、種々の問題点を持ち合わせているも
のの、理論的にはオンライン前処理−商運液体クロマト
グラフィー法あるいはオンライン前処理−フローインジ
ェクション法を行う上でもっとも有効な方法である。し
かし、ホウ酸ゲルには、カブコールアミン以外に糖類や
糖タンパク質が吸着し、カテコールアミン類の分析を妨
害する。また、拳法のような分析法においてもうとも重
要な分析の再現性に関してはホウ酸ゲルによるオンライ
ン前処理法にあり、ホウ酸ゲルの吸着再現性や安定性が
大きな問題となる。

〈発明が解決しようとする課題〉 本発明は、かかる状況に鑑みてなされたものであり、そ
の目的は、ホウ酸ゲルの安定性及び再生操作の煩雑さに
関する問題点を解消させ、オンライン前処理−高速液体
クロマトグラフィー法を行う上でもっとも有効なカテコ
ールアミン類の測定装置を提供することにある。

く課題を解決するための具体的な手段〉本発明は、カテ
コールアミン類の分析装置において、吸着用緩衝液を送
液する第１のポンプと、脱着用ＭＩ街析液送液する第２
のポンプと、試料注入器と、基刑の表面に陰イオン性の
高分子層を有し細孔内部にだけホウ酸基を持つ充填剤が
充填され試料中のカテコールアミン類を吸着・濃縮する
前処理カラムと、該前処理カラムを装着した流路切替バ
ルブと、洗浄用溶媒と脱着用Ｍ新液を切替えて供給する
第２切替バルブと、シーケンサと、分離カラムと、電気
化学検出器と、データ処理器とを設け、該シーケンサで
前記第１及び第２の切替えバルブの切替えタイミング、
データ処理器のスタート・ストップ１検出器のオートゼ
ロ、試料注入器における試料の注入をコントロールする
ことによって前記課題を解決したものである。

く実施例〉 以下、本発明について図を用いて詳しく説明する。第１
図は本発明実施例の構成説明図であり、図中、ｌは吸着
用緩衝液、２は吸着用績ｆｆＩ液を送液する第１のポン
プ、３は脱着用Ｍ’ｊｌｉ液、４は脱着用緩衝？１ｋを
送液する第２のポンプ、５は試料注入器、６は前処理カ
ラム７を装着した６ボートの流路切替バルブ、８は洗浄
用溶媒、９は溶媒切替バルブ、１０は分離カラム、１１
は電気化学検出器、１２はシーケンサ、１３はデータ処
理器である。また、各切替バルブ６．９の切替えタイミ
ング、データ処理器１３のスタート・ストップ、検出器
１１のオートゼロ、試料注入器５における試料の注入な
どは全てシーケンサ１２によりコントロールされている
。第２図はこのようなシーケンサのコントロール動作を
示ずタイムチャー１・であり、Ａはタイマーの時間（単
位は例えば分）、Ｂは試料注入器５の駆動（即ちインジ
ェクト）のタイミング、Ｃは第１バルブ６の駆動（即ち
オンオフ）のタイミング、Ｄは第２バルブ９の駆動（即
ちオンオフ）のタイミング、Ｅはデータ処理器１３のス
タート・ストップのタイミングをそれぞれ示している。

以下、第１図及び第２図を用いて本発明実施例の動作説
明を行なう。第１図のような構成からなる本発明の実施
例において、試料注入装置５に満たされたカテコールア
ミン類を含む被測定試料は、第２図の時間ＡがＯの時点
で試料注入器５がオン（即ちＩｎｊｅｃｔ）になると、
第１ポンプ２から送られている吸着用Ｍ！ｉ液１（ｐ１
４８〜９，５のリン酸緩衝液）により搬送され、前記切
替バルブ６の６ａ−６ｂのボートを経て前処理用カラム
７に注入される。被測定試料中のカテコールアミン類は
、前処理カラム７に吸着されるが、タンパク質などの余
剰の成分は前処理カラム７に吸着されること無くカラム
外に溶出し、切替バルブ６の６ｅ−θｆのボートを通っ
て分析システム外（廃？ｔにｒＪ　）に流出される。

次いで、前処理カラム７に吸着されたカテコールアミン
類の脱着は、第２図の時間Ａが２の時点で第１切り替え
バルブ６をオン（ＯＮ）にして切り替え、脱着用の第２
Ｍ１！７１液３を通液することで行われる。即ち、第１
切り替えバルブ６が切り替わるとき、第２ポンプ４によ
り送液されている第２脱着用緩衝液３　（ｐＨ２〜３．
５のリン酸緩衝液）は、第１切り替えバルブ６の６ｃｍ
６ｂのボートを通って前処理カラム７に送られる。この
前処理カラム７に吸着されていたカテコールアミン類は
、ＭＩ衝新液ＰＨ変化によりホウ酸官能基との錯形成力
が無くなり前記脱着用の第２緩衝液３により前処理カラ
ム７から溶出される。溶出されたカテコールアミン類は
、第１切り替えバルブ６の６ｅ−６ｄを通って分離カラ
ム１０に送られる。

このようにしてカテコールアミン類が前処理カラム７か
ら溶出し分離カラム１０に注入されると、第２図の時間
Ａが１２の時点で第１切替バルブ６は再び切換えられて
初期状態に戻り、前処理カラム７には第２緩衝液３が通
液され、前処理カラム７の洗浄・活性化が行われる。こ
の洗浄・活性化は分析が終了するまで行われる。

分離カラム１０に注入されたカテコールアミン類は分離
カラム１０内で分離され、電気化学検出器１１によって
検出される。また、データ処理器１３は第２図の時間２
の時点でスタートし時間１２の時点でストップするよう
になっており、分離カラム１０にカテコールアミン類が
注入されると同時に、データ処理器１３は電気化学検出
器１１から信号を受けとり、分析終了と同時に各成分の
濃度を計算し分析結果を打ち出すようになっている。

このような手順で分析が行われるが、尿の分析を行なう
場合には目的のカテコールアミン類以外の成分も若干前
処理カラム７に吸着され、分離カラム１０に注入されて
しまう成分がある。このため、カテコールアミン類より
も時間がかがって分離カラムから溶出してくる。従って
、目的成分の溶出後に（即ち第２図の時間１２の時点で
）、第２切換えバルブ９をオンにして切替え、有機溶媒
を含む洗浄用溶媒８を第２ポンプ４を用いて若干嵐送液
する。このような操作により分析間隔を縮めることかで
きる。

このようにしてカテコールアミン類は再現性よく測定が
行われる。

次に、本発明者らが行なった具体的な実施例について更
に詳しく説明する。

まず、最初に、ホウ酸ゲルの調整を行なう、即ち、エチ
レンクリコールジメタクリレートとグリシジルメタクリ
レートの共重合体（架橋度３５重景％）を酸加水分解し
て得られたヒドロキシメタクリレ−１・ゲル（平均粒子
径１１μｍ、排除限界分子量３０００　［糖類で測定］
）５ｇとエピクロロルヒドリン３ｇをＩＮの水酸化ナト
リウム溶液５０　ｍＩ中で４０℃１．５時間反応させエ
ポキシ基を導入した。

このエポキシ基が導入されたヒドロキシアルキルメタク
リレートゲル５ｇ（湿潤型蓋）を、３０ｍ１の１％カル
ホキジメチルセルロース水溶液中に分散させ、１００μ
ｌのポウフッ化亜鉛（４５％水溶液）を添加後、４０℃
のインキュベータの中で４時間反応させた０反応後、上
記樹脂を純水と０．１Ｍの塩化ナトリウム溶液で十分洗
浄しな。

反応後の樹脂を、１％のデトラブヂルアンモニウムハイ
ドロオキサイド水溶液に分散し、ドアミノフェニルボウ
酸０．５ｇを添加溶解後、４０°Ｃで４時間反応させた
。

反応後の樹脂を純水とアルコールで洗浄後、再度純水と
０．１Ｍの塩化すｌ・リウムで洗浄した後、純水分散し
１晩放置した。

次に、ホウ酸ゲルの吸着特性を調べた。即ち、上記ホウ
酸ゲルを、内径４．６ｍｍ、長さ］Ｏｍｍのステンレス
製カラムに充填し、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ９，
４＞を送液しカテコールアミン類３種（エビネフィリン
、ノルエピネフィリン、ドーパミン）を各２０℃ｇ／ｍ
ｌ含む標準液と血清及び前記標準液を添加した血清を注
入しカテコールアミン類及びその他の物質の吸着度合い
を調べた。移動相の流量は１　ｍ　ｌ　／　ｍ　ｉ　ｎ
で、試料注入量は２０μＩで行った。検出器には、ダイ
オードアレー型の紫外吸収検出器を用い、２００〜４０
０　ｎ　ｍの範囲で溶出成分をモニターした。

カラム温度は４０℃で行った。

カテコールアミン類は３ｍ１ｎ以降に非常に幅の広いピ
ークとなって溶出した。血清及びカテコールアミン類を
添加した血清を注入した場合では、約０．１ｍ１ｎのと
ころから大きなピークの溶出が始まった。このピークは
約１．６ｍ１ｎのところでベースラインに戻り、カテコ
ールアミン類のピークとはまったく重ならなかった。

上記榎ｉ液と同様の緩衝液を用いてアルブミンとリゾチ
ームの回収率を求めた。

アルブミンは９８％、リゾチームは９９％で良好な回収
率を示した。

更に、測定流量を２ｍｌ／ｍｉｎに上げて同様の測定を
行ってみたが、吸着能力には変化がなく、高流量で使用
可能であることがわかった。

その後、ホウ酸ゲルを用いたカテコールアミン類の分析
を行なった。即ち、前述のホウ酸ゲルを内径４．６ｍｍ
、長さ１０ｍｍのステンレス製カラムに充填し前処理カ
ラムとし、尿中のカテコールアミン類の測定を行った。

測定条件を以下に示す。■吸着用緩衝液；５０ｍＭリン
酸緩衝液、ｐＨ８，５、流量１ｍｌ／ｍｉｎ、■脱着用
緩衝液：５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ３，０、流量１ｍ
ｌ／ｍｉｎ、■分離カラム；オクタデシルシラン結合シ
リカゲル、粒子径５μｍ、■内径４．６ｍｍ、長さ２５
０ｍｍ、■分離用移動相：脱着用移動相と同じ、流量１
　ｍ　Ｉ　／　ｍ　ｉ　ｎ、■検出器；電気化学検出器
、■測定を行ったシステム構成：第２図（ロ）に示した
ものと同じ、尚、試料としての尿は、常法に従い塩酸で
加水分解を行った後、１μｍを前処理カラムに注入し測
定を行った。

上述のような測定条件下で８回連続して測定したところ
、保持時間については全く変動がなく非常に再現性よい
測定が行えた。濃度については、若干のバラツキがある
がエビネフィリン（Ｅ）、ノルエピネフィリン（ＮＥ）
、ドーパミン（ＤＡ）を数％以内の変動で測定すること
が出来た。この測定には内部標準物質を用いず行ったか
、実際の測定には内部８ｔｉ準物質を添加し測定を行う
ほうがより再現性のよい測定が行える。内部標準物質と
しては、ジヒドロキシベンジルアミンなどが適用でき、
内部標準物質も本発明の前処理カラムで吸着・Ｊａ出来
ることを確認できた。〈発明の効果〉 以１訂しく説明したように、本発明は、カテコールアミ
ン類の分析装置において、吸着用ＭｆＲ１＆を送液する
第１のポンプと、脱着用緩衝液を送液する第２のポンプ
と、試料注入器と、基剤の表面に陰イオン性の高分子層
を有し細孔内部にだけホウ酸基を持つ充填剤が充填され
試料中のカブコルアミン類を吸着・ｆｉ縮する前処理カ
ラムと、該前処理力・ラムを装着した流路切替バルブと
、洗浄用溶媒と脱着用ＭＨＩ液を切替えて供給する第２
切替バルブと、シーケンサと、分離カラムと、電気化学
検出器と、データ処理器とを設け、前記シゲンサで前記
第１及び第２の切替えバルブの切替えタイミング、デー
タ処理器のスタート・ストップ、検出器のオートゼロ、
試料注入器における試料の注入をコン１ヘロールするよ
うに構成した。換言するならば、タンパク質が浸透でき
ないような細孔径を持ち、基材表面に陰イオン性の高分
子層が結合され、細孔内部にのみホウ酸基を有するホウ
酸ゲルを前処理カラムとし、流路切り替えバルブ中に装
着し、吸着用緩衝液でカテコールアミン類のみを前処理
カラム中に吸着させ、不要成分の溶出後説着用Ｍ新液に
切り替え、カテコールアミンを前処理カラムより脱着さ
せ分析システムに送り込むように構成した。このため、
タンパク質などの余剰成分の妨害を極力抑えることが可
能になり、再現性よくオや１定することが可能となった
。

また、本発明のホウ酸ゲルを用いてｐ　Ｈ８〜９゜５の
緩衝液でカテコールアミン類を吸着させる場合、タンパ
ク質を代表とする両性電解質及び陰イオン性の試料のほ
とんどは負に荷電しているため、充填剤表面の陰イオン
性官能基のためにイオン的に排除され、ホウ酸ゲルへの
吸着は極力抑えられるなめ、特殊な洗浄行程を必要とし
ない、更に、吸着用緩衝７疲のｐ　Ｈが高く、前処理カ
ラムの活性化の必要もないため、洗浄操作不要という点
と合わせると、測定システムは非常に簡単になり、測定
時間も大幅に短縮できる。

前処理カラムからのカテコールアミンの脱着は、ｐ　Ｈ
２〜３．５の緩衝液で行うが、このｙＩ街析液ｐ　Ｈは
カテコールアミン類の脱着をスムーズにさせるという点
で必須の条件であるが、前処理カラムにイオン交換的に
保持された物質を洗浄できるという副次的効果もある。

更に、この脱着用緩衝液は、逆相分配モードでカテコー
ルアミン類を分離分析する際の移動相としてそのまま使
用できるため、分離カラムに移動相と異なる溶媒の混入
を最小限にできるため、再現性の良い安定した分析か可
能となっている。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明実施例の構成説明図、第２図は本発明実
施例の動作を説明するためのタイムチャートである。 １．３・・・緩衝液、２．４・・・ポンプ、５・・・試
料注入器、６．９・・・切り替えバルブ、７・・・前処
理カラム、８・・・洗浄用溶媒、９・・・分離カラム、
１１・・・電気化学検出器１２・・・シーケンサ、１３
・・・データ処理器

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 　吸着用緩衝液を送液する第１のポンプと、脱着用緩衝
   液を送液する第２のポンプと、試料注入器と、基剤の表
   面に陰イオン性の高分子層を有し細孔内部にだけホウ酸
   基を持つ充填剤が充填され試料中のカテコールアミン類
   を吸着・濃縮する前処理カラムと、該前処理カラムを装
   着した流路切替バルブと、洗浄用溶媒と脱着用緩衝液を
   切替えて供給する第２切替バルブと、シーケンサと、前
   記試料中のカテコールアミン類をクロマトグラフイック
   に分離する分離カラムと、電気化学検出器と、データ処
   理器とを具備し、前記シーケンサで前記第１及び第２の
   切替えバルブの切替えタイミング、データ処理器のスタ
   ート・ストップ、検出器のオートゼロ、試料注入器にお
   ける試料の注入をコントロールすることを特徴とするカ
   テコールアミン類の分析装置。