JPH03133392A

JPH03133392A - モノクローナル抗体およびこれを産生するハイブリドーマ

Info

Publication number: JPH03133392A
Application number: JP1271281A
Authority: JP
Inventors: Yoshihiro Aoyama; 佳弘青山; Tetsuo Ohashi; 鉄雄大橋; Shigeru Fukushima; 福島　繁
Original assignee: Shimadzu Corp
Current assignee: Shimadzu Corp
Priority date: 1989-10-17
Filing date: 1989-10-17
Publication date: 1991-06-06

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属
の抗原に対するモノクローナル抗体およびその製法、並
びにこの抗体を産生ずるハイブリドーマに関する。本発
明のモノクローナル抗体は、細胞、組織および体液中の
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の菌の検
査診断に用いられる。

［従来の技術］ハイブリドーマを個々の抗原に対する抗体の供給源とし
て最初に使用したのはケーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）及びミ
ルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）　Ｅネイチャー（Ｎａ
ｔｕｒｅ）　２５６巻、４９５〜４９７頁（１９７５年
）］である。ハハイブリドマはミエローマ細胞の有する
無限増殖能と、免疫牌細胞の有する抗体産生能との両方
の特性を有し、モノクローナル抗体を連続的に産生ずる
。

細胞と細胞の融合には、ＨＶＪウィルスを使用する方法
、ポリエチレングリコールを使用する方法および電流を
利用する方法がある。これらの方法を用いると細胞融合
は種々の細胞間で起こり、目的とするミエローマ細胞と
牌細胞の間の細胞融合だけでなく、ミエローマ細胞同志
および絆細胞同志の融合も生ずる。しｆこがって、この
ような６種融合細胞の中から抗体産生ハイブリドーマだ
（ｔを選択する必要かあり、ミエローマ細胞はＨＧＰＰ
Ｔ酵素を欠損した８−アザグアニン耐性株を使用する。

ＨＧＰＲＴ酵索欠損株は、アミ７′プテリン存在下でヌ
クレオチドの合成ができない几めＩ−１ＡＴ（ヒボキサ
ンチン、アミノプテリン、チミジン）培地中では生存で
きず、ミエローマ細胞及びミエローマ細胞同志の融合細
胞は生存不可能である。一方、牌細胞及び牌細抱同志の
融合細胞は正常細胞であるため寿命により、２週間以内
に死滅する。これらに対し、ミエローマ細胞と胛細胞と
の融合細胞は、もともと牌細胞が存するＨＧＰｒ（Ｔ酵
素によりＨＡＴ培地中でも生存でき、ミエローマ細胞の
持つ無限増殖能により増え続ける。このようにして、Ｈ
Ａ　Ｔ培地によりミエローマ細胞と胛細胞との間の融合
細胞が選択的に得られる。

このような細胞融合技術、及び融合細胞の選択技術によ
りモノクローナル抗体の製造が可能である。

現在、真菌症の一つである肺アスペルギルス症、外耳道
真菌症の原因菌であるアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓ）属の菌由来の抗原に対するモノクローナル抗
体について、従来より高い特異性を示すモノクローナル
抗体が望まれている。

本発明の目的は前記アスペルギルス症等の原因菌に由来
する抗原に対し特異性の高いモノクローナル抗体を提供
することにある。

［課題を解決するための手段］本発明はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属
の少なくとも１１株由来の抗原と複合体を形成するモノ
クローナル抗体を提供するものである。ここでアスペル
ギルス属の１１株とは、アスペルギルス・フミガトス（
ＪＣＭ　１９１８．１９１７．１７３８．１７３９）、
アスペルギルス・フラブス（ＪＣＭ　２０６１．２２２
５）、アスペルギルス・ニガー（ＪＣＭ　５５４６）、
アスペルギルス・オクラサス（ＪＣＭ　１９５８）、ア
スペルギルス・オリザエ（ＪＣＭ　２２２６）、アスペ
ルギルス・テレウス（ＪＣＭ２５９ｇ）、アスペルギル
ス・ニドランス（ＪＣＭ　２７２８）である。

また、本発明は、マウスの骨髄腫細胞と、アスペルギル
ス属由来の抗原によりあらかじめ免疫されたマウスから
得られた牌細胞との融合により形成されたハイブリドー
マを提供するものであり、本発明の抗体はかかるハイブ
リドーマにより産生される。

（１）融合用婢臓細胞の調製ＢＡＬＢ／Ｃマウスまたは他の種類のマウスをアスペル
ギルス・ニドランス（Ａｓｐｅｒｇ　ｉ　Ｉ　Ｉ　ｕｓ
ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来の抗原で免疫化する。

抗原は市販のもの、あるいはアスペルギルスを増殖させ
、得られた菌体を機械破壊し、これを濾過したものなど
を抗原液とする。

なお、アスペルギルス・ニドランス以外のアスペルギル
ス属の菌体を用いてもよい。菌体の破壊、分画には公知
の方法をいずれも採用してよい。

前記抗原を用いマウスに数回の免疫を行う。免疫には抗
原溶液（抗原量１〜５０μｇ）を各回、アジュバントと
等量混合してエマルジョンとしたしのを皮下または腹腔
内に注射する。最終免疫には、免疫時の数倍量をＰＢＳ
等に懸副し、置部静脈内に注射する。

免疫したマウスより稗臓を摘出し牌細胞をほぐし出し、
牌細胞中の赤血球を破壊する。培地を加えて遠心し、上
清を吸引除去して培地に懸濁する。

（ＩＩ）細胞融合（ハイブリドーマの生成）牌細胞と骨
髄腫細胞との細胞融合は、電気融合、ポリエチレングリ
コールその他の融合促進剤による融合など従来公知の方
法がいずれも用いられてよい。マウス骨髄腫細胞はＰ３
Ｕ１、Ｎ５−１゜ＳＰ３などが用いられる。好適な細胞
比は骨髄腫細胞１個当たり牌細胞１〜１０個であるが、
各細胞源に依り適宜決定される。これら両細胞を融合し
た後、遠心分離などにより分画を行い、ＨＡＴ培地にＬ
’［ｌしマイクロプレートにまき込む。炭酸ガス培養装
置にプレートを移し培養し、ついで培地をＨＴ培地、さ
らにＮ５−１培地に替えた。

（スクリーニング）融合細胞が目的とするモノクローナル抗体を産生じてい
るかどうかをスクリーニングするため下記の酵素免疫測
定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて細胞培養上清中の抗体価を
測定した。

酵素免疫測定法 ■ＥＬＩＳＡ用プレートの準備９６ｗｅｌｌイムノプレート（１ｎｔｅｒ　ｍｅｄ社）
の各ｗｅｌｌにＰＢＳで５μｇ／ｍＱのａ変に希釈した
抗原溶液（後述）Ｉ００７ｚ（！ずつ加え、パラフイル
ムでふたをし４℃で一晩放置し、抗原をプレートに付着
させた。

翌日抗原液を捨て、抗原が付着しなかったｗｅｌ１表面
をふさぐためＢＳＡ溶液（後述）２００μＱを各ｗｅｌ
ｌに加えてパラフィルムでふたをし、４℃で一晩放置し
た。

■スクリーニングＢＳＡ溶液を捨て洗浄液（後述）で４
回洗浄後、融合細胞の培養上清を各１００μＱをｗｅｌ
ｌに加えパラフィルムでふたをし、室温で２時間放置し
た。培養上清液を捨て洗浄液で４回洗浄後、ベルオキン
ダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇ抗体（ザイメット社）希釈
液（洗浄液で５０００倍希釈）を各１００μＱをｗｅｌ
ｌに加え、パラフィルムでふたをし室温で２時間放置し
た。

これを捨て洗浄液で４回洗浄後、基質液（後述）を各１
００μＱ加えて室温で遮光し、１時間酵素反応させた。

２Ｍ−Ｈ，Ｓｏ、を各１００μＱ加えて反応を停止し、
イムノリーダーにより各ｗｅｌｌ　４９０　ｎｍにおけ
る吸光度を測定した。目的とするモノクローナル抗体が
あれば発色する。

（クローニング）ＥＬＩ　ＳＡ法により発色したｗｅｌｌの細胞を限界希
釈法によりクローニングを行った。これらのｗｅｌｌに
ついて免疫抗原に対する特異抗体活性、および抗体価を
ＥＬＩＳＡ法により測定した。発色したｗｅｌｌの細胞
について大量培養を行った。

［実施例コつぎに本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。

（１）融合用胛臓細胞の調製（抗原作成）アスペルギルス・ニドランス（Ａｓｐｅｒｇ　ｉ　Ｉ　
ｌ　ｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ）粉末抗原をＰＢＳに溶解し
て抗原液とした。

（免疫）静岡県実験動物農業協同組合から購入した５週令の雌性
Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃマウスを使用した。

第１回免疫：　ＰＢＳにより５０μｇ／ｍｃの濃度に希
釈した抗原溶液１ｍ（ｉをフロインド不完全アノュバン
ド１ｍＣに融解し、２００μρをマウスの腹腔内に注射
した。

第２回免疫：第１回免疫後１４日目に第１回免疫と等量
を注射した。

静脈注射：第２回目免疫後１４日目にＰＢＳで５００μ
ｇ／ｍｇに希釈した抗原溶液１００μσをマウス置部に
静脈注射した。

静脈注射後３日目に細胞融合を行った。

（牌細胞の準備）免疫したマウスを頚椎を脱臼させて殺し、卓上クリーン
ベンチ下で無菌的に開腹して牌臓を摘出した。これをあ
らかじめ冷やしておいたＮ５−１培地入り５０ｖジ遠沈
管（ＣＯＲＮＩＮＧ社）に移し、クリーンベンチまで運
んだ。

Ｎ５−１培地で洗浄し、はぐして２００メツンユのステ
ンレス網に通して押細胞を得た。稗細胞中の赤血球を破
壊するため、１５００　ｒｐｍ、５分間遠心して上清を
吸引除去し、ついでペレットをホ＜−Ｌ５．ｚ＆　（７
）０．１７Ｍ　　ＮＨ，Ｃｉ！溶液（０’Ｃ）を加え氷
上で１０分間放置した。２ｍＱのＦｅ２（Ｍ、Ａ、Ｂｉ
ｏｐｒｏｄｕｃｔｓ社）　８ｚＱｆ）ＲＰＭ　Ｉ　１６
４０培地（後述）（０℃）を加えて遠心し、上清を吸引
除去してＮ５−１培地に再浮遊した。この牌細胞数及び
骨髄腫細胞（Ｐ３ＵＩ）数を測定したっ０１）細胞融合
（ハイブリドーマの生成）牌細胞（１，２ｘｌＯ６個）
と骨髄腫細胞（Ｐ３Ｕｌ）（２，４，Ｘｌ０９個、ＡＴ
ＣＣＣＲＬ−１５９７）を５０ｚ（！遠沈管中で混和し
、１５００ｒｐｍ、５分間遠心して上清を吸引し、ペレ
ットをほぐしてフユーノヨンバッファー（後述）に再浮
遊さ０゛た後、ｌ　５００ｒｐｍ、　５分間遠心した。

これを２回行つ几。

上清を完全に除去し、ペレットをはぐし６ｙｔ（１のフ
ュージョンバッファーに懸濁し、４００μＱずつ融合チ
ャンバーに入れ、細胞融合装置Ｓ　Ｓ　Ｈｌ　（（抹）
品用製作所製）により電気融合を１４回行った。

５分間放置後チャンバーから細胞を回収し、Ｎ５−１培
地にｇ６し３０分間インキュベートした。

遠心後、上ｔ＋７を吸引し、ペレットをほぐし牌細胞濃
度がｌＸｌ０’個／ＷＲになるようにＨＡＴ培地（後述
）１１２＋（に懸濁し、２００　ｍ（１／　ｔｅｌ　ｌ
でマイクロプレート（ＮＵＮＣ社）にまき込んだ。

（培養）炭酸ガス培養装置にプレートを移し３７°Ｃ１５％炭酸
ガス濃度下で培養した。４日ごとにＨＡＴ培地を１／２
量新鮮なものに交換した。２週間後から培地をＩ−ＩＴ
培地（後述）に替え、さらにその１週間後からはＮ５−
１培地にした。

（スクリーニング）融合細胞が目的とするモノクローナル抗体を産生じてい
るかどうかをスクリーニングするのに前記の酵素免疫測
定法（ＥＩｊＳＡ）を用いて細胞培養上清中の抗体価を
測定したつ（クローニング）前記ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法により発色したｗｅｌｌの細胞を
限界希釈法によりクローニングした。これらのｗｅｌｌ
について免疫抗原に対する特異抗体活性、および抗体価
をＥＬＩＳＡ法により測定した。発色したｗｅｌｌの細
胞は大量培養を行った。この結果得られた融合細胞を１
ＡＤ９−２と名付けた。

（使用した試薬、培地の組成） ■ＰＢＳ　：ＮａＣＱ　　８．０ｇ１ＫＣ（２０，２ｇ
。

Ｎａ２ＨＰＯ＋’１２Ｈｔ０　２．９ｇ、ＫＨｔＰＯ４
０，２ｇを蒸留水１ｅに溶解。

■ＲＰＭＩ　　１６４０培地ＲＰＭＩ　　１６４０（ＧＩＩ３ＣＯ製）　　１０３．
９ｇ、　ＮａＨＣ０３２０ｇ　、ペニシリン　５００，
００００．ストレプトマイノン　５００，０００ｍｃｇ
を蒸留水１０Ｑに溶解。

■ＮＳ、１培地ＲＰＭＩ　　１６４０培地　９００ｍ＆にピルビン酸ナ
トリウム　０．１１ｇ、Ｌ−グルタミン　０．２９５ｇ
、Ｆｅ２　１００ｍｆ２を加えたもの。

■ＨＡ　Ｔ培地Ｎ５−１培地５００　ｍＱ　＋、：）ＩＡ’ｒ　５０倍
濃縮液（ベーリンガー・マンハイム社製）１０ｍ（！加
えたもの。

■ＨＴ培地：ＮＳ１培地５００ｍ（にＨＴ５０倍濃縮液
濃縮液リンガー・マンハイム社１）１０ｍ（ｌ加えたも
の。

■フュージョンバッファー（ｐＨ７，２）Ｔｒｉｓ　　
２４．２２ｍｇ、　　ＣａＣＱｖ・２Ｈ１０１４，７ｍ
ｇ１ＭｇＣ（Ｌ・６ＨｔＯ２０，３ｍｇ、　Ｇｌｕｃｏ
ｓｅ　　４５．０４ｇを蒸留水１りに溶解。

■ＢＳＡ溶液：ＰＢＳに１％ｈ／ｖ）のＢＳＡ（ＳＧＭ
Ａ社）と０．０２％（胃／Ｖ）のＮ　ａ　Ｎ　３を加え
たらの。

■洗浄液：ＰＢＳに０，１％（Ｖ／Ｖ　）のＴｗｅｅｎ
２０を加えたもの。

・■基質溶液：　０．０５Ｍクエン酸溶液２４．３ｍｇ
とＯ、］　ＭＮａ、ＨＰ　Ｏ４溶液２５．７ｍ１２を混
合し、０−フェニレンジアミン２０ｍｇ：を溶解しＨ７
Ｏ２液ＩＯμ夕を加えたもの。

・抑抗原溶夜：菌体をＰＢＳで洗浄後、可溶化剤により
３７℃、３０分間インキュベートにより溶菌し、ミリポ
アフィルタ−（０，４５μｍ）に通し除菌し、可溶化剤
、低分子物質を透析（約１０００倍容のＰＢＳに対し６
回）し除去したらの。

この１ＡＤ９−２は１ｇＭクラスの抗体を分泌する。こ
のモノクローナル抗体の反応特異性を確認するため、免
疫抗原に用いたアスペルギルス・ニドランス（八ｓｐｅ
ｒｇｉｌｌｕｓ　ｎ１ｄｕｌａｎｓ）以外の６１種の菌
株についてらＥＬ　Ｉ　ＳＡにより抗体との反応性を調
べた。その結果をつぎに示す。

菌名吸光度（１０−２）フミガトス（ＪＣＭ　１９１８）〃（〃１９１７）〃（〃１７３８）〃（〃１７３９）フラブス　（〃２０６１） ”　　　　（〃２２２５）ニガー　　（〃５５４６）オクラセウス（〃１９５８）オリザエ　（〃２２２６）テレウス　（〃２５９８）〃　　　　ニドランス（〃２７２ｇ）クリプトコツカス　ウニグツレイタス（〃〃（〃３６８
７）アミロレンタス（〃１６９０）カーバトス（〃１５３２）フミコラス（〃１４５７）ルテオラス（〃３１１＋８９）アルビカンス　　（）７１５４２）〃（〃１６２１）／／（〃２０７０）〃　　　　　　　　（）ｌ　　２０７１）ゲラブラタ　
　　（〃３６９９）ギリエルモンディ（ＩＦＯ０５６６）ケフィール　　　（〃０８８２）クルセル　　　　（〃００１１）バラブシロシス　（ＪＣＭ　１６１ｇ）メリニー　　　
　（〃２２７６）トロピカリス　　（ＩＦＯ０００６）ブルベウス（ＪＣＭ　３９００）フランス　　　　　（ＩＦｏ　９５６１）ヒエマリス　
　　　（）１８４４８）アバンダンス　　（ＩＦｏ　９３９８）〃　　　フラギ
リス　　　（〃９４０２）〃　　　ギリエルモンディ（
〃９４０３）〃　　ムセド　　　　　（〃７６８４）ノ
カルデイア　アステロイデス（ＪＣＭ　３００２）”　
　　　　　　　／／（〃３３８４）〃　オティティデス
カビアーム（〃３３７７）／／　　　　　ファーシニカ
（）１６０４５）ノカルデイオプシス　ゲラシナ（〃３
３３６）〃　　　　　ダスソンビレイ（〃３２３７）ペ
ニシリウム　シトリニウム　（ＩＦＯ４６３１）サツカ
ロマイセス　セレビシア（ＪＣＭ　１４９９）トリコフ
ィトン　メタグロフィ（ＩＦｏ　５４６６）スコピュラ
リオブシスブレビコリス（〃３８９３）トリコボロン　
クタネウム（７）１４６２）アクチノマイセス　ボヴイ
ス（ＮＩＡＩ（１００７）〃　　　　　　　イスラエリ
（／　１００ｇ）アクチノマヅラ　マヅラエ（ＪＣＭ　
　３０１３）リゾプス　デレマ（〃５５６４）〃　　　　チネンシス（〃５５５５）〃　　　シルシナンス（〃５５８６）〃　　　オリザエ　（〃５５５７）　　　　　　　　０
アブシデイア　シリンドロスポラ（〃５６０４）　　　
　０〃　　　　グルスカ（〃５６θ９）０〃　　　　コリンビヘラ（〃５６１７）　　　　　　０
〃〃（〃５６１８）０〃〃（〃５６１９）０〃　　　　スピンナ（〃５６２５）　　　　　　　　０
〃　　　　コエルレア（〃５５４５）　　　　　　　０
フイアロフオフオラ　ベルルコサ（ＩＦｏ　９３８９）
　　　　０ロドタルラ　ギルイチニス（’１１１２５）
　　　　　　　０その結果、この抗体は前記アスペルギ
ルス属の菌株１１種の全てと反応した。また、ペニシリ
ウム・シトリニウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃｉＬ
ｒｉｕｍ）、スコピュラリオプシス（Ｓｃｏｐｕｌａｒ
ｉｏｐｓｉｓ）とも反応することを示している。

また、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉ　ｌ　ｌｕｓ　
）の菌体をアセトン中で５分間処理し、ＰＢＳで洗浄し
たものを用い蛍光抗体試験を行った。この菌体にモノク
ローナル抗体を室温で３０分間反応させ、ＰＢＳで洗浄
、その後Ｆ’ＩＴＣ標識した抗マウス抗体を反応させＰ
ＢＳで洗浄し、蛍光顕微鏡で観察したところ菌体の蛍光
の発光が見られた。なお、ネガティブコントロールとし
た菌体の発光は見られなかった。この結果、このモノク
ローナル抗体が実際に菌体と反応するすることが確認で
きた。

［発明の効果］本発明のハイブリドーマはアスペルギルス属の菌に由来
する特定の抗原に特異的に反応するモノクローナル抗体
を産生ずるっ本発明のモノクローナル抗体に酵素、蛍光
試薬等の標識を行うことによってアスペルギルス（Ａｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）感染の検査、診断の試薬として＋
ｔｌ用できる。

また、このモノクローナル抗体を担体に固定化すること
により免疫原の部分精製にも利用できる。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の
少なくとも１１株由来の抗原と複合体を形成するモノク
ローナル抗体。
（２）アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の
少なくとも１１株由来の抗原と複合体を形成するモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマ。