KR20210112507A - 한국형 낭충봉아부패병 바이러스에 특이적으로 결합하는 단클론항체 및 이의용도 - Google Patents

한국형 낭충봉아부패병 바이러스에 특이적으로 결합하는 단클론항체 및 이의용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 한국형 낭충봉아부패병 바이러스의 구조 단백질인 VP1(KSBV-VP1)에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것으로, 더 자세하게는 한국형 낭충봉아부패병 바이러스에 특이적으로 결합하는 항체, 이를 포함하는 한국형 낭충봉아부패병 바이러스 감염 진단용 조성물, 이를 포함하는 한국형 낭충봉아부패병 바이러 진단 키트 및 한국형 낭충봉아부패병을 진단하는 하는 방법에 관한 것이다.

Description

한국형 낭충봉아부패병 바이러스에 특이적으로 결합하는 단클론항체 및 이의용도 {Monoclonal antibody against korean sacbrood virus and use thereof}
본 발명은 한국형 낭충봉아부패병 바이러스의 구조 단백질인 VP1(KSBV-VP1)에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것으로, 더 자세하게는 한국형 낭충봉아부패병 바이러스에 특이적으로 결합하는 단클론항체, 이를 포함하는 한국형 낭충봉아부패병 바이러스 감염 진단용 조성물, 이를 포함하는 한국형 낭충봉아부패병 바이러스 감염 진단용 키트 및 한국형 낭충봉아부패병 바이러스 감염을 진단하는 하는 방법에 관한 것이다.
낭충봉아부패병 바이러스(Sacbrood virus, SBV)는 1913년에 처음 보고되었으며, 꿀벌 유충에 질병을 야기하는 심각한 바이러스 중 하나로, 단일가닥 RNA(single stranded RNA, ssRNA)를 가진 피코로나바이러스(picoronavirus)이다. 낭충봉아부패병 바이러스는 꿀벌 유충에서 발병되며, 감염된 유충의 증상은 주머니(Sac)를 형성하며, 노란색에서 검은 갈색으로 점차 부패되면서 번데기로 변태되지 못하고 죽게 된다.
일반적으로 서양종 꿀벌(Apis mellifera)에서 검출되면 발견 지역에 관계없이 낭충봉아부패병 바이러스라 통칭하나, 동양종 꿀벌(Apis cerana)에서 검출된 낭충봉아부패병 바이러스는 지역에 따라 염기서열 차이를 보이기 때문에 검출된 지역에 따른 명명을 사용하여 중국에서 보고된 것은 중국형 낭충봉아부패병 바이러스(Chinese sacbrood virus, CSBV)라 불리며, 한국산 꿀벌에서 검출된 것은 한국형 낭충봉아부패병 바이러스(Korean sacbrood virus, KSBV)로 명명되었다.
한국형 낭충봉아부패병 바이러스는 2008년 국내에서 처음 발견된, 낭충봉아부패병 바이러스에 속하는 특정한 변형 바이러스이다. 이들은 국내 침입 이후 국내 토종벌에 집중적으로 막심한 피해를 주어 왔으며, 상대적으로 국내 서양종 꿀벌에는 큰 피해를 주지 않아, 강한 숙주 특이성을 보인다. 국내 토봉의 총 봉군수는 2009년 38만군이상으로 집계되었으나, 2016년 조사에서는 1만 봉군을 약간 넘는 것으로 나타나, 한국형 낭충봉아부패병 바이러스 발생 이래, 국내의 99% 이상 토종벌이 사라졌음을 보여주고 있다.
낭충봉아부패병 바이러스에 대한 치료법으로 그 효능이 입증된 것은 없으며, 꿀벌에서 낭충봉아부패병 바이러스의 빠른 검출 및 진단을 통해 감염을 인지하고, 감염체로부터 감염되지 않은 꿀벌을 격리시키는 것이 유력한 대처 방법이다. 그러나 꿀벌 양식은 대부분 소규모로 사육되고 전국에 산재해 있다는 점을 감안했을 때 적극적인 대응이 힘들다. 따라서 낭충봉아부패병 바이러스 감염 여부를 현장에서 신속하게 진단할 수 있는 진단법의 개발이 필요한 실정이다.
꿀벌에서 병원체를 검출해 내는 방법 중 병원체 유전자 검사법이 주를 이루고 있다. 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 검사법은 가장 민감하고 특이성을 가진 방법으로 알려져 있으며, 실시간 PCR(real-time PCR)은 정량적, 정성적 분석이 가능하여 보다 널리 사용되고 있다(Min S.H., et al., 2016). 예를 들어, 한국공개특허번호 제2014-0005458호, 제2014-0081368호, 제2017-0060703호 및 제2017-0025453호에는 낭충봉아부패병 바이러스 감염 진단용 조성물이 기재되어 있으나, 낭충봉아부패병 바이러스 진단용 프라이머 세트를 이용한 유전자 진단으로, 본 발명의 한국형 낭충봉아부패병 바이러스에 다한 항체를 포함하는 면역 진단용 조성물과는 그 구성이 차이가 있다. 또한, 한국공개특허번호 제2016-0142618호에는 낭충봉아부패병 바이러스 진단용 조성물이 기재되어 있으나, 낭충봉아부패병 바이러스에 특이적인 프로브를 이용한 조직 내 교잡법을 통한 진단 방법으로, 본 발명의 항체를 포함하는 면역 진단 방법과는 그 구성이 차이가 있고, 상기와 같이 유전자 검사를 위해서는 유전자의 추출, 유전자의 증폭 및 전기영동을 이용한 결과 확인과 같은 절차 및 장비가 요구되고 있어, 현장에서의 즉각적인 진단 적용이 어렵다.
이에, 본 발명자들은 한국형 낭충봉아부패병 바이러스의 현장 진단용 키트를 개발하는 과정에서, 한국형 낭충봉아부패병 바이러스 단백질에 대응하는 항체를 확보하였고, 확보한 항체가 낭충봉아부패병 바이러스 단백질과 특이적으로 결합하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기의 서술한 문제를 해결하기 위해, 본 발명자들은 한국형 낭충봉아부패병 바이러스의 구조 단백질인 VP1(KSBV-VP1) 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 수탁번호 KCLRF-BP-00475의 하이브리도마에 의하여 생산되는 한국형 낭충봉아부패병 바이러스의 구조 단백질인 VP1(KSBV-VP1)에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 수탁번호 KCLRF-BP-00475의 하이브리도마에 의하여 생산되는 한국형 낭충봉아부패병 바이러스의 구조 단백질인 VP1(KSBV-VP1)에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 포함하는 한국형 낭충봉아부패병 바이러스 감염 진단용 조성물 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 서술한 한국형 낭충봉아부패병 진단용 조성물을 포함하는 한국형 낭충봉아부패병 바이러스 감염 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 서술한 한국형 낭충봉아부패병에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 한국형 낭충봉아부패병 바이러스 감염을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 한국형 낭충봉아부패병 바이러스의 구조 단백질인 VP1(KSBV-VP1)에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 생산하는 수탁번호 KCLRF-BP-00475으로 기탁된 하이브리도마 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명은 수탁번호 KCLRF-BP-00475의 하이브리도마에 의하여 생산되는 한국형 낭충봉아부패병 바이러스의 구조 단백질인 VP1(KSBV-VP1)에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 제공할 수 있다.
상기 한국형 낭충봉아부패병 바이러스는 낭충봉아부패병 바이러스에 속하는 변형 바이러스로, 국내 토종벌에 대해 강한 숙주 특이성을 보여 국내 토종벌에 막심한 피해를 주고 있으나, 이에 대한 치료법이 없는 관계로, 한국형 낭충봉아부패병 바이러스의 빠른 검출 및 진단을 통한 감염 확산을 막는 것이 강력한 대처 방법 중에 하나이다. 상기 KSBV-VP1 단백질은 한국형 낭충봉아부패병 바이러스의 구조 단백질 중 하나로, 한국형 낭충봉아부패병 바이러스에 감염된 숙주 내에서 상기 KSBV-VP1 단백질이 합성된다. 따라서 숙주 내에 존재하는 KSBV-VP1 단백질을 검출함으로써 한국형 낭충봉아부패병 바이러스의 감염 여부를 확인할 수 있다.
본 발명자들은 SBV의 구조 단백질인 VP1을 암호화 하고 있는 유전자가 삽입된 KSBV-VP1 단백질 발현용 벡터를 제작하였다. 상기 KSBV-VP1 단백질 발현 벡터를 대장균에 형질 전환한 뒤, 대장균을 배양하고 용해 후 분리한 결과 상층액(수용성 형태)에서는 KSBV-VP1 단백질이 전혀 발현되지 않지만, 침전물(불용성 형태 에서는 KSBV-VP1 단백질이 발현되는 것을 확인하였다 (도 1). 상기 불용성 상태로 발현된 KSBV-VP1 단백질이 포함된 침전물을 8M 우레아로 이루어진 변성 완충용액(denaturation buffer)로 단백질 변성시킨 후, 6M 구아니딘 하이드로클로라이드(guanidine hydrochloride) 및 0.2M 아세트산(acetic acid)이 포함된 재접힘 완충용액(refolding buffer)을 처리하여 단백질을 재접힘 시켜 수용성(soluble) 상태의 단백질로 변화시켰다. 수용성 단백질로 변환된 KSBV-VP1 단백질을 니켈 컬럼(Ni-NTA resin, QIAgen사, USA)에 가하여 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 KSBV-VP1 단백질을 정제하였다 (도 2). 상기 KSBV-VP1 단백질을 마우스 복강에 주사하여 항체가 생성되도록 하였다. 상기 마우스의 혈청을 이용하여 웨스턴 블랏을 진행한 결과 KSBV-VP1에 대한 항혈청이 항원인 KSBV-VP1 단백질을 정상적으로 탐지하는 것을 확인하였다 (도 3 및 4). 항-KSBV-VP1 단클론 항체를 제작하기 위해 골수종 세포(myeloma cell)인 SP2/0-Ag14 세포를 이용하여 하이브리도마(hybridoma)를 제조하였다. 상기 KSBV-VP1 단백질을 복강에 주사한 마우스를 희생하여 비장을 적출한 뒤 비장 세포를 확보하였다. 상기의 SP2/0-Ag14 세포와 비장 세포를 혼합하여 세포 융합(fusion)이 일어나도록 하였다. 세포 융합된 세포를 배양한 뒤, 항-KSBV-VP1 단클론 항체를 생성하는 콜로니만을 선별하기 위해, 4일 동안 배양한 배양액을 이용하여 웨스턴 블롯을 통해 항-KSBV-VP1 단클론 항체를 생성하는 콜로니(하이브리도마; 수탁번호 KCLRF-BP-00475)를 선별하였다. 그러나 선별된 하이브리도마의 배양액을 1차 항체로 처리하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과, KSBV-VP1 단백질 탐지 능력이 낮은 것을 확인하였고, 이를 통해, 배양액 내의 단클론 항체의 농도가 낮다는 것을 알 수 있었다. 따라서 단클론 항체의 대량 생산을 위해 상기에서 선별된 하이브리도마를 마우스에 복강 주사하고 10일 후에 복수를 채취하였다. 채취한 복수를 A 단백질 항체 정제 키트(Protein A Antibody Purification kit, Proteus사)에 가하여 항-KSBV-VP1 단클론 항체를 분리, 정제하였다. 상기 분리, 정제된 항-KSBV-VP1 단클론 항체가 KSBV-VP1 단백질을 특이적으로 탐지하는지 확인하기 위해, 웨스턴 블롯을 수행하였다. 그 결과 항-KSBV-VP1 단클론 항체가 항원인 KSBV-VP1 단백질을 정상적으로 탐지하는 것을 확인하였다 (도 5).
상기 한국형 낭충봉아부패병 바이러스의 구조 단백질인 VP1(KSBV-VP1)에 특이적으로 결합하는 항체는 항-KSBV-VP1일 수 있다.
상기 한국형 낭충봉아부패병 바이러스에 특이적으로 결합하는 항체는 서열번호 1의 아미노산으로 서열로 이루어진 한국형 낭충봉아부패병 바이러스의 구조 단백질인 VP1(KSBV-VP1)을 인식할 수 있다.
상기 서열번호 1은 “dilrrpvllf nhvvldpayt gffipimpps rmmqyksgdr etsfqrligr tpqaaimnlf rfwrgslryt iiihstdghp iyvthvphtg nrvyglmkvn nlheytkvpi fgcglttemi ipsvnpsicv evpfdtennw avtfeedaqr nyswrdkgdt vtghlvvtpv vpvnmsvwve agddfevsnf ygp”을 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 수탁번호 KCLRF-BP-00475의 하이브리도마에 의하여 생산되는 한국형 낭충봉아부패병 바이러스의 구조 단백질인 VP1(KSBV-VP1)에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 포함하는 한국형 낭충봉아부패병 바이러스 감염 진단용 조성물을 제공할 수 있다.
상기 항-KSBV-VP1 항체를 포함하는 한국형 낭충봉아부패병 바이러스 감염 진단용 조성물은 항원-항체 반응을 통해 숙주 내 KSBV-VP1 단백질을 검출함으로써 한국형 낭충봉아부패병 바이러스 감염을 진단할 수 있다.
상기 “항체”는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 바람직하게는 상기 항체는 KSBV-VP1 단백질 또는 이의 면역원성 단편에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 단클론 항체(monoclonal antibody, mAb), 다클론 항체(polyclonal antibody, pAb) 및 재조합 항체를 모두 포함할 수 있다. 바람직하게는 단클론 항체 및 다클론 항체에서 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 가장 바람직하게는 단클론일 수 있다.
상기 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 상기 다클론 항체는 KSBV-VP1 단백질 또는 이의 면역원성 단편(항원)을 동물에 주사한 뒤 채혈한 혈청에서 얻을 수 있다. 상기 동물로는 염소, 토끼, 돼지, 양 등 임의의 동물 숙주를 이용할 수 있다. 상기 단클론 항체는, 본 발명이 속하는 기술 분야에 널리 알려진 대로, 하이브리도마 방법(Kohler, G. et al., 1976), 또는, 파지 항체 라이브러리(Clackson, T. et al., 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 하이브리도마 방법을 수행하기 위해서는 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주동물의 세포와 암 또는 골수종 세포주를 이용할 수 있다. 이후 폴리에틸렌글라이콜 등을 이용하는 방법, 즉, 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 공지된 방법으로, 이러한 두 종류의 세포들을 융합시킨 후, 항체 생산 세포를 표준적인 조직 배양 방법으로 증식시킬 수 있다. 이후 한계 희석법(limited dilution technique)에 의한 서브클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 얻은 후, 본 발명의 KSBV-VP1 단백질에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 표준 기술에 따라 시험관 내 또는 생체 내에서 대량 배양할 수 있다. 상기 파지 항체 라이브러리 방법은, 본 발명의 KSBV-VP1 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 특이적으로 인식하는 항체 유전자를 획득하여, 이를 파지(phage)의 표면에 융합 단백질 형태로 발현하여 항체 라이브러리를 시험관 내에서 제작하고, 상기 라이브러리로부터 본 발명의 KSBV-VP1 단백질 또는 이의 면역원성 단편과 결합하는 단클론 항체를 분리 및 제작하여 수행할 수 있다. 상기 방법들에 의하여 제조된 항체는 전기영동, 투석, 이온교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 등의 방법으로 분리할 수 있다.
상기 항체는 2개의 전체 길이 경쇄(light chain) 및 2개의 전체 길이 중쇄(heavy chain)를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, F(ab)2, Fv 등이 있다.
상기 항-KSBV-VP1 항체를 포함하는 한국형 낭충봉아부패병 바이러스 감염 진단용 조성물에는 항체 대신에 KSBV-VP1 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 압타머(aptamer), 펩타이드(peptide) 등을 포함할 수 있다.
상기 “압타머”란, 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 특별한 종류의 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형 핵산)으로 구성된 폴리뉴클레오티드의 일종으로, 압타머는 항체와 동일하게 항원성 물질에 특이적으로 결합할 수 있으면서도, 단백질보다 안정성이 높고, 구조가 간단하며, 합성이 용이한 폴리뉴클레오티드로 구성되어 있으므로, 항체를 대체하여 사용될 수 있다.
상기 “펩타이드”는 표적 물질에 대한 결합력 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다. 구체적으로 고분자 단백질 체인에 붙여서 이용이 가능하므로 진단 키트 및 약물전달 물질로 이용될 수 있다.
상기 항-KSBV-VP1 항체를 포함하는 한국형 낭충봉아부패병 바이러스 감염 진단용 조성물의 항체는 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 KSBV-VP1 단백질을 인식하는 항-KSBV-VP1 항체일 수 있다.
상기 항-KSBV-VP1 항체를 포함하는 한국형 낭충봉아부패병 바이러스 감염 진단용 조성물에는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기재, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기재로는 니트로셀룰로오스 멤브레인, 폴리비닐 수지로 합성된 96-웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96-웰 플레이트, 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소로는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있다. 또한, 형광물질로는 FITC, RITC, Cy3, Cy5 등이 사용될 수 있고, 발색기질로는 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)), OPD(o-페닐렌디아님), TMB(테트라메틸 벤지딘), 금 입자(cold particle) 등이 사용될 수 있다.
상기 항원-항체 반응은 웨스턴 블롯(western blot), 면역조직화학염색법(immunohistochemial stain), 방사선면역분석(radioimmunoassay), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 면역침전 분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 단백질 칩(protein chip) 및 면역크로마토그래피(immuno-chromatography) 등으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 확인할 수 있다. 바람직하게는 면역크로마토그래피이다.
본 발명은 또한, 상기 한국형 낭충봉아부패병 바이러스 감염 진단용 조성물을 포함하는 한국형 낭충봉아부패병 바이러스 감염 진단 키트를 제공할 수 있다.
상기 한국형 낭충봉아부패병 바이러스 감염 진단 키트는, 시료를 주입하는 시료 주입부; 상기 시료 주입부로부터 일정 간격이 이격된 지점에 위치하는 금 입자가 결합한 항-KSBV-VP1 항체가 함유된 결합 패드; 상기 결합 패드로부터 일정 간격이 이격된 위치에 항-KSBV-VP1 항체가 고정된 테스트 라인; 및 항-마우스 IgG가 고정된 대조군 라인; 이 순차적으로 구비되어 있는 것일 수 있다.
상기 감염 진단 키트에서 항-KSBV-VP1 항체는 항-KSBV-VP1 다클론 항체 또는 단클론 항체에서 선택되는 1종 일 수 있고, 바람직하게는 단클론 항체 일 수 있다.
상기 감염 진단 키드에서 결합 패드의 항-KSBV-VP1 항체를 다클론 항체를 사용하고, 테스트 라인에 고정된 항-KSBV-VP1 항체는 단클론 항체로 사용될 수 있다.
상기 한국형 낭충봉아부패병 바이러스 감염 진단 키트를 이용하면, 벌 유충의 균질액을 진단 키트의 시료 주입부에 넣고 10분 이내에 현장에서 신속하게 한국형 낭충봉아부패병 바이러스 감염 여부를 확인할 수 있다.
본 발명은 또한 하기의 단계를 포함하는 한국형 낭충봉아부패병을 진단하는 방법을 제공할 수 있다.
(a) 벌로부터 분리된 생물학적 시료를 수집하는 단계;
(b) 상기 생물학적 시료와 상기 서술한 항체를 접촉시키는 단계; 및
(c) 상기 항체와 생물학적 시료의 반응을 검출하는 단계.
상기 반응이 효소적 색상 분석, 형광 분석 또는 화학발광 분석에 의해 검출될 수 있다.
상기 벌은 유충 또는 성충일 수 있다.
본 발명은 또한 한국형 낭충봉아부패병 바이러스의 구조 단백질인 VP1(KSBV-VP1)에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 생산하는 수탁번호 KCLRF-BP-00475으로 기탁된 하이브리도마 세포주를 제공할 수 있다.
본 발명은 한국형 낭충봉아부패병 바이러스(Korean Sacbrood virus, KSBV)에 특이적으로 결합하는 항체 및 이를 이용한 한국형 낭충봉아부패병 진단용 조성물은 한국형 낭충봉아부패병 바이러스에 특이적으로 결합하여, 현장에서 신속하게 한국형 낭충봉아부패병 바이러스 감염 여부를 진단할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 한국형 낭충봉아부패병 바이러스-VP1(KSBV-VP1) 단백질 발현용 벡터가 형질전환 된 대장균으로부터 발현을 유도시킨 단백질의 발현 형태를 확인한 것으로, (A)는 대장균 용해 후 분리한 상층액 내의 수용성 단백질 형태(soluble form)로의 발현 여부를, (B)는 대장균 용해 후 분리한 침전물 내의 불용성 단백질 형태(insoluble form)로의 발현 여부를 확인한 결과이다.
도 2는 불용성 단백질 형태로 발현되는 KSBV-VP1 단백질의 수용성 형태로의 전환 여부 및 수용성 형태로 전환된 각 단백질의 니켈 컬럼을 이용한 단백질 정제 여부를 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 3은 본 발명에서 제조한 KSBV-VP1 항혈청의 KSBV-VP1 단백질 탐지 여부를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 4는 본 발명에서 제조한 항-KSBV-VP1 다클론 항체의 KSBV-VP1 단백질 탐지 여부를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 5는 본 발명에서 제조한 항-KSBV-VP1 단클론 항체의 KSBV-VP1 단백질 탐지 여부를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 보여주고 있다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
<실시예 1. 한국형 낭충봉아부패 바이러스 구조단백질 발현 및 정제>
1-1. 한국형 낭충봉아부패 바이러스(KSBV) 구조단백질 발현용 벡터 및 균주 제조
한국형 낭충봉아부패 바이러스(KSBV)에 특이적인 항체를 제조하기 위해 KSBV의 구조단백질인 VP1(KSBV-VP1) 단백질을 항원으로 이용하고자, KSBV-VP1 단백질 발현용 벡터를 제작하였다. 미국국립생물정보센터(NCBI; www.ncbi.nlm.nih.gov)로부터 KSBV의 VP1 염기서열을 확보하였고, 확보한 염기서열을 바탕으로 ㈜바이오니아에 의뢰하여 KSBV-V2 단백질 발현용 벡터 제작을 위한 프라이머(primer)를 디자인하고, 하기 표 1의 프라이머를 합성하였다. 또한, KSBV의 바이러스 RNA를 주형으로 역전사 PCR(reverse trascription polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA를 주형으로, 하기 표 1의 프라이머 및 제넷바이오사의 SuPrime HF DNA polymerase를 이용하여 98℃에서 2분간 변성시킨 후, 98 ℃에서 30초, 58℃에서 30초, 68℃에서 2분간 처리하는 것을 35회 반복한 후, 68 ℃에서 5분 동안 처리하는 조건으로 PCR을 수행하여 KSBV-VP1 유전자를 확보하였다.
타겟유전자 프라이머 명 염기서열 증폭 크기(bp)
KSBV-VP1 VP1-F 5’-TCGCGGATCCGAATTCTGGATGCCTATAAATTCAATTAAGGTACA-3’ 528
VP1-R 5’-TC5’-CCGCAAGCTTGTCGACGACTTTGTACGACATTCCCGCAAAT-3’
PCR을 통해 확보한 KSBV-VP1 유전자와 벡터(vector)로 사용한 히스티딘 태그(6×)가 포함된 pET-28a 벡터(Novagen, Germany)를 EcoRⅠ과 SalⅠ으로 절단하고, 절단된 DNA를 정제한 후, Takara 사(Japan)의 Infusion Cloning kit를 이용하여 단백질 발현용 벡터를 구축하였다. 구축한 벡터를 BL21DE3 대장균에 형질전환 시킨 후, 50㎍/㎖의 카나마이신(kanamycin)이 포함된 LB(Luria-Bertani) 고체배지에 도말하여 콜로니가 생성되도록 하였다. 생성된 콜로니를 선발하여 카나마이신이 포함된 액체 배지에 접종하여 배양하고, 플라스미드 DNA 정제 키트(Plus Plasmid Mini Kit, NucleoGen사, Korea)를 이용하여 배양된 대장균 내 플라스미드 DNA를 정제하였다. 정제한 플라스미드 DNA 내에 KSBV-VP1 유전자가 제대로 삽입되었는지 확인하기 위해, 상기 표 1의 프라이머를 이용하여 클로닝시 이용한 PCR 조건으로 PCR을 수행하여 각 구조 단백질의 유전자에 해당하는 유전자 밴드를 확인하였고, 상기 EcoRⅠ과 SalⅠ제한효소를 처리하여 각 구조 단백질의 유전자와 벡터의 밴드가 나타나는 것을 확인하였다. 구축한 KSBV-VP1 단백질 발현용 벡터를 각각 pET-KSBV-VP1 라고 명명하였다.
1-2. 한국형 낭충봉아부패 바이러스(KSBV) 구조단백질 발현 및 정제
한국형 낭충봉아부패 바이러스 감염 진단시 이용할 항체를 제작하기 위해 항원으로 사용할 KSBV-VP1 단백질을 분리하였다. 상기 실시예 1-1에서 제조한 pET-KSBV-VP1이 형질전환 되어 있는 대장균을 50㎍/㎖의 가나마이신이 포함된 LB 액체 배지에 600㎚에서 흡광도(OD600)가 0.6이 될 때까지 배양하였다. OD600이 0.6이 되면 배양액에 IPTG(isoprophy-β-D-thio-galactoside)를 최종 농도가 1mM이 되도록 첨가하고 37℃에서 4시간 동안 교반하면서 배양하였다. 배양액을 원심 분리하여 대장균을 수확하였으며, 수확한 대장균을 용해 완충용액(lysis buffer)(10mM imidazole, 300mM NaCl, 50mM NaH2PO4, pH8.0) 으로 현탁하고, 1회당 60초씩, 4회의 초음파 처리를 하여 대장균을 용해시킨 후, 원심분리하여 상층액과 침전물로 분리하였다. 분리한 상층액과 침전물을 각각 인산완충용액(phosphate buffered saline, PBS, pH7.4)으로 녹인 후, SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 수행하여 KSBV-VP1 단백질 발현 여부를 확인하였고, 그 결과를 하기 도 1에 나타내었다. 도 1에서 보여주듯이, KSBV-VP1(24.86kDa) 단백질이 대장균 용해 후 분리한 상층액과 침전물 중, (A) 상층액(단백질이 수용성 형태(soluble form)로 존재)에서는 전혀 발현이 되지 않는 반면에 (B) 침전물(단백질이 불용성 형태(insoluble form) 으로 존재)에서 대량으로 발현되는 것을 확인함으로써, 상기 실시예 1-1에서 제조한 pET-KSBV-VP1이 형질전환 되어 있는 대장균으로부터 KSBV-VP1 단백질이 불용성 상태로 발현된다는 것을 확인하였다. 상기 불용성 상태로 발현된 KSBV-VP1 단백질이 포함된 침전물을 8M 우레아로 이루어진 변성 완충용액(denaturation buffer)로 단백질 변성 시킨 후, 6M 구아니딘 하이드로클로라이드(guanidine hydrochloride) 및 0.2M 아세트산(acetic acid)가 포함된 재접힘 완충용액(refolding buffer)을 처리하여 단백질을 재접힘 시켜 수용성(soluble) 상태의 단백질로 변화시켰다. 수용성 단백질로 변환된 KSBV-VP1 단백질을 니켈 컬럼(Ni-NTA resin, QIAgen사, USA)에 가하여 KSBV-VP1 단백질을 정제하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 보여주듯이, KSBV-VP1 단백질의 경우, 단백질 변성 및 재접힘 처리를 통해 수용성 상태의 단백질로 변환되었으며(1 및 2 레인), 니켈 컬럼을 통과한 세척액에는 각각의 KSBV-VP1 단백질이 거의 없는 반면에(3 및 4레인), 니켈 컬럼을 통과한 용출액에는 각각의 단백질만이 포함되어 있음을 확인하였다(5 및 6레인). 이를 통해, 본 발명의 KSBV-VP1 단백질을 대량 생산할 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 2. 한국형 낭충봉아부패 바이러스 진단용 항체 제조>
KSBV에 특이적인 항체를 제조하기 위해 상기 실시예 1-2에서 발현 및 정제한 KSBV-VP1 단백질을 항원으로 하여 각각의 단백질에 대한 다클론 항체(polyclonal antibody, pAb) 또는 단클론 항체(monoclonal antibody, mAb)를 제작하였다.
2-1. KSBV-VP1 단백질에 대한 다클론 항체 제작
6주령의 BALB/c 수컷 마우스에 상기 실시예 1-2에서 정제한 KSBV-VP1 단백질을 각각 2주 간격으로 3회 복강 주사하여 각 단백질에 대항하는 항체가 생성되도록 하였다. 이때, 단백질(항원) 1차 및 2차 주입 시, KSBV-VP1 단백질 100㎍을 콤플리트 아주반트(complete adjuvant)와 혼합하여 함께 주입하였고, 3차 주입 시 KSBV-VP1 단백질 50㎍만을 주입하였으며, 단백질 주입 2주 후에 마우스로부터 혈액을 채취하여 항혈청을 확보하였다. 2, 3주차의 항혈청은 채혈을 통해 확보하였고, 6주 차의 항혈청은 전혈을 통해 확보하였다. 상기 항체 제작 과정을 통해 KSBV-VP1 단백질에 대한 항혈청이 정상적으로 생산되었는지 확인하기 위해 웨스턴 블롯(Western blot)을 수행하였다. 상기 실시예 1-2에서 정제한 KSBV-VP1 단백질을 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625㎍이 되도록 준비한 후 SDS-PAGE를 수행하고 PVDF 멤브레인으로 단백질을 옮겼다. 멤브레인을 5% 탈지 우유(nonfat milk)로 블로킹시킨 다음, 상기에서 확보한 항혈청을 일차항체로 처리한 후, 포스파타아제가 결합되어 있는 항-마우스 IgG(anti-mouse phosphatase conjugate IgG, Sigma사, USA)를 처리하여 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 이후, NBT/BCIP가 함유된 발색완충액(100mM Tris, 100mM NaCl, 5mM MgCl2, pH9.5)을 처리하여 상기에서 확보한 항혈청이 KSBV-VP1 단백질을 인식하는지를 확인하였고, 그 결과를 도 3에서 나타내었다. 도 3에서 보여주듯이, 상기의 항혈청 중 4주 차의 항혈청(2차 단백질 주입 후 채혈)을 처리한 결과, KSBV-VP1에 대한 항혈청이 항원인 KSBV-VP1 단백질을 정상적으로 탐지하는 것을 확인하였다. 상기에서 KSBV-VP1 단백질에 대한 항혈청이 제대로 생성된 것을 확인한 후에, 6주차의 항혈청을 G 단백질 항체 정제 키트(Protein G Antibody Purification kit, Proteus사)에 가하여 항-KSBV-VP1 다클론 항체를 분리, 정제하였다. 분리, 정제된 항-KSBV-VP1 다클론 항체가 KSBV-VP1 단백질을 특이적으로 탐지하는지 확인하기 위해, 상기와 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 이때, 실시예 1-2에서 정제한 KSBV-VP1 단백질 5㎍을 이용하였다. 도 4에서 보여주듯이, 분리, 정제된 항-KSBV-VP1 다클론 항체가 항원인 KSBV-VP1 단백질을 정상적으로 탐지하는 것을 확인하였다. 이를 통해, 본 발명의 KSBV-VP1 단백질과 특이적으로 결합하는 다클론 항체가 제대로 생성되었음을 알 수 있었다.
2-2. KSBV-VP1 단백질에 대한 단클론 항체 제작
항-KSBV-VP1 단클론 항체를 제작하기 위해 하이브리도마(hybridoma)를 제조하였다. 하이브리도마를 제조하기 위해 골수종 세포(myeloma cell)인 SP2/0-Ag14 세포를 ATCC에서 분양받았고, E 배지(DMEM에 pre-selected serum, HAT, gentamycin, supplements 포함)를 이용하여 배양하였다. 배양한 SP2/0-Ag14 세포를 원심 분리하고, 25㎖의 B 배지(DMEM에 gentamycin 포함)로 현탁 하였다. 상기 실시예 2-1의 6주차의 마우스로부터 혈액을 채취하고 난 후, 마우스를 희생시키고 비장을 적출하였다. 적출한 비장을 메쉬 스크린(mesh screen)에 올려둔 뒤 5㎖의 B 배지를 첨가하고 주사기를 이용하여 비장을 균질화한 후, 30㎖의 B 배지를 첨가하여 1100rpm에서 10분간 원심 분리하여 비장 세포를 확보하였다. 확보한 비장 세포를 25㎖의 B 배지로 현탁하였다. 상기의 현탁한 SP2/0-Ag14 세포 2X107개와 비장 세포 1X105개를 혼합하고, 원심분리한 후, 상층액을 제거하여 침전된 세포를 분리하였다. 분리한 세포를 풀어주고 여기에 500㎕의 PEG를 첨가하고, 원심 분리하여 세포를 침전시킨 후 상등액을 제거하였다. 침전된 세포에 5㎖ B 배지와 5㎖ C 배지(DMEM에 pre-selected serum, gentamycin, supplements 포함)를 넣고 현탁한 후, 세포 배양용 배양 접시에 넣고 10㎖의 C 배지를 추가하고 37℃, 5% CO2 조건으로 24시간 배양하여 세포 융합(fusion)이 일어나도록 하였다. 24시간 배양한 세포를 모은 뒤 1100rpm으로 10분간 원심 분리하여 세포를 분리하였다. 분리한 세포를 C 배지 10㎖로 현탁하고 30㎖의 D 배지(DMEM에 methylcellulose, pre-selected serum, HAT, gentamycin, supplements 포함)를 추가한 후 실온에서 15분간 교반하였다. 이 중, 9.5㎖를 취하여 배양 접시로 옮기고 37℃, 5% CO2 조건에서 14일 동안 배양하였다. 200㎕의 E 배지가 들어 있는 96웰 플레이트에 14일간 배양된 세포로부터 콜로니를 분리하여 분주하고 37℃, 5% CO2 조건에서 4일 동안 배양하였다. 상기 콜로니 중, 항-KSBV-VP1 단클론 항체를 생성하는 콜로니만을 선별하기 위해, 4일 동안 배양한 배양액을 이용하여 웨스턴 블롯을 통해 항-KSBV-VP1 단클론 항체를 생성하는 콜로니(하이브리도마; 수탁번호 KCLRF-BP-00475)를 선별하였다. 그러나 선별된 하이브리도마의 배양액을 1차 항체로 처리하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과, KSBV-VP1 단백질 탐지 능력이 낮은 것을 확인하였고, 이를 통해, 배양액 내의 단클론 항체의 농도가 낮다는 것을 알 수 있었다. 따라서 단클론 항체의 대량 생산을 위해 상기에서 선별된 하이브리도마를 마우스에 복강 주사하고 10일 후에 복수를 채취하였다. 채취한 복수를 A 단백질 항체 정제 키트(Protein A Antibody Purification kit, Proteus사)에 가하여 항-KSBV-VP1 단클론 항체를 분리, 정제하였다. 상기 분리, 정제된 항-KSBV-VP1 단클론 항체가 KSBV-VP1 단백질을 특이적으로 탐지하는지 확인하기 위해, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 이때, 실시예 1-2에서 정제한 KSBV-VP1 단백질 5㎍을 이용하였다. 도 5에서 보여주듯이, 항-KSBV-VP1 단클론 항체가 항원인 KSBV-VP1 단백질을 정상적으로 탐지하는 것을 확인하였다. 이를 통해, 본 발명의 KSBV-VP1 단백질과 특이적으로 결합하는 단클론 항체가 제대로 생성되었음을 알 수 있었다.
[미생물 기탁]
기탁기관명 : 한국세포주연구재단
수탁번호 : KCLRFBP00475
수탁일자 : 20191224
<110> PAICHAI UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Monoclonal antibody against korean sacbrood virus and use thereof <130> 1064549 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 193 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of KSBV-VP1 <400> 1 Asp Ile Leu Arg Arg Pro Val Leu Leu Phe Asn His Val Val Leu Asp 1 5 10 15 Pro Ala Tyr Thr Gly Phe Phe Ile Pro Ile Met Pro Pro Ser Arg Met 20 25 30 Met Gln Tyr Lys Ser Gly Asp Arg Glu Thr Ser Phe Gln Arg Leu Ile 35 40 45 Gly Arg Thr Pro Gln Ala Ala Ile Met Asn Leu Phe Arg Phe Trp Arg 50 55 60 Gly Ser Leu Arg Tyr Thr Ile Ile Ile His Ser Thr Asp Gly His Pro 65 70 75 80 Ile Tyr Val Thr His Val Pro His Thr Gly Asn Arg Val Tyr Gly Leu 85 90 95 Met Lys Val Asn Asn Leu His Glu Tyr Thr Lys Val Pro Ile Phe Gly 100 105 110 Cys Gly Leu Thr Thr Glu Met Ile Ile Pro Ser Val Asn Pro Ser Ile 115 120 125 Cys Val Glu Val Pro Phe Asp Thr Glu Asn Asn Trp Ala Val Thr Phe 130 135 140 Glu Glu Asp Ala Gln Arg Asn Tyr Ser Trp Arg Asp Lys Gly Asp Thr 145 150 155 160 Val Thr Gly His Leu Val Val Thr Pro Val Val Pro Val Asn Met Ser 165 170 175 Val Trp Val Glu Ala Gly Asp Asp Phe Glu Val Ser Asn Phe Tyr Gly 180 185 190 Pro

Claims (9)

  1. 수탁번호 KCLRF-BP-00475의 하이브리도마에 의하여 생산되는 한국형 낭충봉아부패병 바이러스의 구조 단백질인 VP1(KSBV-VP1)에 특이적으로 결합하는 단클론항체.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 KSBV-VP1을 인식하는, 단클론항체.
  3. 수탁번호 KCLRF-BP-00475의 하이브리도마에 의하여 생산되는 한국형 낭충봉아부패병 바이러스의 구조 단백질인 VP1(KSBV-VP1)에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 포함하는, 한국형 낭충봉아부패병 바이러스 감염 진단용 조성물.
  4. 제 3항의 한국형 낭충봉아부패병 바이러스 감염 진단용 조성물을 포함하는, 한국형 낭충봉아부패병 바이러스 감염 진단 키트.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 키트는 효소결합면역측정법을 이용하는, 한국형 낭충봉아부패병 바이러스 감염을 진단하기 위한 키트.
  6. (a) 벌로부터 분리된 생물학적 시료를 수집하는 단계;
    (b) 상기 생물학적 시료와 제 1항의 항체를 접촉시키는 단계; 및
    (c) 상기 항체와 생물학적 시료의 반응을 검출하는 단계, 한국형 낭충봉아부패병 바이러스 감염을 진단하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 반응이 효소적 색상 분석, 형광 분석 또는 화학발광 분석에 의해 검출되는 것인, 한국형 낭충봉아부패병 바이러스 감염을 진단하는 방법.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 벌은 유충 또는 성충인, 한국형 낭충봉아부패병 바이러스 감염을 진단하는 방법.
  9. 한국형 낭충봉아부패병 바이러스의 구조 단백질인 VP1(KSBV-VP1)에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 생산하는 수탁번호 KCLRF-BP-00475으로 기탁된 하이브리도마 세포주.
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