JPH03133389A - 有用たん白質の産生方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、有用たん白質をコードするＤＮＡを組込んだ
動物細胞をミクロキャリヤー上で培養、維持することに
より、該有用たん白質を産生ずる方法に関する。

［従来の技術］ 近年、遺伝子操作技術の応用により、各種有用たん白質
に対応するＤＮＡを大腸菌をはじめとする原核細胞ある
いは動物細胞などの真核細胞に導入し、その情報を発現
させることにより、該有用たん白質を産生せしめること
が可能となってきた。

原核細胞を用いる系と真核細胞を用いる系のたん白質の
生産性の比較については、現時点では一般的には大腸菌
などを用いる原核細胞系の方が釘利と考えられている。

しかしながら、糖たん白質などｐｏｓｔ　ｔｒａｎｓｌ
ａｔｉｏｎａｌ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎを要するも
のについては、原核細胞系ではその機構が欠除している
ために産生させることができないものがある。これらの
ことから、動物細胞を宿主として用いる遺伝子操作によ
るたん白質産生糸が注目を集めている。本発明は、この
ように外来遺伝子を導入、増幅された動物細胞を培養、
増殖させ、該外来遺伝子にコードされるたん白質を産生
せしめることを特徴とする有用たん白質の産生方法に関
するものである。

動物細胞に外来遺伝子を導入、発現させる試みは数多（
ある（例えば、蛋白質・核酸・酵素、臨時増刊１９８３
．Ｌ２　ｖｏｌ、２ｇ　Ｎｏ、１４、“組換え遺伝子の
細胞への導入と発現”）。その例としては、マウス由来
Ｃ１２７−１細胞を宿主、ウシパピローマウィルス（Ｂ
ＰＶ）をベクターとして、ヒトインターフェロンαおよ
びγを持続的に産生させる方法［ｆ？、Ｆｕｋｕｎａｇ
ａ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｐｒｏｃ、　ＮＡＳ、　８１．５
０８８（１９８４））　、あるいは２．チャイニーズノ
１ムスター由来ＣＨＯ細胞を宿主、アデノウィルスをベ
クターとして、ヒトインターフェロンγを持続的に産生
させる方法［Ｊ、Ｈａｙｎｅｓ、　Ｃ，Ｗｅｉｓｓｍａ
ｎｎ、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ、　Ｒａｓ、、　１１．
６８７　（１９８３）　３などが挙げられる。

しかしながら、上記に例として挙げた動物細胞はいずれ
も接着依存性細胞であるため、遺伝子操作を施した動物
細胞を培養する際には浮遊培養による培養はできない。

従って、このような接着依存性細胞を増殖させるために
は一般に単層培養を行なう。単層培養法は、いまだにロ
ーラー培養などが主流を占め、手間のかかること、およ
びバクテリアやかびなどに汚染されやすいなどの欠点が
あり、試験研究用規模の域を出ない場合が多い。

そこで本発明者らは、ミクロキャリヤー培養法を用いる
ことにより、遺伝子操作を施した動物細胞を大量に培養
し、かつ長期間にわたって維持させる方法を見い出し、
目的とする有用たん白質を大量に生産する方法を開発し
た（特開昭６２−３２８９６）。

［発明が解決しようとする課題］ しかしながら上記方法では、細胞を増殖、維持する上で
必要な成分である血清を添加した培地を使用して細胞を
維持しているため、産生される有用たん白質に血清たん
白質が混入されやすく、有用たん白質を医薬として使用
する場合は問題となる。また、これを除去するための精
製工程は非常に複雑で手間がかかる。

本発明の目的は、上記問題点を解決し、無血清培地を用
い有用たん白質を大量生産する方法を提供することにあ
る。

［課題を解決するための手段］ 上記目的は、以下の本発明により達成される。

すなわち本発明は、有用たん白質をコードするＤＮＡを
組込んだベクターを含む動物細胞をミクロキャリヤー上
に増殖、維持させることにより有用物質生産を行なうに
際し、完全無たん白培地あるいは０，１％以下のウシ血
清アルブミンを添加した培地中で、０．　３〜０．　６
　ｍｅＱ　・ＩＩｃＩ／ｇのイオン交換容量のミクロキ
ャリヤーを用いて、該動物細胞を維持することを特徴と
する有用たん白質の生産方法である。

本発明の有用たん白質は、遺伝子操作により産生できる
ものであれば特に限定されないが、例えば、ヒト・イン
ターフェロンβ、ヒト・インターフェロンγあるいはヒ
ト・インターロイキン２などが挙げられる。

有用たん白質をコードするＤＮＡを組込んだベクターは
、動物細胞中で増幅しうる性質を有するものであり、好
ましくは１）ｐＢＲ３２２の複製開始点などの大腸菌中
での複製に必要な複製開始点、ウシパピローマウィルス
、タイプＩ　（ＢＰＶ−１）ＤＮＡのＰｖｕＩＩ切断長
鎖フラグメント、５Ｖ４ｏプロモーター（初期または後
期）、有用たん白質をコードするＤＮＡおよびｐｏｌｙ
ｒＡ付加シグナルを含むベクター、あるいは、２）大腸
菌中での複製に必要な複製開始点、５Ｖ４ｏ初期プロモ
ーター、その下流に連結したジヒドロ葉酸還元酵素（Ｄ
　ＨＦ　Ｒ）をコードするＤＮＡ、有用たん白質をコー
ドするＤＮＡおよびｐｏｌｙｒＡ付加シグナルを含むベ
クターなどが用いられる。動物細胞は、有用たん白質を
コードするＤＮＡを組込んだベクターの増殖を許容する
性質を有するものであり、好ましくはマウスＣｌ２７−
１細胞、あるいはＣＨＯｄｈｆｒ”’　　（ジヒドロ葉
酸還元酵素欠損チャイニーズハムスター　オバリー細胞
）などが用いられる。

通常、前記１）のベクターにはマウスＣ１２７−１細胞
が、前記２）のベクターにはＣｌ０ｄｈｆｒ−細胞が用
いられる。

ミクロキャリヤーとしては、正に荷電した化学残基を有
する多糖類微小粒子（例えば、ジエチルアミノエチル化
した架橋デキストラン微粒子、ジメチルアミノプロピル
化したポリアクリルアミド微粒子など）、あるいはコラ
ーゲン被覆架橋デキストラン微粒子で、表面電荷が０．
３〜０．６ｗｅｇ・ｌｌＣｌ／ｇのイオン交換容量を持
つものが用いられる。

有用たん白質をコードするＤＮＡを組込んだベクターを
含む動物細胞をミクロキャリヤー上で増殖させる際の培
地は、通常の培地を用いることができるが、Ｃ１２７細
胞の場合はウシ胎児血清（Ｆｅ２）２〜１０％添加ダル
ベツコ−変法イーグルＭＥＭ培地を、ＣＨＯｄｈｆｒ−
細胞の場合は、ウシ胎児血清２〜１０％添加ＭＥＭアル
ファ培地（ヌクレオシド非添加）を用いる。

維持培地とは、増殖させた細胞を維持させるための培地
であり、本発明では血清を添加しない完全前たん白培地
、すなわちダルベツコ−変性ＭＥＭ培地（Ｄ−ＭＥＭ）
　、ＭＥＭアルファ培地などの基本培地のみか、あるい
はこれらに０．１％以下のウシ血清アルブミンを添加し
たものを用いる。

インターフェロン、インターロイキン２などの有用たん
白質を産生させる場合は、この維持培地を有用たん白質
産生用の培地として使用できる。

［実　施　例コ 以下に、マウス由来Ｃ１２７−１細胞を宿主、ＢＰＶを
ベクターとしてヒトインターフェロンγを発現する細胞
、およびチャイニーズハムスター由来ＣＨＯ細胞を宿主
、アデノウィルスをベクターとして、ヒトインターフェ
ロンγを発現する細胞を用いた実施例−で具体的に本発
明を説明する。

いうまでもないが、本発明は以下に述べる実施例に限定
されるものではない。

実施例１ ■　ＢＰＶγ／、Ｃ１２７細胞の構築 ｐＳＶＩＦＮ７／ＢＰＶ　　　　（特開昭６１９７（ｐ
） 一５２２８６号）を組込んだＣｌ２７−１細胞ＣＤ、Ｒ
，Ｌｏｗｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　２
６．１９１．１９７８）のクローンＮｏ、６４１（特開
昭６１−５２２８６号）を得た。以後、このクーロン細
胞をＢＰＶγ／Ｃ１２７細胞と呼ぶ。

■　種細胞の培養 Ｂ　Ｐ　Ｖ　７　／　Ｃ１２７細胞７Ｘ１０５ケをウシ
胎児血清（Ｆｅ２）１０％およびグルコース１ｇ　／　
Ｑを添加したダルベツコ−変法イーグルＭＥＭ培地（Ｄ
−ＭＥＭ）（日永製薬製）１０ｍｌに懸濁し、プラスチ
ックフラスコ（コーニング社製、２５１００、細胞接着
面積２５ｃｄ）中、３７℃にて培養する。通常、３〜４
日でｃｏｎｆｌｕｅｎｔ　ｍｏｎｏｌａｙｅｒ　　（細
胞数６〜８×１０６ケ／フラスコ）を形成する。０．２
５％トリプシン（Ｄｆｆｃｏ社製、１：２５０）を用い
て常法に従い細胞懸濁液を調整する。

■　ミクロキャリヤー培養によるインターフェロン産生
実験 プラスチックフラスコ中で培養した種細胞をルー瓶（細
胞接着面積的１５０ｃｏ？）に継代する。

ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ　ｍｏｎｏｌａｙｅｒ　　（３〜４
　Ｘ　１０７／ルー瓶）を形成させた後、トリプシナイ
ズし細胞懸濁液を調整する。０．　３〜０．　６５ｍｅ
ｑ−ＨＣＩ／ｇのイオン交換容量を持つミクロキャリヤ
ー（“Ｄｏｒｍａｃｅｌ！”　　　；　　　Ｐｆｅｉｆ
ｅｒ　　＆　　Ｌａｎｇｅｎ　　Ｄｏｒｍａｇｅｎ社）
０．６ｇをＦＣ３５％およびＩｇ／αグルコース添加Ｄ
−ＭＥＭ１９０ｍｌに懸濁し、上記細胞懸濁液（２，４
Ｘ１０７細胞／１０ｍ１ＦＣ８５％添加Ｄ−ＭＥＭ）と
ともに５００ｔｎｌ容量のスピナー瓶中で撹拌培養する
。２〜３日毎に培養液の９０％を新しい培養液（ＦＣ８
５％およびグルコースＩｇ／α添加Ｄ−ＭＥＭ）に交換
する。通常、培養開始後６日目にミクロキャリヤー上に
ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ　ｍｏｎｏｌａｙｅｒを形成する。

この時点以降、２〜３日毎に９０％の培地を血清不含の
Ｄ−ＭＥＭあるいは０．１％以下のウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）を含むＤ−ＭＥＭに交換し、２〜３ケ月間長
期培養を行なう。

インターフェロンは構成的に培養液中に分泌されるので
、２〜３日毎にインターフェロン原液が得られる。結果
を第１〜３図に示す。

第１図は、イオン交換容量の異なる４種類のミクロキャ
リヤー（“Ｄｏｒｍａｃｅｌど）を用い、交換容量の差
がインターフェロン産生と細胞の長期間培養維持に及ぼ
す影響を調べたものである。維持培地はＤ−ＭＥＭを用
いた。

第２図は、ＢＰＶγ／Ｃ１２７細胞を増殖培地で増殖さ
せ、細胞がｃｏｎｆ　１ｕｅｎｔになってから無血清維
持培地（Ｄ−ＭＥＭ）に替えて、１５日間培養して得ら
れたインターフェロン産生量を細胞当りで調べたもので
ある。これよりインターフェロン産生は、イオン交換容
量の増加を共に低下することがわかる。

第３図は、第１図、第２図で良好な結果を得た０、　　
３ｍｅｑｉｌＣＩ／ｇの交換容量を持つミクロキャリヤ
ーを用い、無血清条件下と０．１％ＢＳＡ存在下で細胞
を長期間維持した結果と、２〜３日毎の培地交換で得ら
れたインターフェロン産生量を示している。この結果は
、ＢＰＶγ／Ｃｌ２７細胞は、無血清条件下でも２〜３
ケ月間にわたり、高い力価のインターフェロン産生を続
けながら培養維持できることを示している。

インターフェロン力価測定は、Ｓ、Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉ
ｎらの方法［Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　３７．７５５．１９
８１　］に従いＦＬ細胞、５ｉｎｄｂｉｓ　Ｖｉｒｕｓ
を用いたＣＰＥ５０法により行なった。標準インターフ
ェロンとしては、ＮＩＨ標準ヒトインターフェロンγと
すり合わせを行なった組換え大腸菌由来のヒトインター
フェロン７８，３００単位／ｍｌを用いた（特開昭６１
−５２２８６号参照）。

実施例２ ■　ｄｈｆｒ−７／ＣＨＯ細胞の構築 発現プラスミドｐｓＶＩＦＮγ／ＡｄＤＨＦＲは、５ｃ
ａｈｉ　Ｉ　ｌ　ら［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ
ｄ、　Ｓｅｔ、。

Ｕ、Ｓ、Ａ、　８０．４６５４−４６５８．１９８３］
　　とｌ１ａｙｎｅｓら　（Ｎｕｃｌｃｉｅ　Ａｃ１ｄ
ｓ、　Ｒｅｓ、、　２．６８７−７０６．１９８３３の
方法に準じて構築され、Ｇｒａｈａｍら（Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ、　５４゜５３６−５３９．１９７３３の方法で細
胞内に導入され高力価産生株を得た。

■　種細胞の培養 ｄｈｆｒ−７／ＣＨＯ細胞７Ｘ１０５ケをＦＣ８ＩＯ％
を含むヌクレオシド不含のアルファーＭＥＭ１０＋ｎｌ
に懸濁し、プラスチックフラスコ（コーニング社製、２
５１００、細胞接着面積２５ｃｒＩ）中、３７℃にて培
養する。通常、３〜４日でＣｏｎｆｕｅｎｔ　ｍｏｎｏ
ｌａｙｅｒ　（細胞数６〜８×１０６／フラスコ）を形
成する。

■　ミクロキャリヤー培養によるインターフェロン産生
実験 実施例１の（３〉と同じ方法で、４種類の交換容量の“
Ｄｏｒｍａｃｅ！　Ｉ”を用い、ｄｈｆｒ−ｒ／ＣＨＯ
細胞を培養し、インターフェロンを産生させた。維持培
地はＭＥＭ−アルファ培地を用いた。結果を第４図に示
す。

［発明の効果］ 本発明方法により、従来は困難であった有用たん白質高
産生の動物細胞の大量培養化が果たせ、その結果、大量
の有用たん白質を分泌生産することが可能となり、商業
生産を考える上でも効果的である。しかも、本発明方法
では、維持培地として血清を添加しない培地を用いるた
め、血清が混入されず高純度の有用たん白質を産生ずる
ことができる。さらに、高価な血清を必要としないため
コストを大幅に低減できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＢＰＶγ／Ｃ１２７細胞のインターフェロン
産生量および細胞の長時間維持と、ミクロキャリヤーの
イオン交換容量との関係を示すものであり、イオン交換
容量は、○が０．３０ｍｅｑ−ＩＩＣＩ／ｇ、■が０．
　５０　ｍｅｑ−１１ＣＩ／ｇ、ムが０゜５８　ｍｅＱ
−ｔｌｃｌ／　ｇ　、・が０．　６５ｍｅｑ　・ＨＣｌ
／ｇを各々示す。 第２図は、ＢＰＶγ／Ｃ１２７細胞による細ｊ泡当りの
インターフェロン産生量および細胞数と、ミクロキャリ
ヤーのイオン交換容量との関係を示すものである。 第３図は、０．　３ｍｅｑ−１ｌＣＩ／ｇのイオン交換
容量を持つミクロキャリヤーを用い、ＢＰＶγ／Ｃ１２
７細胞を長期間培養したときのインターフェロン産生量
を示すものである。 第４図は、ｄｈｆｒ−７／ＣＨＯ細胞のインターフェロ
ン産生量とミクロキャリヤーのイオン交換容量との関係
を示すものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）有用たん白質をコードするＤＮＡを組込んだベク
   ターを含む動物細胞をミクロキャリヤー上に増殖、維持
   させることにより、有用物質生産を行なうに際し、完全
   無たん白培地あるいは０．１％以下のウシ血清アルブミ
   ンを添加した培地中で、０．３〜０．６ｍｅｑ・ＨＣｌ
   ／ｇのイオン交換容量のミクロキャリヤーを用いて、該
   動物細胞を維持することを特徴とする有用たん白質の産
   生方法。