JPH02222696A - 蛋白質の産生方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞
またはヒト肝細胞を宿主細胞とする形質転換体を無血清
或いは低濃度血清培地中で培養して、目的とする蛋白質
を産生ずる方法に関するものである。

（従来の技術及び発明が解決しようとする問題点）／ 近年、組換えＤＮＡ含有細胞や細胞融合体等を培養して
、該構造遺伝子を発現させ蛋白質を産生させる方法が実
施されている。そして、構造遺伝子が動物由来のもので
ある場合、天然によシ近い蛋白質を得るために宿主細胞
として動物細胞を使用する例が増えている。

従来、動物細胞培養物から目的物を取得する場合、動物
細胞の増殖が未だ行われている段階で培養を止めて、得
られる培養物から目的物を取得する方法が一般的である
。

そのため、培養液中には動物細胞の増殖に必要な血清が
約５〜１０（１）程度経験的に添加されている。従って
、培養物中には血清由来の蛋白質が混在することとなシ
、目的とする蛋白質を精製するのに手間がかかるという
問題点があった。

本発明者らは、ＣＨＯ細胞及びヒト肝細胞を宿主細胞と
して無血清培地或いは低濃度血清培地で培養して目的物
を産生させることを試みた。

しかしながら、一定時間培養を行うと、経時的に目的物
の生産量が減少した。本発明者らの検討によれば、それ
は宿主細胞由来のセリンプロテアーゼ等の分泌プロテア
ーゼ又は死細胞よシ漏出したプロテアーゼ等によって目
的蛋白質が分解されることがその一因であることが分っ
た。

ｃ問題点を解決するための手段） そこで、本発明者らは、種々のプロテアーゼ阻害剤を存
在させて培養する方法を種々検討した結果、特定の所謂
Ｃ／インヒビター（Ｍｅｔｈｏｄｓン Ｅｎｚｙｍｏｌ　、、（メ７ツズ　イン　エンザイモロ
ジー）ざ０，１ＩＪ−Ｉ−ダｊ　　（／りｒ／）〕を存
在させることによって所期の目的が達成されることを知
得し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明の要旨は、蛋白質をコードする構造遺伝子
を含むＤＮＡを導入して形質転換されたチャイニーズハ
ムスター卵巣細胞又はヒト肝細胞を培養して該構造遺伝
子を発現させ、該蛋白質を産生させる方法において、細
胞培養を無血清培地又は低濃度血清培地中Ｃ／インヒビ
ター又はＣ／インヒビター様グロテアーゼ阻害剤の存在
下に行うことを特徴とする蛋白質の産生方法に存する。

以下本発明を説明するに、本発明で使用する宿主細胞は
、チャイニーズノ・ムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はヒ
ト肝細胞であり、それらの公知のいずれの細胞株も使用
することができる。

具体的には、例えば、ＣＨＯＫｌ　（Ｊ　、Ｅｘｐ、Ｍ
ｅｄ　、　。

（ジャーナル　オブ　イクスペリメンタル　メディシン
）。

ｉｏｒ　、りＩＩ！　（ｔ　’？！Ｉ　）］％ＣＨＯｄ
ｈｆｒ−（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　Ｃプロシーデ
ィングスオブ　ザ　ナショナル　アカデミ−オプ　サイ
エンシズ　オプ　ザ　ニーニスニー）７７、弘２／ｌ−
４１２２０（ｉｙｒｏ）’３　　を代表とするＣＨＯ由
来変異株〔蛋白質核酸ｆＲ，素、　２７，６１７−１２
（／Ｐ１２））、ヒト肝（癌）由来細胞株ＮｕＥ、　Ｋ
Ｎ［Ｃａｎ、Ｒａｓ、。

（ｌり７４）　　〕、ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣｃａｔ、Ｎ
ｏ、　　ＨＢｒｏｔｓ）等が挙げられる。

本発明の宿主細胞を形質転換する方法は特に制限される
ものでなく、公知の組換えＤＮＡ技術或いは細胞融合法
により、目的の構造遺伝子を含むＤＮＡを宿主細胞中に
導入することができる。

該構造遺伝子としては、セリンプロテアーゼで分解され
るアミノ酸配列を有するアポリポプロティンＥ等の遺伝
子、或いはＣ１ｒ、Ｃ３Ｓ１Ｃ４、Ｃ２等の各補体成分
等の遺伝子を特に有利に使用し得るが、その他ヒト血漿
蛋白質、各種蛋白性ホルモン、成長因子、ウィルス抗原
、リセブター等の公知の種々の遺伝子発現にも使用する
ことができる。

上記構造遺伝子を、例えば、プラスミドｐＫＣＲＨ−２
Ｃ特開昭Ａ／−２１１タタＯ号公報〕等に組込んで得ら
れる発現ベクターを、常法に従って宿主細胞に導入した
り、或いはヒト肝細胞株又はハムスター由来細胞株と目
的とする遺伝子を含む異種動物細胞、特にヒトの各臓器
の細胞を常法に従って融合することによって、その各臓
器に存在する目的遺伝子を導入して形質転換する。

上記の様にして得られる形質転換体の培養は、ＣＨＯ細
胞又はヒト肝細胞の生存維持に必要な栄養分を含む基本
合成培地中で、特定のプロテアーゼ阻害剤、即ち、Ｃ／
インヒビター又はＣ／インヒビター様グロテアーゼ阻害
剤の存在下に行う。

基本合成培地としては、アミノ酸、糖類、ビタミン類、
無機塩類を主成分とし、その他者種核酸、補酵素、蛋白
質加水分解物等を含む培地で、具体的には、例えばｅＲ
ＤＦ（極東製薬社製）：　Ｈａｒｌｔｓ　Ｆ／　０、Ｆ
１２、Ｆ　／　２−Ｍ％Ｆ　−／　２　Ｋ　；Ｐｕｃｋ
ｌｏ−１０，ｊ−１０；ＲＰＭＩ　／１．ＯＪ、／　４
３０゜／ｌ、３１１、／　ｔ　ｕＯ；５ｗ１ｒｎ　６７
−Ｇ　；　Ｔｒｏｗｅｌｌ　Ｔｒ；　５ｃｈｎｅｉｄｅ
ｒ　；　ＭＢ　７　Ｊ’コアｔ、７ｏｓ；Ｗｉ　ｌｌｉ
ａｍ　Ｄ、　Ｅ　；　Ｆｉｓｈｅｒ；　ＮＣＴＣ／　Ｊ
　ｊ　；０ｖｉＲＬ１０１、ｔ　；Ａ２＋ＡＤＧ　；　
ＩＭＤＭ；ＤＭＥ；　　Ｌ−／　０゜−／　ｒ　；　Ｍ
ＣＣ０’ｙｊａ　；　／タタ；ＭＥＭ；ＢＭＥＭ；　　
α−ＭＥＭ　（以上ギプコ社製）：ラクトアルブミン分
解物培地（シグマ社製）等が挙げられる。

本発明で使用するプロテアーゼ阻害剤としては、Ｃ／イ
ンヒビター又はＣ／インヒビター様の活性を有する種々
のプロテアーゼ阻害剤が挙げられる。例えば、（ａ）牛
胎児血清由来プロテアーゼ阻害剤、即ち牛胎児血清中に
通常夕０〜ｉｏｏ■／！の濃度で存在し、５ＤＳ−ＰＡ
ＧＥ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）のＮ
末端のアミノ酸配列が、Ｎ　−Ａ　ｓ　ｐ　ａｇｅ　ｔ
　ａＩｌｅ＊ＶａｌａＧｌｙｅＰｒｏ＊Ｇｌｙ＊Ｐｒｏ
＊Ｇｌｙ＊ＡｓｐｓＧｌｙ＊Ｇｌｎ・Ｓｅｒ　　である
プロテアーゼ阻害剤〔なお、このプロテアーゼ阻害剤は
、牛胎児血清から精製することができる。例えば、まず
牛胎児血清をａｏ−ｔｏ％飽和硫酸アンモニウム溶液で
塩析し、次にこれを２倍に希釈したダルベツコＰＢＳ（
＋７７酸バッファ塩類液：以下、「ＰＢＳＪと略す）で
平衡化し、ヘパリンセファロースカラムまたはそれと同
等品に吸着させ、同１／２濃度のＰＢＳで洗浄後、ＰＢ
Ｓで溶出する。次にＰＢＳ溶出画分をノ＼イドロキシア
パタイトカラムにかけて、／（７ｍＭリン酸バッファｊ
　ＯｍＭ塩化ナトリウムから３００ｍＭリン酸バッファ
ｊ　ＯｍＭ塩化ナトリウムのグラジェントを用い電導度
λ、２ｍｈｏ（そ−）前後に溶出することによりさらに
精製することができる。

また、サラにフェニルセファロースカラムにかけて、／
Ｍ硫酸アンモニウム１０ｍＭリン酸バッファから１０ｍ
Ｍリン酸バッファのグラジェントで溶出分画することに
より、最初のピークとして溶出される。本段階において
５Ｏ８−ＰＡＧＥで単一バンドにまで精製され、牛胎児
血清ｌ！より純品として数７００μ２以上が得られる。

本発明においては、本プロテアーゼ阻害剤は部分精製品
でもよく、例えば上記ヘパリンセファロースカラムまで
精製したものであってもよい。）、（ｂ）　　牛血清由
来Ｃ／インヒビター様グロテアーゼ阻害剤（（Ｂｉｏｃ
ｈｉｍｉ、Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ａｃｔａ　（バイオキミカ　エバイオフィジカ　アクタ
）、り２３．／６７−／７り（／りｒ７）に記載の方法
に従って得られる。〕、（Ｃ）牛血漿由来抗ファクター
Ｘ　ＩＩ　ａ阻害剤（Ｊ　、Ｂｉｏｌ、、Ｃｈｅｒｒ＋
、　　（ジャーナル　オプ　バイオロジカル　ケミスト
リイ　）、互互土、ｌコア／μ〜ｌコ７コ／（／り♂７
）に記載の方法に従って得られる。〕または（ｄ）ヒト
Ｃ／インヒビター（Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、、　
　（ジャーナル　オブ　クリニカル　インベスティゲイ
ション）己土、ｊり３−ｔｏ４ｔｃｉり７よ）に記載の
方法に従って得られる。〕等の蛋白性プロテアーゼ阻害
剤、或いは（ｅ）６−アミジツーコーナフチルｐ−グア
ニジノベ／シェードジメタンスルホ／酸塩（メシル酸ナ
ファモスタット）ロチアーゼ阻害剤等が挙げられる。

上記プロテアーゼ阻害剤は、使用する阻害剤の種類によ
り異なるが、例えば（ａｔ〜（５）の蛋白性プロテアー
ゼ阻害剤の場合は、培地中／Ｑ〜／、０００　ｎｇ／ｙ
ｘｌの範囲で使用し、（ｅ）及びｆｆ）の合成プロテア
ーゼ阻害剤の場合は、培地中それぞれ０．／−７ｍＭ及
び２〜３ｍＭの範囲で使用するのが好ましい。

本発明においては、目的蛋白質のＮＨに影響を与えない
程度、例えばｏ、ｒ％以下の牛胎児血清、新生仔牛血清
等の血清を培地中に添加してもよい。

培養法としては付着した状態でも浮遊化した状態でもよ
く、システムとしてもシャ・−レやフラスコを用いた培
養から、攪はん培養、エアーリフト培養、固定床培養装
置、流動床培養装置、ホローファイバー　マイクロキャ
リアー　マイクロカプセル培養等いずれの装置を用いて
も良い０ 培養開始時の播き込み細胞数を約／（７’Ｃｅ１ｌｓ／
ゴ以上とし、３７℃前後でｊ％００９雰囲気下に培養を
行う。播き込み後任意の時間まで増殖させた後、通常コ
ンフルエントな状態になった時期に、本発明のプロテア
ーゼ阻害剤を含む培地に換えて更に培養を続けると、目
的蛋白質が得られる。培養は目的蛋白質がインタクトな
状態の物質として最大となる時期まで続ける。

かくして得られる培養液からの目的の蛋白質の精製は、
常法に従い、塩析、イオン交換クロマトグラフィー　疎
水クロマトグラフィー　ゲル濾過、アフィニティークロ
マトグラフィー液層分配、等電点沈殿、等電点電気泳動
、）・イドロキシアパタイトクロマトグラフィー　逆相
クロマトグラフィー等を適宜組合せて行えばよい０ （発明の効果） 本発明に従えば、培養中に目的蛋白質が分解され＃≠る
こ・とがないので生産性が向上（培地利用効率が向上）
し、しかも、血清由来の夾雑蛋白質及び目的蛋白質の分
解物等が殆んど含まれていないので目的蛋白質を容易に
精製できる。

（実施例） 以下に実施例を挙げて更に本発明を具体的に説明する。

実施例１ 特開昭４／−２♂！タタＯ号公報の実施例／に記載され
た方法に従って作製されたアポリボプロティンＥ産生組
換えＣＨＯ細胞（３ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）をよ係
牛血清を含有するｅ−ＲＤＦ（ｐＨ７，４ｔ）培地ｊ　
ｘｔｌ中、！％ＣＯ，雰囲気下、３７℃で培養増殖した
。培養約５日後、コンフルエントな状態に達した時点で
、各種プロテアーゼ阻害剤を含む無血清培地であるｅ　
−ＲＤ　Ｆ（ｐＨ７，弘±０．２）培地よｘｌに移し換
え、更に培養を続け、培養時間に対するアポリボプロテ
ィンＥの生産量を測定した。その結果を第１図に示シた
（なお、アポリボプロティンＥの生産量は、特開昭ｔ／
−２♂ｊタタＯ号公報の実施例１に記載の方法及び５Ｄ
Ｓ−ＰＡＧＥによって調べた。）。

第１図から明らかなように５本発明の方法に従い、プロ
テアーゼ阻害剤を含む培地で培養することによりアポリ
ボプロティンＥの生産量が増大する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、アポリボプロティンＥ産生組換えＣＨＯ細胞
をグロテアーゼ阻害剤含有培地で培養した時のアポリボ
プロティンＥ生産の経時変化を表わす図である。なお、
図中の記号の表わす意味は以下の通９である。 ０−Ｏ：　プロテアーゼ阻害剤無添加 （コントロール） Δ−咄：　牛胎児血清由来プロテアーゼ阻害剤（前記（
ａ）　）　／　！Ｏｎｇ／ｍｅ口）−（コニ ・−一・： ム　　： ★　　： 牛胎児血清由来プロテアーゼ阻害 剤（前記（ａ）　）　Ｊ　、ｒ　Ｏｒｌ　ｇ　／　Ｒ１
同　　　上　　ｊｏｏ　ロｇ　／　ｍ／ベンズアミジン
　ＪｍＭ メシル酸ナファスタット ０、／　／　ｍＭ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）蛋白質をコードする構造遺伝子を含むＤＮＡで形
   質転換されたチャイニーズハムスター卵巣細胞又はヒト
   肝細胞を培養して該構造遺伝子を発現させ、該蛋白質を
   産生させる方法において、細胞培養を無血清地又は低濃
   度血清培地中、Ｃ／インヒビター又はＣ／インヒビター
   様プロテアーゼ阻害剤の存在下に行うことを特徴とする
   蛋白質の産生方法。