JPH03130095A - 酵素活性の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はグリシルプロリル−ジペプチジルアミノペプチ
ダーゼ（以下ＧＰ−ＤＡＰと省略する）の活性測定法に
関するものである。更に詳しくは、一般式（１）で表さ
れる化合物 １ ２ （式中、Ｘｌおよびｘ２はハロゲン原子である）および
ＣＰ−ＤＡＰを含む被検液とを反応させ、生成するアミ
ン化合物をカプラーおよび酸化酵素と反応させ、形成さ
せる色素を測定するＣＰ−ＤＡＰの活性測定法に関する
。

（従来の技術） 従来ＣＰ−ＤＡＰ活性測定法は、主に、血清を検体とし
て肝疾患の診断に用いられてきたが、近年、尿中のＣＰ
−ＤＡＰ力鮎疾患の診断にも利用できることが報告され
ている（医学のあゆみ１２８巻、１０号　６４５−６４
６頁）。この測定は、通常、グリシル−プロリル−ｐ−
ニトロアニリンを基質として用いてＣＰ−ＤＡＰにより
遊離されるｐ−ニトロアニリンの比色定量を行なう測定
法であった。

（発明が解決しようとする問題点） しかしながら、尿中ＣＰ−ＤＡＰと血清中ＣＰ−ＤＡＰ
活性測定の至適条件は、前者がｐＨ７，９であり、後者
がｐＨ９，０付近であるため、ｐ）１８以上では不安定
なグリシル−プロリル−ｐ−ニトロアニリンに代わる基
質を用いた活性測定法が当業者の間で強く望まれていた
。

（問題を解決するための手段） 本発明者らは、従来の欠点を克服するべく検討した結果
、前記一般式で表される化合物（１）が活性測定条件の
ｐＨ９付近でも十分安定なことから本願発明の方法を見
いだし完成した。

本発明の基質として使用する前記一般式（１）で表され
るジペプチド誘導体は、−Ｓ式Ｙ−Ｇｌｙ−ＯＨ（ＩＩ
） （式中、Ｙはｔ−ブトキシカルボニル４　（Ｂｏｃ）、
ベンジルオキシカルボニル基（Ｚ）、ｐ−メトキシベン
ジルオキシカルボニル基（Ｚ　（ＯＭｅ））等のウレタ
ン型保護基である。） で表されるグリシン誘導体と一般式 （式中、Ｘｌ及びＸ２はハロゲン原子である。）で表さ
れるプロリン誘導体とを反応させ、次いで脱保護反応に
付すことにより製造することができる。

前記一般式（ｎ）で表されるグリシン誘導体は、工業的
に入手容易な化合物であり、前記一般式（ＩＩ［）で表
されるプロリン誘導体は、２．６−シハロー４−アミノ
フェノールとプロリンとから容易に得ることができる化
合物である（下記参考側参照）。

本願発明は前記一般式（１）で表わされるジペプチド誘
導体が、ＧＰ−ＤＡＰの作用により加水分解されて、一
般式 （式中、ｘＩおよびＸ２は前記と同し）で表わされるア
えン化合物が生威し、このアミン化合物が酸化酵素の作
用によりカプラーと酸化縮合して発色化合物を形成する
原理に基づくものである。

前記一般式（１）で表わされるジペプチド誘導体とＧＰ
−ＤＡＰとの反応は、通常３７°Ｃ付近で１分以上反応
を行い、前記一般式（ＩＶ）のアミン化合物が生成する
このＣＰ−ＤＡＰ酵素の至適ｐＨは７．５〜９．５であ
り、この範囲内でｐＨを設定すればよい。この時用いる
緩衝液は、リン酸塩、ホウ酸塩、トリスヒドロキシメチ
ルアミノエタン、グツドバッファー等が用いられる。

生成した前記一般式（■）のアミン化合物はカプラー共
存下酸化酵素と反応させ、酸化縮合して発色化合物を形
成させる。

使用するカプラーは、下記一般代 れる化合物。

（Ｖ） で表さ （式中、Ｒ９は水酸基、アミノ基または置換アミノ基を
示し、Ｒ，、Ｒ１，Ｒ，、Ｒ６またはＲ６は水素原子、
ハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ア
ミノ基、置換アミノ基、水酸基、カルボキシ基またはス
ルホ基を示し、またはＲ３およびＲ６は一緒になって環
を形成してもよい基である）である。その代表的なカプ
ラーとしては、例えばフェノール、サリチル酸、ｍ−ヒ
ドロキシ安息香酸、２．６−ジヒドロキシ安息香酸、２
−ア藁ノー３−ヒドロキシ安息香酸、２−ヒドロキシ−
５−アくノ安息香酸、ρ−ヒドロキシ安息香酸、サリチ
ル酸メチル、０−メチルフエノール、ｍ−メチルフェノ
ール、ｐ−メチルフェノール、０−メトキシフェノール
、ｍ−メトキシフェノール、ｐ−メトキシフェノール、
０−クロロフェノール、ｍ−クロロフェノール、ｐ−ク
ロロフェノール、２．３−ジメチルフェノール、２．４
−ジメチルフェノール、２．５−ジメチルフェノール、
２．６−ジメチルフェノール、３，５−ジメチルフェノ
ール、２．６−ジクロロフェノール、０−アミノフェノ
ール、ｍ−アミノフェノール、ｐ−ブロムフェノール、
０−エチルフェノール、ｍ−エチルフェノール、２，４
−ジクロロフェノール、２，４ジブロムフエノール、２
．６−ジブロムフェノール、２．６−ジプロムー４−ア
ミノフェノール、２．６ジクロロー４−アミノフェノー
ル、２．６−シメトキシフエノール、２−メチル−６−
クロロフェノール、２−クロロ−５−メチルフェノール
、２アミノ−４−クロロフェノール、Ｎ、Ｎ−ジエチル
−ｍ−アミノフェノール、２−アごノー４−メチルフェ
ノール、０−力ルボキシメチルフェノール、２−カルボ
キシ−４−アごノフェノール、３．４ジヒドロキシフエ
ネチルアミン、α−ナフトール、β−ナフトール、４−
クロロ−１−ナフトール、２−カルボキシ−ｌ−ナフト
ール、■−ヒドロキシー２−ナフトエ酸、１−ナフトー
ル−２−スルホン酸、ｌ−ナフトール−３−スルホン酸
、１−ナフトール−４−スルホン酸、１−ナフトール−
８−スルホン酸、２−ナフトール−６−スルホン酸、２
−ナフトール−７−スルホン酸、２−ナフトール−８−
スルホン酸、２−ナフトール−３，６ジスルホン酸、２
−ナフトール−６，８−ジスルホン酸、Ｎ、Ｎ−ジエチ
ル−ｍ−アミノアニリン、Ｎ、Ｎ−ジメチル−ｍ−アミ
ノアニリン、０−カルボキシアニリン、ｍ−カルボキシ
アニリン、〇−クロロアニリン、ｍ−クロロアニリン、
ｍ−ブロムアニリン、０−メチルアニリン、ｍ−メチル
アニリン、Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ、Ｎ−ジエチ
ルアニリン、Ｎ、Ｎ−エチル・エチルヒドロキシアニリ
ン、Ｎ、Ｎ−エチル・エチルヒドロキシメタトルイジン
、３−アミノ−４−クロロアニリン、２−メチル−３−
クロロアニリンなどが挙げられる。

Ｃ，Ｐ−ＤＡＰの酵素反応と発色化合物形成の縮合反応
が酵素の至適ｐＨ範囲７．５〜９．５で行うことができ
、これらの反応を連続して行うことができる。

また酸化酵素としては、ポリフェノールオキシダーゼ、
アスコルビン酸オキシダーゼ等を用いることができる。

前記一般式（ＩＶ）と前記一般式（Ｖ）で表されるカプ
ラーとの酸化縮合反応により形成される発色化合物の極
大吸収波長は５５０〜６５０ｎｍに分布する青色系であ
り、生体試料中のビリルビンやヘモグロビン等の夾雑物
の影響も受けにくいため、ＣＰ−ＤＡＰの酵素活性測定
を容易にしかも高感度に行うことができる。

（作　用） 本発明は各反応ステップが簡単なため、測定の自動化が
容易にでき、更に、用いる基質が安定であるためブラン
クが低いことから、従来の測定方法に比べ、迅速かつ正
確にＧＰ−ＤＡＰの酵素活性を測定できる。更に、生成
する発色化合物が通常は５５０〜６５０ｎｍ付近に極大
吸収があるため生体試料中の夾雑物の影響を受けにくい
。本発明によるＧＰ−ＤＡＰの酵素活性測定法はきわめ
て精度の高い方法である。

以下、参考例及び実施例により本発明を更に詳細に説明
する。

参考例１ 遊離の２，６−ジプロモー４−アミノフェノールの言周
製 蒸留水４００ｍｊ２に炭酸水素ナトリウム２１ｇ（０，
２５ｍｏｌ　）を溶かした。２．６−ジブロモ−４７く
ノフェノールＨ（／２ＳｎＣｆｆｉ　２２９．１５　ｇ
（０，０５９ｍｏｌ　）をこれに添加し、均一に懸濁し
た。更に、酢酸エチル４０５ｍｆを加えて室温で５〜ｌ
Ｏ分間強く撹拌した。これにハイフロス−パーセル（１
５ｇａｌｓ／５ｑ−ｆｔ／ｈｏｕｒ半井製）１０〜２０
ｇを加えて懸濁後、ろ過した。このろ液の酢酸エチル層
を得、これを無水硫酸ナトリウムで乾燥後、２．６−ジ
プロモー４−アミノフェノールを得た。

参考例２ Ｂｏｃ−Ｌ−プロリル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロ
キシアニリドの合成 Ｂｏｃ　−Ｌ−プロリン６．２１　ｇ　（０，０２９ｍ
ｏｌ　）をジクロロメタン７０ｍｆに溶かした。さらに
、２．６ジブロモー４−アミノフェノール７．７ｇ（０
，０２９ｍｏｌ　）を加えて懸濁させた。これを水中で
冷却しく１０″Ｃ前後）、１−エチル−３（３−ジメチ
ルアミノブロビル）カルボシイ柔ド塩酸塩４．１６　ｇ
　（０，０３２ｍｏｌ　）を添加した。添加１０分後、
反応液に発熱が無ければ、室温で１時間撹拌した。これ
に、ジクロロメタン１４０ｎｌを加えてから、５％炭酸
水素ナトリウム、蒸留水、１０％クエン酸、蒸留水の順
で各３回ずつ洗浄した。

ＴＬＣ（３％メタノール−９７％ジクロロメタンの展開
溶媒）でニンヒドリン発色させ、２．６−ジプロモー４
−アミノフェノールが無いことを確認後、無水硫酸ナト
リウムで乾燥したのち、溶媒を留去しＢｏｃ−Ｌ−プロ
リル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリドを得
た。収率７５％。

ｒ ＮＭＲ（ＣＤＣｆｚ、　　δ） １．５０　　（９Ｈ，ｓ）、１．８０−２．１０（３Ｈ
，ｍ）　、２２．５−２．４５　　（１）１．　　ｍ）
３．３０−３．６０　　（’２Ｈ，ｍ）　、４．３０４
．６０　　（ＬＨ，ｍ）　、５．７０　　（ＬＨ，ｓ）
７．６８　　（２Ｈ，ｓ）、９．６０（ＩＨ，ｂｒａ　
　）融点　　８９．２−９２．２°Ｃ 参考例３ Ｌ−プロリル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニ
リド塩酸塩の合成 水中でＢｏｃ−Ｌ−プロリル−３，５−ジブロモ４−ヒ
ドロキシアニリド１０　ｇ　（０，０２２ｍｏｌ　）に
、３．４Ｎ塩化水素を含むジオキサン溶液６５ｍｆ（０
，２２ｍｏｌ　）を加えて撹拌した。発熱がなげれば、
室温で１時間撹拌すると、白い結晶が析出した。これに
エーテル４００ｍｊ！を加えて、更に結晶を析出させ、
これをグラスフィルターでろ取し、エーテル１００〜２
００ｍｆｆ１で洗浄した。得られた結晶は水酸化ナトリ
ウム存在下で、減圧下乾燥しＩ７−ブロリルー３．５−
ジブロモ−４−ヒドロキシアニリド塩酸塩を得た。

ｒ ＮＭＲ 融点 （３Ｈ，ｍ）　、２．４０− ｍ、）　、３．３０−３．５０ ４．３０−４．４０　（Ｌ　Ｈ、ｍ　）、５） ８８．５°Ｃ （ＣＤｓＯＤ　、　　δ） ２、０５−２．２０ ２．６０（ＬＨ。

（ＩＨ，ｍ）　、 ７．７８（２Ｈ。

１８４．５−１ 参考例４ Ｂｏｃ−グリシル−Ｌ−プロリル−３，５−ジブロモ−
４−ヒドロキシアニリドの合成 Ｂｏｃ　−’ｌ”）シン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル（Ｂｏｃ　−Ｇｌｙ　−０３ｕ　）　３．５
　ｇ　（０，０１３ｍｏｌ　）をジオキサン１００ｍｊ
２に溶かしておく（完全には溶解しない）。また、Ｌ−
プロリル３．５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリド塩
酸塩を蒸留水１００ｍｆに溶かし、更に炭酸水素ナトリ
ウム３．３ｇを加えて懸濁液を得た。この懸濁液に前述
のＢｏｃ　　Ｇｌｙ−ＯＳｕジオキサン溶液を添加し、
室温で撹拌した。約１５分後、反応液が透明な液になっ
た後、蒸留水１１を加えて白色結晶を析出させた。この
結晶を酢酸エチル３５０＋ｎｊ！で２回抽出する。この
抽出液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、蒸留水、１０
％クエン酸、蒸留水の順で２５０ｎ＋４２３回ずつ洗浄
し、さらに酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後
溶媒を留去してＢｏｃ−グリシル−し−プロリル−３，
５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリドを得た。収率７
４％。

Ｂｒ ＮＭＲ（ＣＤＣｊ２３　、　　δ） １．４７　（９Ｈ，ｓ）、１．８０−２．００（ＬＨ，
ｍ）　、２．００−２．２０　（２Ｈ。

ｍ）　、２．４５−２．６０　（Ｌ　Ｈ，ｍ）　３．３
５−３．５０　（ＩＨ，ｍ）　、３．５０−３．６５（
ＩＨ，ｍ）、　３．９７　（２Ｈ，ｄ）、４．７０−４
．８０　　　（２Ｈ，ｍ）　、５．３５（ＩＨ，ｓ）、
　５．７５　（ＩＨ，ｓ）、７．７１　（２Ｈ，ｓ）、
９．３５　（ＬＨ，ｓ）融点　　１１８．０１２３．Ｏ
°Ｃ 参考例５ グリシル−Ｌ−プロリル−３，５−ジブロモ−４ヒドロ
キシアニリド塩酸塩の台底 水中でＢｏｃ−グリシル−Ｌ−プロリル−３，５−ジブ
ロモ−４−ヒドロキシアニリド５ｇ（９，５９ｍｍｏｌ
）を３．４Ｎ塩化水素を含むジオキサン溶液２８　ｍｅ
　（９５，９ｍｍｏｌ）を添加し、発熱がなければ室温
で１時間撹拌した。白色の結晶が析出してくる。これに
エーテル２００ｍｎを加えて充分結晶を析出させたのち
グラスフィルターでこの結晶をろ取し、エーテル５０＋
＋／！で洗浄した。この結晶を水酸化ナトリウム存在下
、減圧下乾燥してグリシル−Ｌ−プロリル−３，５−ジ
ブロモ−４−ヒドロキシアニリド塩酸塩を得た。収率９
９％。

Ｂｒ ＮＭＲ （ＣＤ３０Ｄ　、　　δ） １．９０−２．２０　　（３Ｈ，ｍ）　、２．２０２．
４０　　（Ｌ　Ｈ，ｍ）　、３．５０−３．７５（２Ｈ
，ｍ）　、３．９２　（２Ｈ，ｓ）、４．５０−４．６
０　　（Ｌ　Ｈ，ｍ）　、７．７４（２Ｈ，ｓ） 融点　　２３２−２３５．　Ｏ°Ｃ 実施例工 ０、１　Ｍビシンー水酸化カリウム緩衝液ｐｔ＋７．。

１０．０に０．１Ｍグリシル−チロシンと１０ｍ）ｊグ
リシル−プロリル−ｐ−ニトロアニリド（Ａ　？＆　）
または、０．１Ｍグリシル−ロイシンと１０ｍＭグリシ
ル−プロリル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニ
リド（Ｂ液）を溶解させた。Ｂ液にはさらに２ｍＭキシ
レノール、２Ｕ／ｍｊ２ポリフェノールオキシダーゼを
添加した。

Ａ液を波長４Ｑ５ｎｍで、Ｂｌ＃を５９０ｎｍで１分間
当りの吸光度変化を測定した。

実施例２ 尿０．０２　ｍｌに０．１５　Ｍビシンー水酸化カリウ
ム緩衝ン夜ｐ８９．１に０．１Ｍグリシン−ロイシン、
３ｍＭ　　キシレノール、２Ｕ／Ｌ　　ポリフェノール
オキシダーゼを含む溶液　０．２５ｍ１と４５ｍＭグリ
シン−プロリル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシア
ニリド水溶液０．　１　ｍｌを添加して、自動分析機日
立７０５によって、波長６００　ｎｍにおいて尿中のＧ
Ｄ−ＤＡＰ活性を測定した（本測定法）。

また、尿０．０１５ｍ１に０．１９Ｍ）リス塩酸緩衝、
′夜ｐｏ　７．９に７５　ｍＭ　　グリシル−グリシン
を含む）容ンＪ１０．３　ｍｌ　と４１　ｍＭグリシル
−プロリル−ニトロアニリドを添加して、同様に自動分
析機により波長４０５　ｎｍにおいて尿中のＧＰ−ＤＡ
Ｐ活性を測定した（従来法）。

実施例３ ０．１　Ｍ　）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８）に０．１ｍ
Ｍρ−ニトロアニリンを溶解した液の波長４０５ｎｍに
おける吸光度を測定し、モル吸光係数を計算した。０．
１Ｍビシンー水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ８゜２）に２
ｍＭキジル−ル、２Ｕ／ｍｆポリフェノールオキシダー
ゼ、０．０７　ｍＭ　２．６−ジブロモ−４ア旦ノフェ
ノールを溶解した液の波長５９０ｎｍにおける吸光度を
測定し、モル吸光係数を計算した。

（発明の効果） 本発明の前記一般式（１）で表されるジペプチ誘導体は
、ｐＨ９，０以上での安定性向上と、従来法との相関性
も高く、また、吸光係数の大きな化合物を誘導すること
ができるため測定限界も従来の化合物に比べ極めて良好
である。

殊に、ｐＨ９，０以上で安定であることから、肝疾患の
診断のみならず、腎疾患の診断特に尿細管再吸収障害の
診断に利用できる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）一般式（ I ）で表される化合物 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中、Ｘ＿１およびＸ＿２はハロゲン原子である）お
   よびグリシルプロリル−ジペプチジルアミノペプチダー
   ゼ（以下ＧＰ−ＤＡＰと省略する）を含む被検液とを反
   応させ、次いで生成するアミン化合物をカプラーおよび
   酸化酵素と反応させ、形成される色素を測定することを
   特徴とするＧＰ−ＤＡＰ活性の測定法。
2. （２）酸化酵素がポリフェノールオキシダーゼまたはア
   スコルビン酸オキシダーゼである特許請求の範囲第１項
   記載の測定法。