JPH03130095A - 酵素活性の測定法 - Google Patents
酵素活性の測定法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明はグリシルプロリル−ジペプチジルアミノペプチ
ダーゼ(以下GP−DAPと省略する)の活性測定法に
関するものである。更に詳しくは、一般式(1)で表さ
れる化合物 1 2 (式中、Xlおよびx2はハロゲン原子である)および
CP−DAPを含む被検液とを反応させ、生成するアミ
ン化合物をカプラーおよび酸化酵素と反応させ、形成さ
せる色素を測定するCP−DAPの活性測定法に関する
。
ダーゼ(以下GP−DAPと省略する)の活性測定法に
関するものである。更に詳しくは、一般式(1)で表さ
れる化合物 1 2 (式中、Xlおよびx2はハロゲン原子である)および
CP−DAPを含む被検液とを反応させ、生成するアミ
ン化合物をカプラーおよび酸化酵素と反応させ、形成さ
せる色素を測定するCP−DAPの活性測定法に関する
。
(従来の技術)
従来CP−DAP活性測定法は、主に、血清を検体とし
て肝疾患の診断に用いられてきたが、近年、尿中のCP
−DAP力鮎疾患の診断にも利用できることが報告され
ている(医学のあゆみ128巻、10号 645−64
6頁)。この測定は、通常、グリシル−プロリル−p−
ニトロアニリンを基質として用いてCP−DAPにより
遊離されるp−ニトロアニリンの比色定量を行なう測定
法であった。
て肝疾患の診断に用いられてきたが、近年、尿中のCP
−DAP力鮎疾患の診断にも利用できることが報告され
ている(医学のあゆみ128巻、10号 645−64
6頁)。この測定は、通常、グリシル−プロリル−p−
ニトロアニリンを基質として用いてCP−DAPにより
遊離されるp−ニトロアニリンの比色定量を行なう測定
法であった。
(発明が解決しようとする問題点)
しかしながら、尿中CP−DAPと血清中CP−DAP
活性測定の至適条件は、前者がpH7,9であり、後者
がpH9,0付近であるため、p)18以上では不安定
なグリシル−プロリル−p−ニトロアニリンに代わる基
質を用いた活性測定法が当業者の間で強く望まれていた
。
活性測定の至適条件は、前者がpH7,9であり、後者
がpH9,0付近であるため、p)18以上では不安定
なグリシル−プロリル−p−ニトロアニリンに代わる基
質を用いた活性測定法が当業者の間で強く望まれていた
。
(問題を解決するための手段)
本発明者らは、従来の欠点を克服するべく検討した結果
、前記一般式で表される化合物(1)が活性測定条件の
pH9付近でも十分安定なことから本願発明の方法を見
いだし完成した。
、前記一般式で表される化合物(1)が活性測定条件の
pH9付近でも十分安定なことから本願発明の方法を見
いだし完成した。
本発明の基質として使用する前記一般式(1)で表され
るジペプチド誘導体は、−S式Y−Gly−OH(II
) (式中、Yはt−ブトキシカルボニル4 (Boc)、
ベンジルオキシカルボニル基(Z)、p−メトキシベン
ジルオキシカルボニル基(Z (OMe))等のウレタ
ン型保護基である。) で表されるグリシン誘導体と一般式 (式中、Xl及びX2はハロゲン原子である。)で表さ
れるプロリン誘導体とを反応させ、次いで脱保護反応に
付すことにより製造することができる。
るジペプチド誘導体は、−S式Y−Gly−OH(II
) (式中、Yはt−ブトキシカルボニル4 (Boc)、
ベンジルオキシカルボニル基(Z)、p−メトキシベン
ジルオキシカルボニル基(Z (OMe))等のウレタ
ン型保護基である。) で表されるグリシン誘導体と一般式 (式中、Xl及びX2はハロゲン原子である。)で表さ
れるプロリン誘導体とを反応させ、次いで脱保護反応に
付すことにより製造することができる。
前記一般式(n)で表されるグリシン誘導体は、工業的
に入手容易な化合物であり、前記一般式(II[)で表
されるプロリン誘導体は、2.6−シハロー4−アミノ
フェノールとプロリンとから容易に得ることができる化
合物である(下記参考側参照)。
に入手容易な化合物であり、前記一般式(II[)で表
されるプロリン誘導体は、2.6−シハロー4−アミノ
フェノールとプロリンとから容易に得ることができる化
合物である(下記参考側参照)。
本願発明は前記一般式(1)で表わされるジペプチド誘
導体が、GP−DAPの作用により加水分解されて、一
般式 (式中、xIおよびX2は前記と同し)で表わされるア
えン化合物が生威し、このアミン化合物が酸化酵素の作
用によりカプラーと酸化縮合して発色化合物を形成する
原理に基づくものである。
導体が、GP−DAPの作用により加水分解されて、一
般式 (式中、xIおよびX2は前記と同し)で表わされるア
えン化合物が生威し、このアミン化合物が酸化酵素の作
用によりカプラーと酸化縮合して発色化合物を形成する
原理に基づくものである。
前記一般式(1)で表わされるジペプチド誘導体とGP
−DAPとの反応は、通常37°C付近で1分以上反応
を行い、前記一般式(IV)のアミン化合物が生成する
このCP−DAP酵素の至適pHは7.5〜9.5であ
り、この範囲内でpHを設定すればよい。この時用いる
緩衝液は、リン酸塩、ホウ酸塩、トリスヒドロキシメチ
ルアミノエタン、グツドバッファー等が用いられる。
−DAPとの反応は、通常37°C付近で1分以上反応
を行い、前記一般式(IV)のアミン化合物が生成する
このCP−DAP酵素の至適pHは7.5〜9.5であ
り、この範囲内でpHを設定すればよい。この時用いる
緩衝液は、リン酸塩、ホウ酸塩、トリスヒドロキシメチ
ルアミノエタン、グツドバッファー等が用いられる。
生成した前記一般式(■)のアミン化合物はカプラー共
存下酸化酵素と反応させ、酸化縮合して発色化合物を形
成させる。
存下酸化酵素と反応させ、酸化縮合して発色化合物を形
成させる。
使用するカプラーは、下記一般代
れる化合物。
(V)
で表さ
(式中、R9は水酸基、アミノ基または置換アミノ基を
示し、R,、R1,R,、R6またはR6は水素原子、
ハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ア
ミノ基、置換アミノ基、水酸基、カルボキシ基またはス
ルホ基を示し、またはR3およびR6は一緒になって環
を形成してもよい基である)である。その代表的なカプ
ラーとしては、例えばフェノール、サリチル酸、m−ヒ
ドロキシ安息香酸、2.6−ジヒドロキシ安息香酸、2
−ア藁ノー3−ヒドロキシ安息香酸、2−ヒドロキシ−
5−アくノ安息香酸、ρ−ヒドロキシ安息香酸、サリチ
ル酸メチル、0−メチルフエノール、m−メチルフェノ
ール、p−メチルフェノール、0−メトキシフェノール
、m−メトキシフェノール、p−メトキシフェノール、
0−クロロフェノール、m−クロロフェノール、p−ク
ロロフェノール、2.3−ジメチルフェノール、2.4
−ジメチルフェノール、2.5−ジメチルフェノール、
2.6−ジメチルフェノール、3,5−ジメチルフェノ
ール、2.6−ジクロロフェノール、0−アミノフェノ
ール、m−アミノフェノール、p−ブロムフェノール、
0−エチルフェノール、m−エチルフェノール、2,4
−ジクロロフェノール、2,4ジブロムフエノール、2
.6−ジブロムフェノール、2.6−ジプロムー4−ア
ミノフェノール、2.6ジクロロー4−アミノフェノー
ル、2.6−シメトキシフエノール、2−メチル−6−
クロロフェノール、2−クロロ−5−メチルフェノール
、2アミノ−4−クロロフェノール、N、N−ジエチル
−m−アミノフェノール、2−アごノー4−メチルフェ
ノール、0−力ルボキシメチルフェノール、2−カルボ
キシ−4−アごノフェノール、3.4ジヒドロキシフエ
ネチルアミン、α−ナフトール、β−ナフトール、4−
クロロ−1−ナフトール、2−カルボキシ−l−ナフト
ール、■−ヒドロキシー2−ナフトエ酸、1−ナフトー
ル−2−スルホン酸、l−ナフトール−3−スルホン酸
、1−ナフトール−4−スルホン酸、1−ナフトール−
8−スルホン酸、2−ナフトール−6−スルホン酸、2
−ナフトール−7−スルホン酸、2−ナフトール−8−
スルホン酸、2−ナフトール−3,6ジスルホン酸、2
−ナフトール−6,8−ジスルホン酸、N、N−ジエチ
ル−m−アミノアニリン、N、N−ジメチル−m−アミ
ノアニリン、0−カルボキシアニリン、m−カルボキシ
アニリン、〇−クロロアニリン、m−クロロアニリン、
m−ブロムアニリン、0−メチルアニリン、m−メチル
アニリン、N、N−ジメチルアニリン、N、N−ジエチ
ルアニリン、N、N−エチル・エチルヒドロキシアニリ
ン、N、N−エチル・エチルヒドロキシメタトルイジン
、3−アミノ−4−クロロアニリン、2−メチル−3−
クロロアニリンなどが挙げられる。
示し、R,、R1,R,、R6またはR6は水素原子、
ハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ア
ミノ基、置換アミノ基、水酸基、カルボキシ基またはス
ルホ基を示し、またはR3およびR6は一緒になって環
を形成してもよい基である)である。その代表的なカプ
ラーとしては、例えばフェノール、サリチル酸、m−ヒ
ドロキシ安息香酸、2.6−ジヒドロキシ安息香酸、2
−ア藁ノー3−ヒドロキシ安息香酸、2−ヒドロキシ−
5−アくノ安息香酸、ρ−ヒドロキシ安息香酸、サリチ
ル酸メチル、0−メチルフエノール、m−メチルフェノ
ール、p−メチルフェノール、0−メトキシフェノール
、m−メトキシフェノール、p−メトキシフェノール、
0−クロロフェノール、m−クロロフェノール、p−ク
ロロフェノール、2.3−ジメチルフェノール、2.4
−ジメチルフェノール、2.5−ジメチルフェノール、
2.6−ジメチルフェノール、3,5−ジメチルフェノ
ール、2.6−ジクロロフェノール、0−アミノフェノ
ール、m−アミノフェノール、p−ブロムフェノール、
0−エチルフェノール、m−エチルフェノール、2,4
−ジクロロフェノール、2,4ジブロムフエノール、2
.6−ジブロムフェノール、2.6−ジプロムー4−ア
ミノフェノール、2.6ジクロロー4−アミノフェノー
ル、2.6−シメトキシフエノール、2−メチル−6−
クロロフェノール、2−クロロ−5−メチルフェノール
、2アミノ−4−クロロフェノール、N、N−ジエチル
−m−アミノフェノール、2−アごノー4−メチルフェ
ノール、0−力ルボキシメチルフェノール、2−カルボ
キシ−4−アごノフェノール、3.4ジヒドロキシフエ
ネチルアミン、α−ナフトール、β−ナフトール、4−
クロロ−1−ナフトール、2−カルボキシ−l−ナフト
ール、■−ヒドロキシー2−ナフトエ酸、1−ナフトー
ル−2−スルホン酸、l−ナフトール−3−スルホン酸
、1−ナフトール−4−スルホン酸、1−ナフトール−
8−スルホン酸、2−ナフトール−6−スルホン酸、2
−ナフトール−7−スルホン酸、2−ナフトール−8−
スルホン酸、2−ナフトール−3,6ジスルホン酸、2
−ナフトール−6,8−ジスルホン酸、N、N−ジエチ
ル−m−アミノアニリン、N、N−ジメチル−m−アミ
ノアニリン、0−カルボキシアニリン、m−カルボキシ
アニリン、〇−クロロアニリン、m−クロロアニリン、
m−ブロムアニリン、0−メチルアニリン、m−メチル
アニリン、N、N−ジメチルアニリン、N、N−ジエチ
ルアニリン、N、N−エチル・エチルヒドロキシアニリ
ン、N、N−エチル・エチルヒドロキシメタトルイジン
、3−アミノ−4−クロロアニリン、2−メチル−3−
クロロアニリンなどが挙げられる。
C,P−DAPの酵素反応と発色化合物形成の縮合反応
が酵素の至適pH範囲7.5〜9.5で行うことができ
、これらの反応を連続して行うことができる。
が酵素の至適pH範囲7.5〜9.5で行うことができ
、これらの反応を連続して行うことができる。
また酸化酵素としては、ポリフェノールオキシダーゼ、
アスコルビン酸オキシダーゼ等を用いることができる。
アスコルビン酸オキシダーゼ等を用いることができる。
前記一般式(IV)と前記一般式(V)で表されるカプ
ラーとの酸化縮合反応により形成される発色化合物の極
大吸収波長は550〜650nmに分布する青色系であ
り、生体試料中のビリルビンやヘモグロビン等の夾雑物
の影響も受けにくいため、CP−DAPの酵素活性測定
を容易にしかも高感度に行うことができる。
ラーとの酸化縮合反応により形成される発色化合物の極
大吸収波長は550〜650nmに分布する青色系であ
り、生体試料中のビリルビンやヘモグロビン等の夾雑物
の影響も受けにくいため、CP−DAPの酵素活性測定
を容易にしかも高感度に行うことができる。
(作 用)
本発明は各反応ステップが簡単なため、測定の自動化が
容易にでき、更に、用いる基質が安定であるためブラン
クが低いことから、従来の測定方法に比べ、迅速かつ正
確にGP−DAPの酵素活性を測定できる。更に、生成
する発色化合物が通常は550〜650nm付近に極大
吸収があるため生体試料中の夾雑物の影響を受けにくい
。本発明によるGP−DAPの酵素活性測定法はきわめ
て精度の高い方法である。
容易にでき、更に、用いる基質が安定であるためブラン
クが低いことから、従来の測定方法に比べ、迅速かつ正
確にGP−DAPの酵素活性を測定できる。更に、生成
する発色化合物が通常は550〜650nm付近に極大
吸収があるため生体試料中の夾雑物の影響を受けにくい
。本発明によるGP−DAPの酵素活性測定法はきわめ
て精度の高い方法である。
以下、参考例及び実施例により本発明を更に詳細に説明
する。
する。
参考例1
遊離の2,6−ジプロモー4−アミノフェノールの言周
製 蒸留水400mj2に炭酸水素ナトリウム21g(0,
25mol )を溶かした。2.6−ジブロモ−47く
ノフェノールH(/2SnCffi 229.15 g
(0,059mol )をこれに添加し、均一に懸濁し
た。更に、酢酸エチル405mfを加えて室温で5〜l
O分間強く撹拌した。これにハイフロス−パーセル(1
5gals/5q−ft/hour半井製)10〜20
gを加えて懸濁後、ろ過した。このろ液の酢酸エチル層
を得、これを無水硫酸ナトリウムで乾燥後、2.6−ジ
プロモー4−アミノフェノールを得た。
製 蒸留水400mj2に炭酸水素ナトリウム21g(0,
25mol )を溶かした。2.6−ジブロモ−47く
ノフェノールH(/2SnCffi 229.15 g
(0,059mol )をこれに添加し、均一に懸濁し
た。更に、酢酸エチル405mfを加えて室温で5〜l
O分間強く撹拌した。これにハイフロス−パーセル(1
5gals/5q−ft/hour半井製)10〜20
gを加えて懸濁後、ろ過した。このろ液の酢酸エチル層
を得、これを無水硫酸ナトリウムで乾燥後、2.6−ジ
プロモー4−アミノフェノールを得た。
参考例2
Boc−L−プロリル−3,5−ジブロモ−4−ヒドロ
キシアニリドの合成 Boc −L−プロリン6.21 g (0,029m
ol )をジクロロメタン70mfに溶かした。さらに
、2.6ジブロモー4−アミノフェノール7.7g(0
,029mol )を加えて懸濁させた。これを水中で
冷却しく10″C前後)、1−エチル−3(3−ジメチ
ルアミノブロビル)カルボシイ柔ド塩酸塩4.16 g
(0,032mol )を添加した。添加10分後、
反応液に発熱が無ければ、室温で1時間撹拌した。これ
に、ジクロロメタン140nlを加えてから、5%炭酸
水素ナトリウム、蒸留水、10%クエン酸、蒸留水の順
で各3回ずつ洗浄した。
キシアニリドの合成 Boc −L−プロリン6.21 g (0,029m
ol )をジクロロメタン70mfに溶かした。さらに
、2.6ジブロモー4−アミノフェノール7.7g(0
,029mol )を加えて懸濁させた。これを水中で
冷却しく10″C前後)、1−エチル−3(3−ジメチ
ルアミノブロビル)カルボシイ柔ド塩酸塩4.16 g
(0,032mol )を添加した。添加10分後、
反応液に発熱が無ければ、室温で1時間撹拌した。これ
に、ジクロロメタン140nlを加えてから、5%炭酸
水素ナトリウム、蒸留水、10%クエン酸、蒸留水の順
で各3回ずつ洗浄した。
TLC(3%メタノール−97%ジクロロメタンの展開
溶媒)でニンヒドリン発色させ、2.6−ジプロモー4
−アミノフェノールが無いことを確認後、無水硫酸ナト
リウムで乾燥したのち、溶媒を留去しBoc−L−プロ
リル−3,5−ジブロモ−4−ヒドロキシアニリドを得
た。収率75%。
溶媒)でニンヒドリン発色させ、2.6−ジプロモー4
−アミノフェノールが無いことを確認後、無水硫酸ナト
リウムで乾燥したのち、溶媒を留去しBoc−L−プロ
リル−3,5−ジブロモ−4−ヒドロキシアニリドを得
た。収率75%。
r
NMR(CDCfz、 δ)
1.50 (9H,s)、1.80−2.10(3H
,m) 、22.5−2.45 (1)1. m)
3.30−3.60 (’2H,m) 、4.304
.60 (LH,m) 、5.70 (LH,s)
7.68 (2H,s)、9.60(IH,bra
)融点 89.2−92.2°C 参考例3 L−プロリル−3,5−ジブロモ−4−ヒドロキシアニ
リド塩酸塩の合成 水中でBoc−L−プロリル−3,5−ジブロモ4−ヒ
ドロキシアニリド10 g (0,022mol )に
、3.4N塩化水素を含むジオキサン溶液65mf(0
,22mol )を加えて撹拌した。発熱がなげれば、
室温で1時間撹拌すると、白い結晶が析出した。これに
エーテル400mj!を加えて、更に結晶を析出させ、
これをグラスフィルターでろ取し、エーテル100〜2
00mff1で洗浄した。得られた結晶は水酸化ナトリ
ウム存在下で、減圧下乾燥しI7−ブロリルー3.5−
ジブロモ−4−ヒドロキシアニリド塩酸塩を得た。
,m) 、22.5−2.45 (1)1. m)
3.30−3.60 (’2H,m) 、4.304
.60 (LH,m) 、5.70 (LH,s)
7.68 (2H,s)、9.60(IH,bra
)融点 89.2−92.2°C 参考例3 L−プロリル−3,5−ジブロモ−4−ヒドロキシアニ
リド塩酸塩の合成 水中でBoc−L−プロリル−3,5−ジブロモ4−ヒ
ドロキシアニリド10 g (0,022mol )に
、3.4N塩化水素を含むジオキサン溶液65mf(0
,22mol )を加えて撹拌した。発熱がなげれば、
室温で1時間撹拌すると、白い結晶が析出した。これに
エーテル400mj!を加えて、更に結晶を析出させ、
これをグラスフィルターでろ取し、エーテル100〜2
00mff1で洗浄した。得られた結晶は水酸化ナトリ
ウム存在下で、減圧下乾燥しI7−ブロリルー3.5−
ジブロモ−4−ヒドロキシアニリド塩酸塩を得た。
r
NMR
融点
(3H,m) 、2.40−
m、) 、3.30−3.50
4.30−4.40 (L H、m )、5)
88.5°C
(CDsOD 、 δ)
2、05−2.20
2.60(LH。
(IH,m) 、
7.78(2H。
184.5−1
参考例4
Boc−グリシル−L−プロリル−3,5−ジブロモ−
4−ヒドロキシアニリドの合成 Boc −’l”)シン−N−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル(Boc −Gly −03u ) 3.5
g (0,013mol )をジオキサン100mj
2に溶かしておく(完全には溶解しない)。また、L−
プロリル3.5−ジブロモ−4−ヒドロキシアニリド塩
酸塩を蒸留水100mfに溶かし、更に炭酸水素ナトリ
ウム3.3gを加えて懸濁液を得た。この懸濁液に前述
のBoc Gly−OSuジオキサン溶液を添加し、
室温で撹拌した。約15分後、反応液が透明な液になっ
た後、蒸留水11を加えて白色結晶を析出させた。この
結晶を酢酸エチル350+nj!で2回抽出する。この
抽出液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、蒸留水、10
%クエン酸、蒸留水の順で250n+423回ずつ洗浄
し、さらに酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後
溶媒を留去してBoc−グリシル−し−プロリル−3,
5−ジブロモ−4−ヒドロキシアニリドを得た。収率7
4%。
4−ヒドロキシアニリドの合成 Boc −’l”)シン−N−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル(Boc −Gly −03u ) 3.5
g (0,013mol )をジオキサン100mj
2に溶かしておく(完全には溶解しない)。また、L−
プロリル3.5−ジブロモ−4−ヒドロキシアニリド塩
酸塩を蒸留水100mfに溶かし、更に炭酸水素ナトリ
ウム3.3gを加えて懸濁液を得た。この懸濁液に前述
のBoc Gly−OSuジオキサン溶液を添加し、
室温で撹拌した。約15分後、反応液が透明な液になっ
た後、蒸留水11を加えて白色結晶を析出させた。この
結晶を酢酸エチル350+nj!で2回抽出する。この
抽出液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、蒸留水、10
%クエン酸、蒸留水の順で250n+423回ずつ洗浄
し、さらに酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後
溶媒を留去してBoc−グリシル−し−プロリル−3,
5−ジブロモ−4−ヒドロキシアニリドを得た。収率7
4%。
Br
NMR(CDCj23 、 δ)
1.47 (9H,s)、1.80−2.00(LH,
m) 、2.00−2.20 (2H。
m) 、2.00−2.20 (2H。
m) 、2.45−2.60 (L H,m) 3.3
5−3.50 (IH,m) 、3.50−3.65(
IH,m)、 3.97 (2H,d)、4.70−4
.80 (2H,m) 、5.35(IH,s)、
5.75 (IH,s)、7.71 (2H,s)、
9.35 (LH,s)融点 118.0123.O
°C 参考例5 グリシル−L−プロリル−3,5−ジブロモ−4ヒドロ
キシアニリド塩酸塩の台底 水中でBoc−グリシル−L−プロリル−3,5−ジブ
ロモ−4−ヒドロキシアニリド5g(9,59mmol
)を3.4N塩化水素を含むジオキサン溶液28 me
(95,9mmol)を添加し、発熱がなければ室温
で1時間撹拌した。白色の結晶が析出してくる。これに
エーテル200mnを加えて充分結晶を析出させたのち
グラスフィルターでこの結晶をろ取し、エーテル50+
+/!で洗浄した。この結晶を水酸化ナトリウム存在下
、減圧下乾燥してグリシル−L−プロリル−3,5−ジ
ブロモ−4−ヒドロキシアニリド塩酸塩を得た。収率9
9%。
5−3.50 (IH,m) 、3.50−3.65(
IH,m)、 3.97 (2H,d)、4.70−4
.80 (2H,m) 、5.35(IH,s)、
5.75 (IH,s)、7.71 (2H,s)、
9.35 (LH,s)融点 118.0123.O
°C 参考例5 グリシル−L−プロリル−3,5−ジブロモ−4ヒドロ
キシアニリド塩酸塩の台底 水中でBoc−グリシル−L−プロリル−3,5−ジブ
ロモ−4−ヒドロキシアニリド5g(9,59mmol
)を3.4N塩化水素を含むジオキサン溶液28 me
(95,9mmol)を添加し、発熱がなければ室温
で1時間撹拌した。白色の結晶が析出してくる。これに
エーテル200mnを加えて充分結晶を析出させたのち
グラスフィルターでこの結晶をろ取し、エーテル50+
+/!で洗浄した。この結晶を水酸化ナトリウム存在下
、減圧下乾燥してグリシル−L−プロリル−3,5−ジ
ブロモ−4−ヒドロキシアニリド塩酸塩を得た。収率9
9%。
Br
NMR
(CD30D 、 δ)
1.90−2.20 (3H,m) 、2.202.
40 (L H,m) 、3.50−3.75(2H
,m) 、3.92 (2H,s)、4.50−4.6
0 (L H,m) 、7.74(2H,s) 融点 232−235. O°C 実施例工 0、1 Mビシンー水酸化カリウム緩衝液pt+7.。
40 (L H,m) 、3.50−3.75(2H
,m) 、3.92 (2H,s)、4.50−4.6
0 (L H,m) 、7.74(2H,s) 融点 232−235. O°C 実施例工 0、1 Mビシンー水酸化カリウム緩衝液pt+7.。
10.0に0.1Mグリシル−チロシンと10m)jグ
リシル−プロリル−p−ニトロアニリド(A ?& )
または、0.1Mグリシル−ロイシンと10mMグリシ
ル−プロリル−3,5−ジブロモ−4−ヒドロキシアニ
リド(B液)を溶解させた。B液にはさらに2mMキシ
レノール、2U/mj2ポリフェノールオキシダーゼを
添加した。
リシル−プロリル−p−ニトロアニリド(A ?& )
または、0.1Mグリシル−ロイシンと10mMグリシ
ル−プロリル−3,5−ジブロモ−4−ヒドロキシアニ
リド(B液)を溶解させた。B液にはさらに2mMキシ
レノール、2U/mj2ポリフェノールオキシダーゼを
添加した。
A液を波長4Q5nmで、Bl#を590nmで1分間
当りの吸光度変化を測定した。
当りの吸光度変化を測定した。
実施例2
尿0.02 mlに0.15 Mビシンー水酸化カリウ
ム緩衝ン夜p89.1に0.1Mグリシン−ロイシン、
3mM キシレノール、2U/L ポリフェノール
オキシダーゼを含む溶液 0.25m1と45mMグリ
シン−プロリル−3,5−ジブロモ−4−ヒドロキシア
ニリド水溶液0. 1 mlを添加して、自動分析機日
立705によって、波長600 nmにおいて尿中のG
D−DAP活性を測定した(本測定法)。
ム緩衝ン夜p89.1に0.1Mグリシン−ロイシン、
3mM キシレノール、2U/L ポリフェノール
オキシダーゼを含む溶液 0.25m1と45mMグリ
シン−プロリル−3,5−ジブロモ−4−ヒドロキシア
ニリド水溶液0. 1 mlを添加して、自動分析機日
立705によって、波長600 nmにおいて尿中のG
D−DAP活性を測定した(本測定法)。
また、尿0.015m1に0.19M)リス塩酸緩衝、
′夜po 7.9に75 mM グリシル−グリシン
を含む)容ンJ10.3 ml と41 mMグリシル
−プロリル−ニトロアニリドを添加して、同様に自動分
析機により波長405 nmにおいて尿中のGP−DA
P活性を測定した(従来法)。
′夜po 7.9に75 mM グリシル−グリシン
を含む)容ンJ10.3 ml と41 mMグリシル
−プロリル−ニトロアニリドを添加して、同様に自動分
析機により波長405 nmにおいて尿中のGP−DA
P活性を測定した(従来法)。
実施例3
0.1 M )リス−塩酸緩衝液(pH8)に0.1m
Mρ−ニトロアニリンを溶解した液の波長405nmに
おける吸光度を測定し、モル吸光係数を計算した。0.
1Mビシンー水酸化カリウム緩衝液(pH8゜2)に2
mMキジル−ル、2U/mfポリフェノールオキシダー
ゼ、0.07 mM 2.6−ジブロモ−4ア旦ノフェ
ノールを溶解した液の波長590nmにおける吸光度を
測定し、モル吸光係数を計算した。
Mρ−ニトロアニリンを溶解した液の波長405nmに
おける吸光度を測定し、モル吸光係数を計算した。0.
1Mビシンー水酸化カリウム緩衝液(pH8゜2)に2
mMキジル−ル、2U/mfポリフェノールオキシダー
ゼ、0.07 mM 2.6−ジブロモ−4ア旦ノフェ
ノールを溶解した液の波長590nmにおける吸光度を
測定し、モル吸光係数を計算した。
(発明の効果)
本発明の前記一般式(1)で表されるジペプチ誘導体は
、pH9,0以上での安定性向上と、従来法との相関性
も高く、また、吸光係数の大きな化合物を誘導すること
ができるため測定限界も従来の化合物に比べ極めて良好
である。
、pH9,0以上での安定性向上と、従来法との相関性
も高く、また、吸光係数の大きな化合物を誘導すること
ができるため測定限界も従来の化合物に比べ極めて良好
である。
殊に、pH9,0以上で安定であることから、肝疾患の
診断のみならず、腎疾患の診断特に尿細管再吸収障害の
診断に利用できる。
診断のみならず、腎疾患の診断特に尿細管再吸収障害の
診断に利用できる。
Claims (2)
- (1)一般式( I )で表される化合物 ▲数式、化学式、表等があります▼( I ) (式中、X_1およびX_2はハロゲン原子である)お
よびグリシルプロリル−ジペプチジルアミノペプチダー
ゼ(以下GP−DAPと省略する)を含む被検液とを反
応させ、次いで生成するアミン化合物をカプラーおよび
酸化酵素と反応させ、形成される色素を測定することを
特徴とするGP−DAP活性の測定法。 - (2)酸化酵素がポリフェノールオキシダーゼまたはア
スコルビン酸オキシダーゼである特許請求の範囲第1項
記載の測定法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP24398588A JPH03130095A (ja) | 1988-09-30 | 1988-09-30 | 酵素活性の測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP24398588A JPH03130095A (ja) | 1988-09-30 | 1988-09-30 | 酵素活性の測定法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH03130095A true JPH03130095A (ja) | 1991-06-03 |
Family
ID=17111995
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP24398588A Pending JPH03130095A (ja) | 1988-09-30 | 1988-09-30 | 酵素活性の測定法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH03130095A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006201176A (ja) * | 2005-01-21 | 2006-08-03 | Dade Behring Marburg Gmbh | 安定な発色性試験用試薬および凝固診断試験におけるその使用 |
-
1988
- 1988-09-30 JP JP24398588A patent/JPH03130095A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006201176A (ja) * | 2005-01-21 | 2006-08-03 | Dade Behring Marburg Gmbh | 安定な発色性試験用試薬および凝固診断試験におけるその使用 |
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