JPH03130090A

JPH03130090A - ポリグルタミン酸およびその塩の製造法

Info

Publication number: JPH03130090A
Application number: JP2197386A
Authority: JP
Inventors: Koyo Kanegae; 鐘ケ江　幸洋; Yoshio Sugiyama; 杉山　良雄; Isamu Nakatsui; 中對　勇
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1989-07-26
Filing date: 1990-07-25
Publication date: 1991-06-03
Also published as: US5268279A; EP0410638A2; KR910003109A; EP0410638A3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は食品、化粧品、医薬品、繊維等の分野において
、機能性原料として利用が期待されるポリグルタミン酸
とその塩の発酵製造法に関する。

従来の技術従来、ポリグルタミン酸の製造法としては、有機合成法
がよく知られているが、これは、多数の複雑な反応によ
り、グルタミン酸を重合させる方法であり、工業的に有
利な製造法とはいえない。

一方、微生物を用いた発酵生産についても、１９４２年
のＢｏｖａｒｎ　ｉｃｋの研究以来、数多くの報告がな
されている。たとえば、ジャーナル・オブ・バタテリオ
ロジーＱ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）ヱ亙。

４９９　（１９５８）、日本農芸化学会誌１ヱ、４７４
（１９６３）あるいは高分子上皇、　　１２０４　（１
９６７）などのように、バチルス（Ｂａｃ　ｉ　ｌ　１
ｕｓ）属曹を培養するポリグルタミン酸の製造法が知ら
れている。

発明が解決しようとする課題上記のように、微生物がポリグルタミン酸を産生ずるこ
とが知られており、化学的合成法よりも発酵製造法の方
が工業的に有利と考えられる。しかし、本物質を各種用
途に輻広く利用するためには、さら１こ収量を増大させ
て安価に供給することが望まれている。

課題を解決するための手段そこで、本発明者らは発酵製造法におけるポリグルタミ
ン酸の収量増大法について、培地組成の面から種々検討
した結果、本発明を完成したものである。

すなわち、本発明はポリグルタミン酸を産生する能力を
有する微生物を、アルカリ土類金属イオンを０．０５モ
ル以上含有する培地で培養することを特徴とするポリグ
ルタミン酸およびその塩の製造法である。

本発明の製造法に用いられる微生物は、ポリグルタミン
酸生産菌であればよく、その分類上の位置はいかなるも
のであってもよい。とりわけ、バチルス属に属するポリ
グルタミン酸生産菌が、有利に用いられる。このような
バチルス属の微生物としては、バチルス・ズブチリス（
ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂＬｉｌｉｓ）、バチルス・リケ
ニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍ
ｉｓ）などの生産菌があげられる。

さらに具体的な菌株例としては、バチルス・ズブチリス
５−２（Ｉｐｏ　　１４８９８．ＦＥＲＭｓｐ−２５２
８）あるいはバチルス・リケニホルミスＩＦ０　１２１
０７などが生産菌の代表的なものとしてあげられる。Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　　５ｕｂｔｉｌｉｓＳ−２株はＢａｃ
ｉｌｌｕｓ　　５ｕｂｔｉｌｉｓ　　Ｉ　Ｆ　Ｏｌ　４
１８７（特開昭５９−４２８９５号）よりＮＴＧ処理を
行い誘導された“糸引き能″の強い変異株である。

その誘導の具体的な方法としては、ＩＱ当り５０ｇのグ
ルコース、１５ｇのグルタミン酸モノナトリウム、２．
７ｇのＫＨ２ＰＯ４，４，２ｇのＮａ２ＨＰＯ，−１２
Ｈ，Ｏ，０，５ｇのＮａＣＱ、　０．５ｇのＭｇＳ○、
・７Ｈ，０，２ｍｇのＭｎＳＯ４・ｎＨ２Ｏ。

１００μｇのビオチン、１５ｇの寒天を含む培地（ｐＨ
７，０）にＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−二トロング
アニンで処理しｔ；親株を塗布し、生じたコロニーにつ
いて“糸引き能“を調べ、その能力の強い菌株を選択す
ればよい。

ＩＦｏ　　１２１０７株は、財団法人　発酵研究所（Ｉ
ＦＯ）寄託されている公知株であり、同研究所発行のリ
スト・オブ・カルチャーズ（Ｌｉｓｔ　ｏｆＣｕｌｔｕ
ｒｅｓ）第８版（１９８８）に掲載されている。

一般に、バチルス属菌はその性状が変化しやすく、例え
ば、自然的あるいはＸ線照射、紫外線照射、放射性照射
１人工変異剤を用いる人工変異手段などで容易に変異し
うる。このような変異株であっても、ポリグルタミン酸
を生産する能力を有するものは、いずれも末法の方法に
使用しうる。

本発明において、培地に添加されるアルカリ土類金属イ
オンとしては、カルシウムイオン、マグネシウムイオン
あるいはバリウムイオンがあげられる。これらイオンの
供給物質は、特に限定されないが、炭酸塩、水酸化物、
リン酸塩、硝酸塩等が好ましく、特に炭酸塩、水酸化物
で添加するのが好ましい。アルカリ土類金属イオン供給
物質の添加方法としては、培地に直接に添加しても良く
、またグルタミン酸を培地成分、たとえば基質として使
用する場合には、予じめグルタミン酸とアルカリ土類金
属塩を混合、中和して使用する方法が最も好ましい。

アルカリ土類金属イオン供給物質は、初発培地に含有せ
しめてもよいし、培養時に添加してもよく、添加量の一
部を初発培地に残部を培養時に添加することもできる。

一般に、培養開始後、５〜６時間までに所定量の大部分
を添加し終えておく方が有利である。アルカリ土類金属
イオン供給物質の種類によっては、本培地におけるｐＨ
ｒｊ＃整剤を兼ねて添加することもできる。培地のｐＨ
は、通常、６〜７．５の範囲から選定されるが、好まし
くはｐＨ約６．５〜７，０範囲で培養される。

アルカリ土類金属イオンは、培地中に０．０５モル以上
含有せしめればよいが、好ましくは０．１−０．２モル
の範囲である。グルタミン酸を基質として用いる場合は
、アルカリ土類金属イオンがグルタミン酸に対しｌ／２
モル前後となるように添加するのが好ましい。

その他の培地成分としては、通常のポリグルタミン酸発
酵に用いられる培地成分が利用される。

たとえば、炭素源としては、ブドウ糖、果糖、蔗糖、粗
糖、糖蜜（例えば、甜菜糖蜜、甘蔗糖蜜）。

各種澱粉（例えば、タピオカ、サゴヤシ、甘藷。

馬鈴薯、トウモロコシ）の糖化液などである。また窒素
源としては、ペプトン、大豆粉、コーン・ステイープ・
リカー、酵母エキス、肉エキス、尿素などの有機窒素源
のほか、硫酸、硝酸、塩酸。

炭酸などのアンモニウム塩、アンモニアガス、アンモニ
ア水などの無機窒素源がそれぞれ単独もしくは混合して
用いられる。その他該菌の生育に必要な各種の無機塩類
、たとえば、カルシウム、力リウム、ナトリウム、マグ
ネシウム、マンガン。

鉄、銅、亜鉛などの硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、リン酸塩
、酢酸塩などを、また該菌の生育に必要なアミノ酸類、
ビタミン類などを適宜選択して、それらを単独または組
合せて添加して用いられる。

さらに必要に応じて、シリコンオイルなどの消泡剤を添
加しても良い。

因みに、バチルス属菌などのポリグルタミン酸生産菌が
、培地中において生育するに必要なカルシウム量は約０
．７ミリモル、またマグネシウム量は約２ミリモル程度
である。

また、培地のｐＨは前記のとおりに調整するのが好まし
く、培養中にｐＨの変動があれば、これを望ましい範囲
に修正するため、例えば、アンモニアガス、アンモニア
水、尿素、水酸化アルカリなどを適宜補添すればよい。

培養の温度は使用される微生物の至適生育温度などを考
慮して適宜に選択すればよく、通常約２５℃ないし４０
°Ｃの範囲で培養される。培養時間はポリグルタミン酸
の蓄積量が最大に達するまで培養すればよく、通常２０
時間ないし７２時間培養すればその目的は達成される。

本発明の製造法でいうポリグルタミン酸塩は、培養に用
いたアルカリ土類金属イオンとの塩が主体であるが、一
部培地戊分として添加されているその他の金属との塩も
含まれる。これらのポリグルタミン酸塩は、自体公知の
手段によって分離・精製すればよく、必要に応じて遊離
のポリグルタミン酸、あるいはナトリウム塩、カリウム
塩、アンモニウム塩などその用途を考慮して適宜に変換
せしめることもできる。

実施例以下に実験例および実施例を挙げて、本発明をさらに具
体的に説明する。

実験例１バチルス・ズブチリスＳ−２（ＩＦＯ１４８９８、ＦＥ
ＲＭ　　ＢＰ−２５２８）を表−１の種培地に接種し、
３７℃で１６時間種培養した。

表−ｌグルコース　　　　　　　　　　４０尿素　　　　　　３（ＮＨ＜）ｔＳＯ４１ＭｇＳＯ，−７Ｈ２０２ＣａＣＱ、　　　　　　２ＦｅＳ○ｔ、・７Ｈｔｏ　　　　Ｏ−０２コーンステイ
ープリカー　　　１０この培養液６０−を、１２０℃２０分間滅菌した表−２
に示す各組成の培地２Ｑに移植し、通気量ＩＩ２／ｍｉ
ｎ、撹拌数８０　Ｏｒｐｍ、温度３７°Ｃで２４時間培
養した。培養中はアンモニア水を用いてｐＨ６，５に維
持・修正した。

（以下余白）表−２（ｇ／＋１）（注１）各培地にはビオチン１００μｇ／Ｑを添加。

（注２）Ｌ−グルタミン酸とＣａＣＯ５は予じめ上記の
量比で水に溶解・中和し、別途成苗し、混合した。

さらに、表−２の培地（１）、　（２）および（３）に
おいてＣａＣＯ３の代りにＭｇＣＯ、を４．３，６．４
５および８．６ｇ／Ｑを含む各培地を用いて同様に培養
した。

得られた各培養液中のポリグルタミン酸量は、培養液を
適宜・希釈してから遠心分離法により除菌した上溝を用
い、比色法によって定量した。尚、比色法は鳥井光雄９
　「光電光色法　各論２ＪｐＨＯ（編集、関根隆光、笹
用泰治、森田茂広、木村徳次、倉富−興、南江堂　１９
５８年）によった。定量の結果を表−３に示す。

表−３表−３に示したように、Ｃａ　ＣＯＳ　、　Ｍ　ｇ　Ｃ
Ｏ３を添加することにより、Ｌ−グルタミン酸添加量の
増加に応じて、ポリグルタミン酸量が向上した。なお、
ＮＨ，ＯＨ，ＮａＯＨ，ＫＯＨについても同様に添加試
験をしたが、Ｌ−グルタミン酸の添加量を２倍まで増加
させても、ポリグルタミン酸の収量はほとんど向上が認
められなかった。

実験例２表−２の培地組成（２１２分）において、グルコース６
０ｇ、Ｌ−グルタミン酸６０ｇ、またＣ　ａＣＯｓにつ
いては２ｇ、５ｇ、１０ｇ、２０ｇ、３０ｇ、４０ｇの
容量を含有する培地を調製した。ここで、Ｌ−グルタミ
ン酸とＣａＣＯ３は予じめ混合し、１２１’Ｃ！。

２０分間滅菌後、他の培地成分と合せた。これらの培地
を用いて、実験例１と同様にバチルス・ズブチリスＳ−
２（ＩＦＯ１４８９８，ＦＥＲＭＢＰ−２５２８）を種
菌として、５Ｑ容ジャーファーメンタ−で培養した。こ
のときの、ポリグルタミン酸の蓄積量を測定した結果を
表−４に示す。

これらの結果から明らかなようにＣａ　ＣＯｓの添加量
に比例して、ポリグルタミン酸蓄積量が順次向上し、Ｃ
ａＣＯｓ　　ｌ　ＯｇＩＱで約２２ｇＩＱのポリグルタ
ミン酸が得られた。全く同様な実験をＭｇＣＯ５につい
ても行ったところ、表−５に示したように、Ｍｇｃｏ、
の添加量に応じてポリグルタミン酸の蓄積量が向上し、
ＭｇＣＯ３１０ｇ／Ｑ以上の添加によりポリグルタミン
酸の蓄積量は２２ｇ／Ｑにも達していた。

表−４表−５実施例Ｉ純水３００−に対し、Ｌ−グルタミン酸６０ｇを懸濁させ、Ｃａ（ＯＨ）２．Ｍｇ（ＯＨ）ｚを各々１４
゜８ｇ、１１．６ｇ添加、中和し、５００−に定容して
、滅菌した。又グルコース濃度を３０ｇ／Ｑとした表−
２の培地を２Ｑ分調製し、１．５Ｑに定容し、５ｆｆ容
ジヤー７アーメンターに投入し、１２１’Ｃ！、２０分
間滅菌した。一方、表−Ｉの種培地で培養したＢａｃｉ
ｌｌｕｓ　　５ｕｂｔｉｌｉｓ　　Ｓ−２（ＩＦＯ１４
８９８，ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２５２８）を６０−移植し
、前記のとおり調製したＬ−グルタミン酸とＣａ（ＯＨ
）、またはｌＪｇ（ＯＨ）ｚとの各中和物を添加し、実
験例１と同一の培養条件で２４時間培養したところ、培
養液中にポリグルタミン酸が表＝６の通り蓄積されてお
り、明らかに蓄積量が増加しＩこ。

表−６実施例２純水１５０−に対しＬ−グルタミン酸３０ｇを懸濁させ
、それにＣａＣＯ３ｌｏｇを添加後、２５０−に定容し
た液を２本調製した。一方、グルコース３０ｇ／Ｑ含む
表−２の主培地を２ａ分調製し、１．５αに定容し、５
Ｑ容ジヤー７アーメングーに投入し、１２１℃、２０分
間滅菌した。これに実験例１と同様にＢａｃｉｌｌｕｓ
　　５ｕｂＬｉｌｉｓ　Ｓ−２（ＩＦＯ１４８９８，Ｆ
ＥＲＭ　　ＢＰ−２５２８）を６０−移植し、上記のＬ
−グルタミン酸カルシウム液を１本分添加し、培養を開
始した。培養６時間目に残りのＬ−グルタミン酸カルシ
ウムを６時間にわたってフィードし２４時間培養したと
ころ、ポリグルタミン酸蓄積量２４．５ｇ／Ｉ２の培養
液が約１．９５Ｑ得られた。本液にエタノールｉ、ｏｃ
に徐々に添加したところ繊維状の沈澱が生成した。

本液をガーゼで？濾過し、沈澱を得、さらに減圧乾燥し
、ポリグルタミン酸カルシウム４５．３ｇが得られた。

発明の効果ポリグルタミン酸およびその塩の発酵法による製造にお
いて、培地中にアルカリ土類金属イオンを０．０５モル
以上含有せしめるという極めて簡単な方法によりポリグ
ルタミン酸の蓄積量を著しく向上させることができる。

本発明によると培養物からポリグルタミン酸塩の採取、
精製操作も従来より容易であり、この面からも工業的に
優れた製造法である。

Claims

【特許請求の範囲】

ポリグルタミン酸を産生する能力を有する微生物を、ア
ルカリ土類金属イオンを０．０５モル以上含有する培地
で培養することを特徴とするポリグルタミン酸およびそ
の塩の製造法。