JPH03110447A - 光音響を用いた粒子の測定方法、装置及びこれを利用した免疫測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、光音響を用いた微粒子の濃度、含有量、数密
度等の測定に係り、特に測定しようとする粒子状物質の
ほかに妨害粒子が共存する試料に適した測定方法、及び
装置に関する。

〔従来の技術〕

従来より、試料に特定波長を有する励起光を照射し、こ
れにより発生する音響を検出して、試料中の特定粒径の
光吸収物質を測定する、いわゆる光音響分光法が知られ
ている。

光音響分光法は、高感度な吸光度測定法を実現するもの
として評価され、最近では水中の微粒子を測定する手段
としての応用が文献のＡｎａｌｙｔｉｃａｌ　　Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ、１９８７，５９．２５１９−２５２２　
（アナリティ力ルケミストリー１９８７年５９巻２５１
９頁から２５２２頁）等でも報告されている。

光音響を用いた測定法は、１粒子あたりに発生する光音
響信号強度が励起光波長に依存して変化し、励起光波長
にほぼ一致する粒子径で共鳴的に増強されることを利用
する。すなわち、検出すべき径の粒子（測定対象粒子）
で共鳴する励起光波長を試料に照射する方法が採用され
る。

ところで、生化学分野では、血清や尿中の生体微量成分
を定量することが臨床上非常に重要となっている。

特に生化学分析では、今までよりも測定下限を超える低
濃度成分分析の必要性が急速に高まっており、これを実
現するための免疫的な分析方法（免疫測定法）ならびに
その装置の開発が進められている。

免疫測定法は、大別して２つに分けられる。

一つは、試料と試薬を反応させ１反応物を洗浄分別する
ことなく測定するホモジニアス法で、もう一つは、試料
と試薬を反応させた後に、未反応物を反応物と分離、洗
浄する過程を有するヘテロジニアス法である。前者は、
後者に較べて測定操作及び装置が簡便であり、測定も短
時間で完了する利点を有しているが、測定下限で劣ると
いう傾向がある。

そこで、ホモジニアス法の高感度化が各種の方法で試み
られている。その一つとして、光音響分光法を検出手段
とする方法が試みられている（前出のアナリティカルケ
ミストリー５９巻１９８７年２５１９頁から２５２２頁
）、この方法は、抗体を吸着させたラテックス粒子と抗
原を反応させ、生じたラテックス粒子凝集体と抗原を光
音響効果を利用して測定する方法であり、散乱光強度あ
るいは吸光度を検出して測定する方法に較べ高感度化が
実現できるものとして期待される。

〔発明が解決しようとする課題〕

前述したように光音響を用いて粒子濃度等を測定する場
合には、測定対象粒子の粒子径にほぼ一致する励起光波
長を照射するが、検出された光音響信号には、測定対象
粒子による信号以外に共存する他の径の粒子（妨害粒子
）による信号成分も包含され１粒子径選択性が低く、こ
れが測定精度を低下させる原因となっている。

従って、光音響の測定技術を免疫測定に応用した場合に
おいても、未反応による遊離ラテックス粒子（妨害粒子
）等によるバックグラウンドノイズの問題が発生し、こ
れを解決することが望まれる。

バックグラウンドを補正する従来の方法としては、試料
のほかにバックグラウンドのみを与える参照液を用意し
て、これらの液を同一波長の励起光で励起し、その出力
信号（音響検出信号）の差分を求める方法がある。

しかしながら、上記の方法では、測定対象粒子が抗原抗
体反応等で生成される凝集体等の場合には、その補正が
不完全である。なぜなら、参照液の粒子が不変的なもの
であるのに対し、実際の試料中では、反応等によりバッ
クグラウンドを与える粒子（前出の抗原抗体反応の場合
には遊離ラテックス粒子がこれに該当する）の径が変化
するので、その変化分を読み取れないためである。

例えば、ラテックス凝集免疫測定方法では、バックグラ
ウンドを与えるラテックス試薬中の遊離ラテックスの一
部が抗原との結合により凝集し、粒径が大きくなるため
、バックグラウンドレベルが低下する。また、この補正
方法は、各測定毎に参照液を準備する必要があること、
２系統の測定系間の特性を同等に保つ必要性があるなど
、実際面の問題点も合わせもつ。

本発明は以上の点に鑑みてなされたもので、その目的と
するところは、光音響分光法による粒子計測において、
粒子径選択性を向上させ、例えば、上記免疫測定の問題
点である遊離ラテックス粒子や試薬、試料中の在来粒子
によるバックグラウンドノイズの影響を排除し、高感度
測定を実現させることにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、上記目的を達成する基本的な課題解決手段（
これを第１の課題解決手段とする）として、次のような
測定法を提案する。

すなわち、試料に特定波長を有する励起光を照射し、こ
れにより発生する音響を検出して、試料中の特定粒径の
光吸収物質を測定する方法において。

照射すべき励起光を少なくとも２つの異なる特定波長と
して、測定しようとする測定対象粒子と。

これと共存する他の径の粒子（妨害粒子）に関して、予
め前記各特定波長の励起光による１粒子あたりの音響信
号強度をそれぞれ求めておき。

試料中の測定対象粒子の測定を行う場合には。

試料に前記複数の異なる特定波長の励起光を照射し、こ
れにより生じた各音響検出値及び予め求めた前記１粒子
あたりの音！！！Ｉｌ信号強度等を用いて試料中の未知
量たる測定対象粒子の濃度、量、数密度等のいずれかを
算出する。

二二で、励起光には、高出力なレーザが有効である。ま
た、共存粒子の粒径分布が広範囲にわたる場合には、キ
セノンランプ等の白色光をカットフィルタ等で分別して
波長分散の広い光を用いるのが有効である。

また、本発明では、少なくとも２つの異なる特定波長、
換言すれば複数波長の励起光を試料に照射するわけであ
るが、各波長励起光の照射時期は同時であっても、時期
を異ならせてもよい、同時照射の場合には、異なる特定
波長の励起光を互いに異なる変調周波数にして、発生す
るそれぞれの音響検出信号を、各変調周波数に同期させ
て弁別して抽出すればよい。

また、上記基本的な課題解決手段を応用したものとして
、次のようなものを提案する。

その一つ（第２の課題解決手段とする）は、測定しよう
とする測定対象粒子と、これと共存する妨害粒子に関し
て、予め特定波長λ１の励起光による粒子濃度・音響検
出信号の検量線Ｋ１、に２をそれぞれ作成すると共に。

前記妨害粒子に関するもう一つの検量線として、該妨害
粒子に対しては顕著な音響信号を生じさせ。

前記測定対象粒子に対しては、無視できる程度の僅かな
音響信号しか発生させない波長λ２（λ１≠λ２）の励
起光による粒子濃度・音響検出信号の検量線に３を作成
し、 このλ２励起光による前記妨害粒子の検量線に３と前記
λ１励起光による前記妨害粒子の検量線に２との換算デ
ータを作成し、 試料中の測定対象粒子の測定を行う場合には、前記複数
の異なる波長λ１．λ２の励起光を試料に照射して、そ
れぞれの音響検出信号ＰＬ、Ｐ２を得ると共に、このう
ち波長λ２の励起光照射により生じた音響検出信号Ｐ２
と前記換算データを用いて、前記λ１励起光照射による
音響検出信号Ｐ１に含まれる前記妨害粒子に起因するノ
イズ信号成分ＰＬ’を求め、 前記音響検出信号Ｐ１とノイズ信号成分Ｐ１′との差か
ら、測定対象粒子の濃度、量、数密度等のいずれかを算
出する。

さらに、第３の課題解決手段としては、次のような測定
方法を提案する。

すなわち、試料中にて微粒子に凝集反応を起こさせ、こ
の反応により生じる凝集体の濃度、量。

数密度のいずれかを測定する方法において、反応前に前
記試料に複数の異なる特定波長λ１゜λ２の励起光を照
射して、反応前の微粒子から生じる各波長λ１．λ２の
音響信号Ａ１、Ａ２を検出し。

反応後に前記試料に特定波長λ１．λ２の励起光を照射
し、この励起光照射により生じる音響信号Ｂ１、Ｉ３２
を検出し、 反応前の前記励起波長λ１．λ２により発生させた音響
信号Ａ１、Ａ２の比と、反応後の前記励起波長λ２によ
り発生させた音響信号Ｂ２から。

音響信号Ｂ２に対してＡ１、Ａ２と同一比となるような
音響信号成分Ｂ１′を算出し、且つ、前記音響信号Ｂ１
と音響信号Ｂ１′の差から凝集体の濃度、量、数密度等
のいずれかを算出する。

第４の課題解決手段は、第１の課題解決手段を生化学分
野における免疫測定法に応用したもので、次のような免
疫測定方法を提案する。

すなわち、第４の課題解決手段は、抗体（または抗原）
付き微粒子を主成分とする試薬と、試料とを混合し、試
料中に含まれた抗ＪｊＸ　（または抗体）と前記試薬の
抗体（または抗原）との反応により生じる微粒子の凝集
を検出して、試料中の抗原あるいは抗体の濃度、量、数
密度２反応量等のいずれかを求める測定法において、 前記微粒子の凝集の検出は、試料に励起光を照射して生
じる音響信号により行う光音響測定方式且つ、照射すべ
き励起光を少なくとも２つの異なる特定波長として、測
定しようとする凝集体と。

妨害粒子となる微粒子に関して、予め前記各波長の励起
光による１粒子あたりの音響検出信号強度をそれぞれ求
めておき。

抗原・抗体反応後には、反応後の前記試料に前記複数の
異なる特定波長の励起光を照射し、これにより生じた各
音響検出値及び予め求めた前記１粒子あたりの音響信号
強度等を用いて未知量たる凝集量を算出し、この算出量
から抗原あるいは抗体の濃度、量、数密度２反応量等の
いずれかを求める。

さらに、第５の課題解決手段は、第３の課題解決手段を
応用して、次のような免疫測定法を提案する。

すなりち、試料中の抗原・抗体反応により生じる微粒子
の凝集を検出して、試料中の抗原あるいは抗体の濃度、
量、数密度９反応量等のいずれかを求める測定方法にお
いて。

反応前に前記試料に異なる特定波長λ１．λ２の励起光
を照射して、反応前の抗体（または抗原）付き微粒子か
ら生じる各波長λ１．λ２の音′ａ信号Ａ１、Ａ２を検
出し。

反応後に前記試料に特定波長λ１．λ２の励起光を照射
し、この励起光照射により生じる音響信号Ｂ１、Ｂ２を
検出し。

反応前の前記励起波長λ１．λ２により発生させた音響
信号Ａ１、Ａ２の比と１反応後の前記励起波長λ２によ
り発生させた音響信号Ｂ２から、音響信号Ｂ２に対して
Ａ１、Ａ２と同一比となるような音響信号成分Ｂ１′を
算出し、且つ、前記音響信号Ｂ１と音響信号Ｂ１′の差
から抗原あるいは抗体の濃度、量、数密度１反応量等の
いずれかを算出する。

また、第６．第７の課題解決手段は、これらの光音響を
利用した測定方法を具現化する次のような装置を提案す
る。

第６の課題解決手段は、構成要素として。

（イ）試料に特定波長の励起光を照射する光学系で、少
なくとも２つの異なる波長の励起光を別々に出力する複
数系の光源を有し、これらの光源のうちの一方の励起光
は、試料中の測定対象粒子に共鳴的な音響信号を発生さ
せる波長で、他方の励起光は、共存する妨害粒子に共鳴
的な音響信号を発生させる波長で出力するよう設定され
。

（ロ）且つ、前記複数の異なる波長の励起光を試料収容
の測定セルに導く手段と、 （ハ）励起光照射により発生する試料からの音響を検出
する手段と、 （ニ）検出された音響信号を、それぞれの波長の励起光
ごとの信号として弁別して、レコーダに記録させる手段
とを、備えてなる。

第７の課題解決手段は、第６の課題解決手段の構成要素
（イ）〜（ハ）までは、共通するが、更に、（ニ）′の
要素として、前記複数の異なる波長の励起光をそれぞれ
試料に照射した時に発生する音響検出信号や、予め前記
具なる波長の励起光との関係で求めた前記測定対象粒子
及び妨害粒子の１粒子あたりの音響信号強度を用いて、
方程式的な演算機能ににより未知量たる測定対象粒子の
量、濃度、数密度等のいずれかを算出する手段（算出手
段は、代表的なものとしてマイクロコンピュータがあげ
られる）とを、備える。

〔作用〕

まず、第１の課題解決手段の作用を説明する。

ここでは、光音響信号の発生する信号源（粒子）を２種
の粒子（一つは測定対象粒子Ａ、もう一つは共存する妨
害粒子Ｂ）の混合系として説明する。

検出すべき粒子径ｒ＾の粒子Ａが粒子数ＮＡ個とし、妨
害信号を与える粒子径ｒ、の粒子Ｂが粒子数Ｎ１個共存
している試料で、粒子数ＮＡ、Ｎｈを未知量とする。

しかして、本発明では、粒子Ａ、Ｂが共存する実際の試
料に異なる波長λ１．λ２の励起光を照射する前に、測
定しようとする測定対象粒子Ａと。

これと共存する妨害粒子Ｂに関して、予め波長λ１、λ
２の励起光照射で生じる１粒子あたりの音響信号強度を
それぞれ求めておく。

ここで、波長λ１の励起光を粒子Ａに照射した時に得ら
れる１粒子あたりの音響信号強度をα、いとし、波長λ
１の励起光を粒子Ｂに照射した時の１粒子あたりの音響
信号強度をα、１とし、波長λ２の励起光を粒子Ａに照
射した時の１粒子あたりの音響信号強度をα工、とじ、
波長λ２の励起光を粒子Ｂに照射した時の１粒子あたり
の音響信号強度をα□１とする。これらの音響信号強度
は、実験で容易に求められる。

また、これらの音響信号強度を求めていることを前提と
して、測定対象粒子Ａ及び妨害粒子Ｂの共存する試料に
異なる波長λ１．λ２の励起光を実際に照射する。試料
に波長λ１の励起光照射した場合に得られる信号Ｐ１は
１次のようになる。

Ｐ１＝αＩＡＮＡ＋α１ヵＮ、　　・・・（１）同様に
試料に波長λ２の励起光照射した場合に得られる信号Ｐ
２は、次のようになる。

Ｐ２＝α！ＡＮＡ＋α□Ｎ！ｌ　・・・（２）しかして
、（１）、（２）式から連立方程式をたてれば、測定対
象粒子Ａの粒子数（或いは粒子濃度９粒子量）ＮＡが求
められる。

なお、上記−粒子あたりの音響信号強度α１゜α２は、
予め粒子Ａのみを入れた懸濁液と、粒子Ｂのみを入れた
懸濁液のそれぞれに粒子濃度を変えて、各波長の励起光
照射を行って得られる音響信号検出値の検量線を作成す
ることで求められる。

また、上記作用では、（１）、（２）の方程式をたてて
、未知量たる測定対象粒子を算出しているが、これに類
する求解により測定対象粒子を算出することも可能であ
る１例えば、以下に述べる第２の課題解決手段では、方
程式に類するものとして検量線の換算データを用いて測
定対象粒子の算出を行っている。

第２の課題解決手段を、第２図を引用して説明する。

ここでは、波長λ１の励起光をＹＡＧレーザ（イツトリ
ウム・アルミニウム・ガーネット）レーザから出力し、
波長λ２の励起光をＡｒレーザから出力するものとする
。また、測定対象粒子を１．０μｍ粒子とし、これと共
存する妨害粒子を０．５μｍ粒子とする。

また、−例として、未知量たる測定対象粒子の濃度を５
ｐｐｍ一定としておき、共存する妨害粒子の濃度を変化
させた場合を例示した。

本課題解決手段では、測定対象粒子及び妨害粒子に関し
て、予め波長λ１の励起光による粒子濃度・音響検出信
号の検量線Ｋ１、に２をそれぞれ作成しておくわけであ
るが、この検量線Ｋ１、に２は第２図ａに示される。

また、妨害粒子に関するもう一つの検量線として、該妨
害粒子に対しては顕著な音響信号を生じさせ、測定対象
粒子に対しては、無視できる程度の僅かな音響検出信号
しか発生させない波長λ２の励起光による粒子濃度・音
響検出信号の検量線に３を予め作成する。これは第２図
Ｃで表される。

すなわち、第２図Ｃの検量線に３は、はとんど妨害粒子
の検量線といいえる。

第２図ｄはこの換算データを示し、縦軸かに３検量線対
応のもの、横軸かに２対応のものとする。

しかして１本課題解決手段では、試料中の測定対象粒子
の測定を行う場合には、上記予備工程を行った上で、試
料に波長λ１．λ２の励起光を照射する。この時に、波
長λ１の励起光照射により試料から生じた音響検出信号
Ｐ１は、第２図すのようになる。

この第２図すの音響検出信号Ｐ１は、従来の単一励起光
を試料に照射して得られる測定値に相当するが、測定対
象粒子の信号成分のほかに妨害粒子のノイズ信号成分Ｐ
１′を含むので、これだけでは、測定精度に劣る。

そのため、本課題解決手段では、波長λ２の励起光照射
により生じた音響検出信号Ｐ２と第２図ｄの換算データ
を用いて、音響検出信号Ｐ１に含まれる前記妨害粒子に
起因するノイズ信号成分Ｐ１′を求める。

すなわち、波長λ２の励起光は、測定対象粒子に対して
は、無視できる程度の音響信号しか発生させないので、
これを試料に照射して発生した音響検出信号Ｐ２は、は
とんどが妨害粒子に関する信号としてみなすことができ
る。従って、このＰ２を第２図ｄの換算データを用いて
、波長Ａ１照射で生じた音響信号Ｐ１の中の妨害粒子の
信号成分Ｐ１′を求めることが可能となるわけである。

従って、波長Ａ１照射による前記音響検出信号Ｐ１とノ
イズ信号成分Ｐ１′との差から、妨害粒子の影響をほと
んど排除した測定対象粒子の濃度。

量、数密度等のいずれかが算出可能となる。

最終的な演算処理信号値（測定結果）は、第２図ｅとな
る。

次に第３の課題解決手段の作用を第３図ｃ、ｄを引用し
て説明する。なお、第３図のａ、ｂ、ｅは免疫反応たる
ラテックス凝集反応の原理及び測定効果を示もので、こ
れは、実施例の項で後述する。

本課題解決手段は、微粒子に凝集反応を起こさせた場合
の、凝集体の濃度ｔｆｉｔ数密度のいずれを測定する方
法に関する。

測定に際しては、予め反応前の試料に複数の異なる特定
波長λ１．λ２の励起光を照射するが、この時に得られ
た音響検出信号は、第３図のＣのようになる。音響検出
信号Ａ１、Ａ２は、凝集反応前の微粒子から生じた信号
で、Ａ１は波長λ１の励起光照射により、Ａ２は波長λ
２の励起光照射により生じる。ここでは、凝集反応前の
微粒子が、波長λ１よりも波長λ２の励起光により顕著
な音響信号を発するものとしている。ちなみに、反応前
のＡ１の音響信号Ａ１は、凝集体が存在しないので、微
粒子からのノイズということになる。

反応後に試料に特定波長λ１．λ２を照射する。

この時に試料から生じる音響信号Ｂ１、Ｂ２は第３図ｄ
のようになる。この場合の検出信号強度は、励起波長Ａ
２対応のものが減り、Ａ１対応のものが増加している。

これは、凝集反応が生じた結果、凝集体に対し顕著な音
響信号を発生させるＡ１の信号強度が当然増加し１反面
、遊離微粒子（非凝集微粒子）に対し顕著な音響信号を
発生させる励起波長Ａ２対応のものは、凝集による遊離
微粒子の減少分だけ信号強度が低下するためである。

凝集反応後の励起波長λ１により生じた音響検出信号Ｂ
１は、凝集体からの音響信号成分（斜線で囲む部分）の
ほかに遊離微粒子からのノイズ信号成分Ｂ１′が含まれ
る。

そして、Ｂ２とＢ１′の比は、反応前の音響検出信号Ａ
２とＡ１と同一の比としてとらえることができるので、
既知の検出信号Ａ２．ＡＩ及びＢ２から、計算によりノ
イズ信号成分Ｂ１′が求められる。

従って１反応後の音響信号成分Ｂ１からノイズ信号成分
Ｂ１′を差し引けば、ノイズを除去した凝集体の音響検
出信号（Ｂｌ−Ｂ１′）が求められる。

第４の課題解決手段は、第１の課題解決手段の測定方法
をそのまま応用した免疫測定法、第５の課題解決手段は
、第３の課題解決手段をそのまま応用した免疫測定法で
、この場合には、８ｍ定対象粒子が抗原・抗体反応によ
る微粒子凝集体となり、妨害粒子（遊離微粒子）が抗体
付き微粒子に該当する。その作用は、第１．第３の課題
解決手段と同様である。

第６．第７の課題解決手段は、特に（イ）の構成要素を
備えることで、試料中の測定対象粒子及び共存する妨害
粒子から、前述した第１から第５課題解決手段（測定法
）に必要な、未知量（測定対象粒子）を求めるための音
響検出信号、検量線等を演算データとして発生させるこ
とが可能となる。

すなわち、複数系の励起光光源のうち、測定対象粒子に
共鳴的な音響検出信号を発生させる光源は、前述の各課
題解決手段で述べたＡ１励起光を出力させ、妨害粒子に
共鳴的な音響検出信号を発生させる光源は、Ａ２励起光
を出力させる光源となる。

そして、第６課題解決手段では１、励起光λ１゜Ａ２の
励起光照射により生じた音響検出信号を検出し、これを
各波長励起光ごとの信号に弁別して、記録させるので、
この記録された音響検出データにより、方程式或いはこ
れに類する求解を行うことで、未知量たる測定対象粒子
の算出が行われる。

一方、第７の課題解決手段では、（ニ）′の構成要素を
備えることで、マイクロコンピュータ等の演算手段を用
いて、測定対象粒子の未知量を自動的に算出する。

〔実施例〕

本発明の実施例を図面により説明する。

第１図は本発明の第１実施例を示す光音響を用いた測定
装置のシステム構成図である。

第１＠において、ｌａ、ｌｂはレーザ光源、２ａ、２ｂ
は光チョッパ、３は光学ミラー、４はハーフミラ−であ
る、これらの要素により、複数の波長の異なる励起光光
学系を構成する。

レーザ光源１ａ、ｌｂは、それぞれ波長を異にするレー
ザ光（励起光）を出力するように設定され、これらのレ
ーザ光源１ａ、ｌｂから発するレーザ光は、光チョッパ
２ａ、２ｂでそれぞれ一定周波数の断続的な光として変
調され、光学ミラー３及びハーフミラ−４により共通の
光路８に導かれる。ここで、レーザ光を変調するのは、
励起光を断続的に試料に照射して、照射される粒子に励
起エネルギーを繰返しあたえ、音響信号を繰返し発生さ
せるためである。

その後、レーザ光は測定セル５を通過し、ビームストッ
パ６に入る。

測定セル５に導かれる光源１ａ、ｌｂからの２種のレー
ザ光は、シャッタ７ａ及び７ｂで選択されてセル５に導
かれる。そのため、シャッタ７ａ。

７ｂは、レーザ光源１ａ、ｌｂの光路を、一方が開いて
いる時は他方が閉じるような切換動作を行う。

試料液９は、ポンプｌＯによりバルブ１１を通って測定
セル５に導入され、出口１２より排出される。

測定セル５の中央外周には、圧電素子１３が配置され、
レーザ光により励起されて発生する音響信号を検出する
。検出される音響信号は、前置増幅器１４で増幅された
後、ロックインアンプ１５に入る。

ロックインアンプ１５は、変調周波数に同期した音響信
号をレコーダ１７に出力、記録する。

１６ａ、１６ｂは、光チョッパ２ａ、２ｂに設けたフォ
トカブラで、これらのフォトカプラにより各レーザ光の
変調周波数をモニタして、ロックインアンプ１５に入力
させている。

本実施例では、このような装置を用いることで、本発明
の〔作用〕の項で詳述した各粒子測定を実現させている
。

以下、その測定例を具体化して説明する。

レーザ光源１ａ、ｌｂの一方は、レーザとしてアルゴン
（Ａｒ）レーザ：発振波長（４８８ｎｍ）を、他方はＹ
ＡＧ　（イツトリウムアルミニウムガーネット）レーザ
：発振波長１１０６０ｎを用いる。また、圧電素子１３
には、円筒形に加工したＰＺＴ素子を用いた。光チョッ
パ２ａ、２ｂによる変調周波数は１８０　Ｈｚとした。

また、測定対象粒子は、粒径が１．０μｍのポリスチレ
ンラテックス粒子で、妨害粒子は粒径が０．５μｍのポ
リスチレンラテックス粒子としである。すなわち、試料
は、１．０μｍ粒子と０゜５μｍ粒子が共存する懸濁液
である。

ＹＡＧレーザから出力される波長１１０６０ｎのレーザ
光は、１．０μｍ粒子に対して共鳴的な音響を生じさせ
、Ａｒレーザから出力される４８８ｎｍのレーザ光は０
．５μｍ粒子に対して共鳴的な音響を生じさせる。

例えば、発明の〔作用〕の項で既述の第１の課題解決手
段の粒子測定を、この具体例にあてはめると、まず、１
．０μｍ粒子（測定対象粒子）及び０．５μｍ粒子（妨
害粒子）に関して、予め異なる波長１１０６０ｎ、４８
８ｎｍのレーザ光による１粒子あたりの音響信号強度α
Ｌ＾、αＩＢを求めておく。

この予備工程は、１．０μｍ粒子のみの懸濁液。

及び０．５μ粒子のみの懸濁液を１粒子濃度を変えつつ
前記具なる波長の励起光を照射して、それぞれの粒子濃
度・音響検出信号の検量線を作成すれば、その検量線の
傾きから求めることができる。

これは実験的に容易に求まる。

この予備工程を前提として、未知量たる１．０μｍ粒子
、０．５μｍ共存の試料を測定セル５に導入して１例え
ば、レーザ光源（ＹＡＧレーザ）１ａから波長１１０６
０ｎのレーザ光を、レーザ光源（Ａｒレーザ）ｌｂから
波長４８８ｎｍのレーザ光を、選択的に測定セル５に照
射する。そして、このレーザ光照射により、励起波長１
１０６０ｎ照射による音響検出信号Ｐ１と、励起波長４
８８ｍ照射による音響検出信号Ｐ２とが圧電素子１３を
介して出力される。これらの検出信号は。

ロックインアンプ１５を介してレコーダ１７に記録され
る。そして、このレコーダに記録されたデータＰＬ、Ｐ
２と前記１粒子あたりの信号強度に関するデータで既述
の（１）、（２）式の連立方程式をたてることが可能と
なる。

また、第２の課題解決手段の測定方法を実行する場合に
は、まず第２図ａに示すように、予め、１．０μｍ粒子
ＯＪＡ定対象粒子）ｅ　Ｏ−５μｍ粒子（妨害粒子）に
関して、波長１１０６０ｎのＹＡＧレーザ励起による検
量線Ｋ１、に２を実験的に求めておく、さらに、０．５
μ粒子に関して第２図Ｃのように、波長４８８ｎｍのＡ
ｒレーザ励起による検量線に３と、第２図ｄのように検
量線に２．に３の換算データを作成しておく、なお、１
．０μｍ粒子はＡｒレーザ励起がなされても、音響検出
信号しか発生させないものとしであるので、ここでは、
データをして無視しである。

そして、未知量たる１．０μｍ粒子、０．５μｍ粒子共
存の試料を測定セル５に導入して、ＹＡＧレーザ及びＡ
ｒレーザを選択的に照射する。

第２図すは、この時の試料にＹＡＧレーザ励起を行って
得られた音響検出信号Ｐ１の一例であり、Ｐ１′が検量
線換算データから求めた０、５μｍ粒子のノイズ信号成
分であること、及び第２図ｄの線図は、これらの演算処
理を通して得られた１゜０μ粒子の測定結果であること
は、既述した通りである。

この換算による求解方式を、方程式として表現すれば、 Ｐ＋＝α、ＡＮＡ＋α１ＢＮＢ＝αＩＡＮＡ＋　Ｐ　１
　’・・・（３）として、表すことができる。

次にこの装置を、第５の課題解決手段の免疫測定方法に
実行する具体例を、第３図により説明する。

第３図ａ及びｂに免疫反応たるラテックス凝集反応の原
理を示す。

ラテックス粒子１８の表面に抗体１９が結合されており
、これらの一部が抗ｉ２０と反応して凝集体２１が生じ
る。この抗原抗体反応により増加した凝集体の量を評価
することにより、抗原量が測定できる。

これを第１図の光音響効果を利用した装置により測定し
た場合の測定結果を模式的に示せば、第３図Ｃ及びｄと
なる０反応前は、第３図Ｃに示すように、試料に励起波
長λ１　（１０６０ｎｍ）。

λ２　（４８８ｎ　ｍ）のレーザ光をそれぞれ照射する
と、これらの波長に対応して、遊離ラテックス１８の濃
度に比例した音響検出信号Ａ１、Ａ２がそれぞれ得られ
る。この場合の音響検出信号Ａ１、Ａ２は、双方共に遊
離ラテックス１８に関する検出信号であるが、λ２の場
合の方が共鳴的な信号を発するために、λ１より大きい
。

励起波長λ１は、凝集体２１に共鳴的な音響検出信号を
生じさせるものであり、反応前には、凝集は生じていな
いので、音響検出信号Ａ１は、ノイズ信号成分となる。

反応後に、試料に波長λ１．λ２のレーザ光を照射する
と、第３図ｄに示すような音響検出信号Ｂ１．Ｂ２が得
られる。この場合の検出信号強度は、励起波長λ２対応
のものが減り、λ１対応のものが増加している。その理
由は、遊離ラテックス１８の一部が抗原抗体反応により
凝集体となるので、遊離ラテックス１８自体は減り、そ
の分、凝集体２１の数が増えることを意味している。

すなわち、励起波長λ１の音響検出信号Ｂ１の内訳は、
斜線で囲む部分の凝集体２１本来の検出信号と、白抜き
で表すノイズ信号成分Ｂ１′の和で検出される。

そして、本実施例における免疫反応測定では、２波長励
起の場合、反応前の遊離ラテックス１８に対する音響検
出信号の比Ａ１：Ａ２と、反応後のＢ２：Ｂ１’の比と
が同一比としてとらえることができるので、Ａ１、Ａ２
．Ｂ２の検出データからＢ１′を求めることができる。

そして、Ｂ１とＢ１′の差が、ノイズ信号を除去した凝
集体２１の音響検出信号としてとらえることができ、正
確な免疫反応を測定することが可能となる。測定結果は
、第３図ｅに示すように、単波長励起の従来の測定結果
に比較して、パックグラウンドが低減でき、高感度な免
疫測定を実現できた。

なお、第３図８の結果は、次のような実験のもとで得ら
れたデータである。

粒径０．５μｍのポリスチレンラテックスビーズ（セキ
スイ、１０％懸濁液）をリン酸緩衝液で５倍に希釈した
懸濁液２．５ｍＱに、リン酸緩衝液で透析した抗ヒトα
・フェトプロティン（ＡＦＰ）抗体（Ｄ　ａ　ｋ　ｏ　
、ｌ　Ｏｍ　ｇ　／　ｍ　Ａ　）　１　ｍ　Ｑ　。

リン酸緩衝液１．５ｍＡを加え、３７°Ｃで１時間撹拌
した。この後、２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を
含むリン酸緩衝液５ｍＡを加え、室温で２時間撹拌する
。遠心分離、再分散を繰り返すことにより、リン酸緩衝
液で３回洗浄した後、再度１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝
液に再分散させて抗体感作ラテックス試薬１０ｍＡを得
た。

そして、免疫反応は次のようにして行った。

上記で作成したラテックス試薬を１％ＢＳＡを含むリン
酸緩衝液でさらに１０倍希釈する。１％ＢＳＡを含むリ
ン酸緩衝液で希釈したヒトＡＦＰ（抗原）標準液（Ｄａ
ｋｏ約１００．ＯＯＯｎｇ／ｍＪ）５０μａに１％ポリ
エチレングリコール６０００　溶液５０μａ、及び上記
希釈したラテックス試薬を加え、室温で３０分間反応さ
せた。

反応後、リン酸緩衝液で１００００倍になるよう希釈し
て、上記光音響測定装置で測定した。

第４図ａ、ｂは、第１図の装置の変形例である。

このうち、第４図ａは、第１図で複数のシャッタ７ａ、
７ｂ及び光チョッパ２ａ、２ｂとしていたものを、一つ
のシャッタ７Ｃ及び光チョッパ２Ｃで同様の動作を行い
得るようにしたもので、装置の部品点数を少なくし、同
時にシャッタの連動及び光チョッパによる変調周波数を
一致させることができる。

第４図すは、シャッタを用いずに、ミラー２５の回転（
矢印２６で示す）により励起光を選択できるよう構成す
る。ハーフミラ−４の代わりに光学ミラー３ａ、及びビ
ームトラップ２７を設ける。

第５図は、光音響測定装置の他のシステム構成図を示す
。

本実施例では、励起光光源として、半導体レーザｌｃ、
ｌｄを用い、これらの光源を駆動電源２８ａ、２８ｂに
より直接、変調光として出力制御するもので、半導体レ
ーザｌｃ、ｌｄから出力される光の変調周波数は異なる
ように設定しである。

半導体レーザｌｃ、ｌｄから出力される光は、反射ミラ
ー３．ハーフミラ−４を介して同時に試料セル５に導く
ことが可能である。この場合、波長の異なる２種のレー
ザ光照射により試料から生じる音響信号は、混じり合っ
て発生するが、ロックインアンプ１５で、上記各変調周
波数に対応した信号として弁別され、同時に２波長測定
結果として出力される。

弁別された音響検出信号は、デジタル電圧計３３により
デジタル信号に変換されて、マイクロコンピュータ３４
に入力される。

マイクロコンピュータ３４は、検出された音響信号のデ
ータに基づき、前述した方程式による演算或いは第２図
、第３図で説明した方程式に類する求解を自動的に演算
して、未知量たる測定対象粒子の量、濃度、数密度等の
いずれかを求める。

その結果は、デイスプレィならびにプリンタ３５に出力
される。

なお、本実施例では、半導体レーザｌｃ、ｌｄから出力
されたレーザ光は、集光レンズ２９で集光され、スリッ
ト３０を通して測定セル５に導かれる。

試料９は、トレイ３１に設置され、オートサンプラー３
２により自動的に測定セル５に導入される。

また、半導体レーザｌｃ、ｌｄから出力されるレーザ光
は、同時に出力する方式に代えて、駆動電源２８ａ、２
８ｂの断続（オン／オフ）により切換えるようにしても
よい。

具体的には、発振波長７９０ｎｍ及び１．３μｍ　（１
３００ｎｍ）を有する半導体レーザをそれぞれｌｃ、ｌ
ｄに配置した。また、変調周波数はそれぞれ１８１　Ｈ
ｚ、３３０　Ｈｚとした。

この装置を用いて、ヒト癌胎児性抗原　（ＣＥ　Ａ　）
の測定を行った。０．７９μｍ径のアクリル系樹脂ラテ
ックスビーズを用いて、表面カルボキシル基を介して１
−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ
ジイミド塩酸塩を用いて、抗ＣＥＡモノクローナル抗体
を結合した０反応はホウ酸緩衝液中で行った。結合後、
活性基を１０％Ｌ−リジン溶液を混合撹拌することによ
り安定化させた。最後に１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝液
（ｐＨ７，４）に再分散させて保存した。

抗原・抗体反応の方法は、ＡＦＰＰｓ定と同様である。

測定方法は、（１）、（２）式の方程式により行った。

測定結果を第６図に示す。

従来は、７９０ｎｍレーザのみの単波長を用いて未反応
ビーズ量の減少を測定していたが、本実施例のように２
励起波長を用いることで、変化斌が大きく観測でき、検
出感度が向上した。

第７図に光音響測定装置の他の例を示す。

本実施例は、励起光光源としてキセノンランプ３６を利
用する。検出すべき粒子の粒径が小さくなると、外来の
塵の影響が大きくなってくる。このような外来妨害粒子
の径は広く分散するので。

妨害信号を補正するためには、キセノンランプのように
波長分布の広い光源を用いるのが有効となる。

本実施例では、キセノンランプ３６から出力される光を
集光ミラー３７．集光レンズ３８で集光し、絞り３９を
通してビームスプリッタ４０で２光束にする。１光束は
、分光器４１を通して目的とする粒子測定用（測定対象
粒子に対して顕著な音響信号を発生させる波長）とする
。他の１光束は、ミラー４２で折り返し、ローパスフィ
ルタ４３を通し、長波長成分を除いてからレンズ４４で
集光し、妨害粒子計測用とする。

試料は、９６六マイクロプレート４５で準備され、希釈
機能の付属したサンプラー４６で測定セル５ａに導かれ
る１ｇＪ定セル５ｂは、セル５ａと直列に接続され、同
一試料がこれらのセルに順次通過する構造となっている
。

本実施例においては、測定対象粒子を第１の課題解決手
段を利用して求めた。

なお、この装置を用いて、塵埃の多い環境下で試料をｍ
製した０、４μｍ粒子の測定例を第８図に示す、共存す
る妨害粒子は、０．３μｍ付近の粒子とした。

この測定例では１分光器４１は４５０μｍに設定し、ロ
ーパスフィルタ４３は、中心波長が３５０μｍの干渉フ
ィルタを用いた。

しかして従来は、空気中及び水中の塵埃による影響で測
定対象粒子を定量的に測定できなかったのに対し、本実
施例では、塵埃等の妨害粒子のノイズ信号成分を除いて
特定粒子径の音響検出信号を検出することが可能となり
、定量測定を実現することができた。

なお、上記各実施例では、光源、変調方法、光路の切換
、サンプリング方式等１種々例示したが、これらの各実
施例のものを実施例同士で組み替えて用いることも可能
である０例えば、ガスレーザと半導体レーザを光源とし
て組合せることも可能でる。

〔発明の効果〕

以上のように、本発明によれば、試料に少なくとも２つ
の異なる波長の励起光を照射し、これから得られる光音
響信号等をデータとして、未知量たる測定対象粒子の算
出を行うことで、妨害粒子に起因するノイズ信号成分を
除き、測定対象粒子に関する音響検出信号を抽出するこ
とができる。

従って、粒子計測において、粒子径選択性を向上させ、
測定対象粒子の濃度、量、数密度等に関する測定精度を
向上させることができる。

また、これを応用した免疫測定によれば、遊離ラテック
ス粒子や試料、試薬中の在来粒子に起因するバックグラ
ウンドノイズの影響を排除し、抗原、抗体等の濃度、量
、数密度２反応量等を高感度測定することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明に用いる光音響測定装置の第１実施例
を示す構成図、第２図及び第３図は、上記光音響測定装
置を用いて行った粒子測定例を示す説明図、第４図は、
上記光音響測定装置の変形例を示す説明図、第５図は、
本発明に用いる光音Ｗ測定装置の第２実施例を示す構成
図、第６図は、上記第２実施例の装置を用いて粒子測定
を行った結果を示す説明図、第７図は１本発明に用いる
光音響１３１！！定装置の第３実施例を示す構成図、第
８図は、上記第３実施例の装置を用いて粒子測定を行っ
た結果を示す説明図である。 ｌａ、ｌｂ−励起光光源（ＹＡＧレーザ、Ａｒレーザ）
、ｌｃ、ｌｄ・・・半導体レーザ、２ａ、２ｂ・・・光
変調手段（光チョッパ）、３・・・光学ミラー４・・・
ハーフミラ−，５，５ａ、５ｂ・・・測定セル、７ａ、
７ｂ、７ｃ・・・光路切換シャッタ、１３・・・圧電素
子（光音響検出手段）、１５，１５ａ、１５ｂ・・・音
響検出信号弁別手段（ロックインアンプ）。 １７・・・レコーダ、２５・・・回転ミラー、２８ａ、
２８ｂ・・・レーザ駆動電源、３４・・・演算手段（マ
イクロコンピュータ）、３５・・・プリンタ、３７・・
・励起光光源（キセノンランプ）。 第 １ 図 ５ １ａ、ｌｂ−励起光光源（ＹＡＧレーザ、Ａｒレーザ）
、２ａ、２ｂ・・光Ｋｇ手段（光チョッパ）、３・・・
光学ミラ、４・・・ハーフミラ−１５・・・６＋１１　
定セル、７ａ、７ｂ・・・光路切換ンヤソタ、１３・・
・圧電素子（光音響検出手段）。 １５・・音響検出信号弁別手段（ロンクイ／アンプ）。 １７・・・レコーダ。 第 図 粒子濃度 共存ａｓ　ｐｍ粒子譲濃 度 共存α５ｐｍ粒子濃度 第 図 励起波長 励起波長 ヒトＡＦＰ（１１１度＜ｎｇｉｍｔ＋ 第 図 ２５・・・回転ミラ ｌｃ 第 図 第 図 対照 ０．１ ０ ００ ＣＥＡ濃度 （ｎｇ／ｍ７） 測定波長７９０　ｎｍ 第 図 ５ａ、５ｂ・・・測定セル １５ａ、　１５ｂ・・・ロックインアンプ３７・・・キ
セノンランプ 第 図 添加０．３μｍ粒子濃度

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、試料に特定波長を有する励起光を照射し、これによ
   り発生する音響を検出して、試料中の特定粒径の光吸収
   物質を測定する方法において、照射すべき励起光を少な
   くとも２つの異なる特定波長として、測定しようとする
   測定対象粒子と、これと共存する他の径の粒子（以下、
   妨害粒子と称する）に関して、予め前記各特定波長の励
   起光による１粒子あたりの音響信号強度をそれぞれ求め
   ておき、 試料中の測定対象粒子の測定を行う場合には、試料に前
   記複数の異なる特定波長の励起光を照射し、これにより
   生じた各音響検出値及び予め求めた前記１粒子あたりの
   音響信号強度等を用いて、試料中の未知量たる測定対象
   粒子の濃度、量、数密度等のいずれかを算出することを
   特徴とする光音響を用いた粒子の測定方法。 ２、第１請求項において、前記試料中の未知量たる測定
   対象粒子を算出する場合には、試料に励起光照射して得
   られた前記各音響検出値及び予め求めた前記１粒子あた
   りの音響信号強度を基に連立方程式をたてることにより
   行う光音響を用いた粒子の測定方法。 ３、第１請求項又は第２請求項において、前記測定対象
   粒子及び妨害粒子の１粒子あたりの音響信号強度は、測
   定対象粒子のみを入れた液と、妨害粒子のみを入れた液
   に前記異なる波長の励起光をそれぞれ照射することによ
   り作成した測定対象粒子の濃度・音響検出信号の検量線
   と、妨害粒子の濃度・音響検出信号の検量線とから求め
   る光音響を用いた粒子の測定方法。 ４、試料に特定波長を有する励起光を照射し、これによ
   り発生する音響を検出して、試料中の特定粒径の光吸収
   物質を測定する方法において、測定しようとする測定対
   象粒子と、これと共存する妨害粒子に関して、予め特定
   波長λ１の励起光による粒子濃度・音響検出信号の検量
   線Ｋ１、Ｋ２をそれぞれ作成すると共に、 前記妨害粒子に関するもう一つの検量線として、該妨害
   粒子に対しては顕著な音響検出信号を生じさせ、前記測
   定対象粒子に対しては、無視できる程度の僅かな音響検
   出信号しか生じさせない波長λ２（λ１≠λ２）の励起
   光による粒子濃度・音響検出信号の検量線Ｋ３を作成し
   、このλ２励起光による前記妨害粒子の検量線Ｋ３と前
   記λ１励起光による前記妨害粒子の検量線Ｋ２との換算
   データを作成し、 試料中の測定対象粒子の測定を行う場合には、前記複数
   の異なる波長λ１、λ２の励起光を試料に照射して、そ
   れぞれの音響検出信号Ｐ１、Ｐ２を得ると共に、このう
   ち波長λ２の励起光照射により生じた音響検出信号Ｐ２
   と前記換算データを用いて、前記λ１励起光照射による
   音響検出信号Ｐ１に含まれる前記妨害粒子に起因するノ
   イズ信号成分Ｐ１′を求め、 前記音響検出信号Ｐ１とノイズ信号成分Ｐ１′との差か
   ら、測定対象粒子の濃度、量、数密度等のいずれかを算
   出することを特徴とする光音響を用いた粒子の測定方法
   。 ５、試料中にて微粒子に凝集反応を起こさせ、この反応
   により生じる凝集体の濃度、量、数密度等のいずれかを
   測定する方法において、 反応前に前記試料に複数の異なる特定波長λ１、λ２の
   励起光を照射して、反応前の微粒子から生じる各波長λ
   １、λ２の音響信号Ａ１、Ａ２を検出し、 反応後に前記試料に特定波長λ１、λ２の励起光を照射
   し、この励起光照射により生じる音響信号Ｂ１、Ｂ２を
   検出し、 反応前の前記励起波長λ１、λ２により発生させた音響
   信号Ａ１、Ａ２の比と、反応後の前記励起波長λ２によ
   り発生させた音響信号Ｂ２から、音響信号Ｂ２に対して
   Ａ１、Ａ２と同一比となるような音響信号成分Ｂ１′を
   算出し、且つ、前記音響信号Ｂ１と音響信号Ｂ１′の差
   から凝集体の濃度、量、数密度等のいずれかを算出する
   ことを特徴とする光音響を用いた粒子の測定方法。 ６、第１請求項ないし第５請求項のいずれか１項におい
   て、前記励起光は、光源をガスレーザ、色素レーザ、半
   導体レーザのいずれかとした単色光よりなる光音響を用
   いた粒子の測定方法。 ７、第１請求項ないし第５請求項のいずれか１項におい
   て、前記励起光は、キセノンランプ、タングステンラン
   プ、ハロゲンランプ等の高輝度光源より発生する白色光
   、またはこれを色ガラスフィルタ、干渉フィルタ等のフ
   ィルタ素子或いは回折格子を用いて分光した単色光であ
   る光音響を用いた粒子の測定方法。 ８、第１請求項ないし第７請求項のいずれか１項におい
   て、前記励起光は光チョッパにより一定周波数で断続的
   に変調される光音響を用いた粒子の測定方法。 ９、第１請求項ないし第８請求項のいずれか１項におい
   て、前記複数の異なる波長の励起光は、選択的な切換え
   により前記試料に照射し、これらの異なる波長の励起光
   照射により発生する試料中の音響信号を時期を異にして
   検出する光音響を用いた粒子の測定・方法。１０、第１
   請求項ないし第８請求項のいずれか１項において、前記
   複数の異なる波長の励起光は、異なる周波数で変調させ
   て同時に試料に照射し、この励起光照射により検出され
   る音響信号から上記変調周波数に同期した複数の音響信
   号成分をそれぞれ弁別して抽出する光音響を用いた粒子
   の測定方法。 １１、試料に特定波長の励起光を照射する光学系で、少
   なくとも２つの異なる波長の励起光を別々に出力する複
   数系の光源を有し、これらの光源のうちの一方の励起光
   は、試料中の測定対象粒子に共鳴的な音響信号を発生さ
   せる波長で、他方の励起光は、共存する妨害粒子に共鳴
   的な音響信号を発生させる波長で出力するよう設定され
   、且つ、前記複数の異なる波長の励起光を試料収容の測
   定セルに導く手段と、 励起光照射により発生する試料からの音響を検出する手
   段と、 検出された音響信号を、それぞれの波長の励起光ごとの
   信号として弁別して、レコーダに記録させる手段とを、 備えてなることを特徴とする光音響を用いた粒子測定装
   置。 １２、試料に特定波長の励起光を照射する光学系で、少
   なくとも２つの異なる波長の励起光を別々に出力する複
   数系の光源を有し、これらの光源のうちの一方の励起光
   は、試料中の測定対象粒子に共鳴的な音響信号を発生さ
   せる波長で、他方の励起光は、共存する妨害粒子に共鳴
   的な音響信号を発生させる波長で出力するよう設定され
   、且つ、前記複数の異なる波長の励起光を試料収容の測
   定セルに導く手段と、 励起光照射により発生する試料からの音響を検出する手
   段と、 前記複数の異なる波長の励起光をそれぞれ試料に照射し
   た時に発生する音響検出信号や、予め前記異なる波長の
   励起光との関係で求めた前記測定対象粒子及び妨害粒子
   の１粒子あたりの音響信号強度を用いて、方程式に基づ
   く演算機能により未知量たる測定対象粒子の量、濃度、
   数密度等のいずれかを算出する手段とを、 備えてなることを特徴とする光音響を用いた粒子測定装
   置。 １３、第１１請求項又は第１２請求項において、前記複
   数の異なる波長の励起光を測定セルに導く手段は、光学
   ミラーの回転、励起光光源の電気的切換、遮光板の切換
   のいずれかを利用して、前記異なる波長の励起光を選択
   的に測定セルに導くよう設定してなる光音響を用いた粒
   子測定装置。 １４、第１１請求項ないし第１３請求項のいずれか１項
   において、前記複数の異なる波長の励起光を試料に一定
   の変調周波数で断続的に照射するための光変調手段を有
   する光音響を用いた粒子測定装置。 １５、第１１請求項ないし第１４請求項のいずれか１項
   において、前記波長の異なる励起光を別々に出力する複
   数系の光源は、並列配置され、且つ前記複数の異なる波
   長の励起光を測定セルに導く手段は、一方の光源の光路
   に反射ミラーが、他方の光源の光路にハーフミラーが配
   置されて、これらのミラーを介して前記複数の光源から
   出力される励起光がミラー経過後に、共通の光路を通っ
   て、前記測定セルに導かれるよう設定してなる光音響を
   用いた粒子測定装置。 １６、第１１請求項ないし第１４請求項のいずれか１項
   において、前記波長の異なる励起光を別々に出力する複
   数系の光源は、並列配置され、この複数系の光源の配置
   に対応して前記測定セルが複数配置され、且つ、これら
   の測定セルは、互いに直列に接続されて、試料が逐次、
   これらの測定セルに流れるように設定してなる光音響を
   用いた粒子測定装置。１７、第１１請求項ないし第１６
   請求項のいずれか１項において、前記複数の異なる波長
   の励起光を、それぞれ異なる周波数で変調させて試料に
   断続的に照射させる手段と、 励起光照射により試料から発生する音響信号を、前記変
   調周波数に同期した信号成分として弁別して抽出する手
   段とを有する光音響を用いた粒子測定装置。 １８、抗体（または抗原）付き微粒子を主成分とする試
   薬と、試料とを混合し、試料中に含まれた抗原（または
   抗体）と前記試薬の抗体（または抗原）との反応により
   生じる微粒子の凝集を検出して、試料中の抗原あるいは
   抗体の濃度、量、数密度、反応量等のいずれかを求める
   測定法において、 前記微粒子の凝集の検出は、試料に励起光を照射して生
   じる音響信号により行う光音響測定方式を用い、 且つ、照射すべき励起光を少なくとも２つの異なる特定
   波長として、測定しようとする凝集体と、妨害粒子とな
   る微粒子に関して、予め前記各波長の励起光による１粒
   子あたりの音響信号強度をそれぞれ求めておき、 抗原・抗体反応後には、反応後の前記試料に前記複数の
   異なる特定波長の励起光を照射し、これにより生じた各
   音響検出値及び予め求めた前記１粒子あたりの音響信号
   強度等を用いて未知量たる凝集量を算出し、この算出量
   から抗原あるいは抗体の濃度、量、数密度、反応量のい
   ずれかを求めることを特徴とする光音響を用いた免疫測
   定方法。 １９、抗体（または抗原）付き微粒子を主成分とする試
   薬と、試料とを混合し、試料中に含まれた抗原（または
   抗体）と前記試薬の抗体（または抗原）との反応により
   生じる微粒子の凝集を検出して、試料中の抗原あるいは
   抗体の濃度、量、数密度、反応量等のいずれかを求める
   測定法において、 反応前に前記試料に異なる特定波長λ１、λ２の励起光
   を照射して、反応前の抗体（または抗原）付き微粒子か
   ら生じる各波長λ１、λ２の音響信号Ａ１、Ａ２を検出
   し、 反応後に前記試料に特定波長λ１、λ２の励起光を照射
   し、この励起光照射により生じる音響信号Ｂ１、Ｂ２を
   検出し、 反応前の前記励起波長λ１、λ２により発生させた音響
   信号Ａ１、Ａ２の比と、反応後の前記励起波長λ２によ
   り発生させた音響信号Ｂ２から、音響信号Ｂ２に対して
   Ａ１、Ａ２と同一比となるような音響信号成分Ｂ１′を
   算出し、且つ、前記音響信号Ｂ１と音響信号Ｂ１′の差
   から抗原あるいは抗体の濃度、量、数密度、反応量等の
   いずれかを算出することを特徴とする光音響を用いた免
   疫測定方法。