JPH03109397A - エンドトキシンの除去方法 - Google Patents
エンドトキシンの除去方法Info
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- JPH03109397A JPH03109397A JP24701489A JP24701489A JPH03109397A JP H03109397 A JPH03109397 A JP H03109397A JP 24701489 A JP24701489 A JP 24701489A JP 24701489 A JP24701489 A JP 24701489A JP H03109397 A JPH03109397 A JP H03109397A
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- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
[産業上の利用分野]
本発明はエンドトキシンの除去方法に係り、特に蛋白質
とエンドトキシンとを含む蛋白質溶液中に含まれるエン
ドトキシンを選択的かつ効率的に分離除去する方法に関
する。
とエンドトキシンとを含む蛋白質溶液中に含まれるエン
ドトキシンを選択的かつ効率的に分離除去する方法に関
する。
[従来の技術]
バイオテクノロジーにより生産された蛋白質等の医薬品
の精製においては、不純物であるエンドトキシンを数p
g/mx〜数10 p g/mftにまで除去する必要
がある。従来、エンドトキシンの除去技術としては、低
分子キトサンを用し)る方を去が提案されている(特開
昭63−56300号)。即ち、低分子キトサンを担体
に吸着させてカラムに充填し、このカラムに被処理液を
通液すると、低分子キトサンとエンドトキシン力(特異
的に吸着して液中のエンドトキシン力(除去される。
の精製においては、不純物であるエンドトキシンを数p
g/mx〜数10 p g/mftにまで除去する必要
がある。従来、エンドトキシンの除去技術としては、低
分子キトサンを用し)る方を去が提案されている(特開
昭63−56300号)。即ち、低分子キトサンを担体
に吸着させてカラムに充填し、このカラムに被処理液を
通液すると、低分子キトサンとエンドトキシン力(特異
的に吸着して液中のエンドトキシン力(除去される。
また、特開昭63−287503号にCよ、エンドトキ
シン水溶液を、キトサンを架橋したポリアミド徴多孔性
膜と接触させてエンドトキシンを吸着分離することが開
示されている。更に、エンドトキシンを低濃度にまで除
去する方法として、イオンクロマトグラフィー ゲルク
ロマトグラフィー アフイニテイクロマトグラフイー(
q寺公平1−16389号)なども検討されてし)る。
シン水溶液を、キトサンを架橋したポリアミド徴多孔性
膜と接触させてエンドトキシンを吸着分離することが開
示されている。更に、エンドトキシンを低濃度にまで除
去する方法として、イオンクロマトグラフィー ゲルク
ロマトグラフィー アフイニテイクロマトグラフイー(
q寺公平1−16389号)なども検討されてし)る。
[発明が解決しようとする?;!I題1特開昭63−5
6300号に開示される低分子キトサンによる方法では
、エンドトキシンの吸着効率が十分ではなく、mg /
m flオーダーのものを数十ng / m Itオ
ーダーまでに除去するに&よ有9I”するが、pg/m
JZオーダーまでの極(It濃度にまで除去するのは難
しい、即ち、特開昭63−56300号に開示される低
分子キトサン固定化担体に固定化されているキトサンは
低分子であり、エンドトキシン吸着に用いられる担体中
のキトサン含量が少ないため、エンドトキシンの平衡吸
着量が少ない。そのため、蛋白質溶液中のエンドトキシ
ンをp g/mlLオーダーまで除去する目的には実用
上不適当である。因みに、特開昭63−56300号の
実施例では、エンドトキシンは270〜57 n g
/ m j2と、数1100n/mu〜数10 n g
/ m fLまでしか除去されていない。
6300号に開示される低分子キトサンによる方法では
、エンドトキシンの吸着効率が十分ではなく、mg /
m flオーダーのものを数十ng / m Itオ
ーダーまでに除去するに&よ有9I”するが、pg/m
JZオーダーまでの極(It濃度にまで除去するのは難
しい、即ち、特開昭63−56300号に開示される低
分子キトサン固定化担体に固定化されているキトサンは
低分子であり、エンドトキシン吸着に用いられる担体中
のキトサン含量が少ないため、エンドトキシンの平衡吸
着量が少ない。そのため、蛋白質溶液中のエンドトキシ
ンをp g/mlLオーダーまで除去する目的には実用
上不適当である。因みに、特開昭63−56300号の
実施例では、エンドトキシンは270〜57 n g
/ m j2と、数1100n/mu〜数10 n g
/ m fLまでしか除去されていない。
特開昭63−287503号に開示されるキトサン固定
化膜では、膜中のキトサン含量が10%以下と非常に低
いため、やはりエンドトキシンの平衡吸着量が少なく、
エンドトキシンを極低濃度に除去することは不可能であ
ると考えられる。特開昭63−287503号には、水
中のエンドトキシン除去について例示されているが、上
述の如く、膜のエンドトキシン平衡吸着量が少ないこと
から、蛋白質溶液中のエンドトキシンの除去には実用上
不適当である。
化膜では、膜中のキトサン含量が10%以下と非常に低
いため、やはりエンドトキシンの平衡吸着量が少なく、
エンドトキシンを極低濃度に除去することは不可能であ
ると考えられる。特開昭63−287503号には、水
中のエンドトキシン除去について例示されているが、上
述の如く、膜のエンドトキシン平衡吸着量が少ないこと
から、蛋白質溶液中のエンドトキシンの除去には実用上
不適当である。
イオンクロマトグラフィー ゲルクロマトグラフィー
アフィニティクロマトグラフィーは、p g/mjlオ
ーダーまでの除去を目的として検討されているものでは
あるが、それぞれ欠点を有し、実用上有利な方法とはい
えない、即ち、ゲルクロマトグラフィーは、エンドトキ
シンの分子量分布が非常に広いため、蛋白質などの高分
子量物質との分離は困難であり、また、イオンクロマト
グラフィー アフィニティクロマトグラフィーは、平衡
吸着量が小さい上に、pH、イオン強度、再生条件など
の条件設定が難しい。
アフィニティクロマトグラフィーは、p g/mjlオ
ーダーまでの除去を目的として検討されているものでは
あるが、それぞれ欠点を有し、実用上有利な方法とはい
えない、即ち、ゲルクロマトグラフィーは、エンドトキ
シンの分子量分布が非常に広いため、蛋白質などの高分
子量物質との分離は困難であり、また、イオンクロマト
グラフィー アフィニティクロマトグラフィーは、平衡
吸着量が小さい上に、pH、イオン強度、再生条件など
の条件設定が難しい。
従来においては、特に、蛋白X精製を目的として、蛋白
質溶液中のエンドトキシンを除去する技術について、明
確な条件設定がなされていないために、蛋白質溶液中の
エンドトキシンを選択的にかつ効率的に除去することが
できなかった。
質溶液中のエンドトキシンを除去する技術について、明
確な条件設定がなされていないために、蛋白質溶液中の
エンドトキシンを選択的にかつ効率的に除去することが
できなかった。
本発明は上記従来の問題点を解決し、蛋白質溶液中のエ
ンドトキシンを極低濃度にまで選択的かつ効率的に除去
することが可能なエンドトキシンの除去方法を提供する
ことを目的とする。
ンドトキシンを極低濃度にまで選択的かつ効率的に除去
することが可能なエンドトキシンの除去方法を提供する
ことを目的とする。
[vi題を解決するための手段]
本発明のエンドトキシンの除去方法は、蛋白質とエンド
トキシンとを含む液からエンドトキシンを除去する方法
において、該液のpHを該蛋白質の等電点以下に調整し
た後、架橋キトサン粒状物を充填したカラムに通水する
ことを特徴とする。
トキシンとを含む液からエンドトキシンを除去する方法
において、該液のpHを該蛋白質の等電点以下に調整し
た後、架橋キトサン粒状物を充填したカラムに通水する
ことを特徴とする。
即ち、本発明者らは、蛋白質溶液中のエンドトキシンを
除去する方法について検討を行なったところ、吸着剤と
して架橋キトサン粒状物が、キトサン含量が多く、エン
ドトキシン平衡吸着量が多いことから極めて有効である
ことを知見した。そして、架橋キトサン粒状物を用いる
方法において、エンドトキシンのみを選択的かつ効率的
に除去するべく更に検討を重ねた結果、液のpHを蛋白
質の等電点以下とするという、従来技術では全く示唆さ
れていない処理条件を採用することにより、エンドトキ
シンの選択的、効率的除去が可能とされることを見出し
本発明を完成させた。
除去する方法について検討を行なったところ、吸着剤と
して架橋キトサン粒状物が、キトサン含量が多く、エン
ドトキシン平衡吸着量が多いことから極めて有効である
ことを知見した。そして、架橋キトサン粒状物を用いる
方法において、エンドトキシンのみを選択的かつ効率的
に除去するべく更に検討を重ねた結果、液のpHを蛋白
質の等電点以下とするという、従来技術では全く示唆さ
れていない処理条件を採用することにより、エンドトキ
シンの選択的、効率的除去が可能とされることを見出し
本発明を完成させた。
以下に、本発明の詳細な説明する。
まず、本発明においてエンドトキシン吸着材として用い
る架橋キトサン粒状物について説明する。
る架橋キトサン粒状物について説明する。
本発明に係る架橋キトサン粒状物は、通常のキトサン或
いは低分子量キトサンを用いて、公知の方法で架橋処理
することにより容易に製造することができる0例えば、
キトサンを架橋処理する方法としては、キトサン酸性溶
液に乳化剤を含む疎水性溶剤を加えてエマルジョン化し
、次いでアルカリ溶液中で攪拌下積状物化する方法(特
公昭59−30722号)が挙げられる。また、低分子
キトサンを架橋処理する方法としては、低分子量キトサ
ンを酸性溶液に溶解し、次いで塩基性溶液中に落下させ
て粒状化し、架橋処理する方法(特公昭63−5428
5号)が挙げられる6以下に本発明に係る架橋キトサン
粒状物の製造方法の一例について説明する。
いは低分子量キトサンを用いて、公知の方法で架橋処理
することにより容易に製造することができる0例えば、
キトサンを架橋処理する方法としては、キトサン酸性溶
液に乳化剤を含む疎水性溶剤を加えてエマルジョン化し
、次いでアルカリ溶液中で攪拌下積状物化する方法(特
公昭59−30722号)が挙げられる。また、低分子
キトサンを架橋処理する方法としては、低分子量キトサ
ンを酸性溶液に溶解し、次いで塩基性溶液中に落下させ
て粒状化し、架橋処理する方法(特公昭63−5428
5号)が挙げられる6以下に本発明に係る架橋キトサン
粒状物の製造方法の一例について説明する。
キトサンは、カニ、エビなどの甲殻類の外殻皮などに含
有されているキチンを濃アルカリと共に加熱することに
より脱アセチル化して得られる。
有されているキチンを濃アルカリと共に加熱することに
より脱アセチル化して得られる。
このようにして得られるキトサンは、通常、分子4!k
s、ooo 〜l、000,000.固有粘度(30℃
、0.2M酢酸+0.1M酢酸ソーダ)[η]−0,2
5〜30 d 117g−キトサン、コロイド当量1.
0〜6.2meq/g−キトサンのものである。脱アセ
チル化の程度は特に制限はないが、酸を用いて溶解可能
な程度にまで脱アセチル化されていればよく、一般には
脱アセチル化度50〜100モル%程度のものが好まし
い、また、キトサンの平均粒径は9〜300メツシュ程
度の粒状であることが好ましい。
s、ooo 〜l、000,000.固有粘度(30℃
、0.2M酢酸+0.1M酢酸ソーダ)[η]−0,2
5〜30 d 117g−キトサン、コロイド当量1.
0〜6.2meq/g−キトサンのものである。脱アセ
チル化の程度は特に制限はないが、酸を用いて溶解可能
な程度にまで脱アセチル化されていればよく、一般には
脱アセチル化度50〜100モル%程度のものが好まし
い、また、キトサンの平均粒径は9〜300メツシュ程
度の粒状であることが好ましい。
このようにして得られるキトサンのうち、本製造例にお
いては、低分子量キトサンとして、分子if万〜50万
、脱アセチル化度50〜100モル%のものを用いる。
いては、低分子量キトサンとして、分子if万〜50万
、脱アセチル化度50〜100モル%のものを用いる。
そしてこの低分子量キトサンをまず酸性溶液に溶解して
キトサン酸性水溶液とする。この場合、使用される酸は
、キトサンを溶解するものであればいずれも使用できる
が、代表的なものとしては、酢酸、ギ酸、プロピオン酸
、酪酸、吉草酸、イソプロピオン酸、イソ酪酸、イソ吉
草酸、安息香酸、ケイ皮酸、サリチル酸、フタル酸など
の有機酸類、塩酸、硝酸などの鉱酸類などを挙げること
ができる。
キトサン酸性水溶液とする。この場合、使用される酸は
、キトサンを溶解するものであればいずれも使用できる
が、代表的なものとしては、酢酸、ギ酸、プロピオン酸
、酪酸、吉草酸、イソプロピオン酸、イソ酪酸、イソ吉
草酸、安息香酸、ケイ皮酸、サリチル酸、フタル酸など
の有機酸類、塩酸、硝酸などの鉱酸類などを挙げること
ができる。
使用する酸の量はできるだけ少ない方が好ましく、キト
サンを溶解する最低限の量で用いる。
サンを溶解する最低限の量で用いる。
般には、キトサンに対し、0.2〜5倍(重量)の酸を
添加する。
添加する。
キトサン酸性水溶液におけるキトサンの濃度は、キトサ
ンの分子量と脱アセチル化度により適切な溶解濃度が決
定されるが、通常2〜20重量%とするのが好ましい。
ンの分子量と脱アセチル化度により適切な溶解濃度が決
定されるが、通常2〜20重量%とするのが好ましい。
得られたキトサン酸性水溶液は、塩基性溶液中に攪拌下
落下させて粒状化する。ここで用いる塩基性溶液の塩基
性物質としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、
炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、アンモニア、エチレン
ジアミン等のアルカリ性物質が挙げられ、溶媒としては
、水又はメタノール、エタノール等の極性を有するアル
コール、或いはこれらの極性溶媒と水との混合溶媒が挙
げられる。塩基性溶液の濃度には特に制限はないが、通
常の場合、1〜20重量%濃度のものが使用される。
落下させて粒状化する。ここで用いる塩基性溶液の塩基
性物質としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、
炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、アンモニア、エチレン
ジアミン等のアルカリ性物質が挙げられ、溶媒としては
、水又はメタノール、エタノール等の極性を有するアル
コール、或いはこれらの極性溶媒と水との混合溶媒が挙
げられる。塩基性溶液の濃度には特に制限はないが、通
常の場合、1〜20重量%濃度のものが使用される。
粒状化して得られた粒状キトサンは、通常の場合、1μ
m〜fmm程度の多孔質キトサン粒状物であるが、これ
は、水洗後水分を除去した後、架橋処理に供される。
m〜fmm程度の多孔質キトサン粒状物であるが、これ
は、水洗後水分を除去した後、架橋処理に供される。
架橋処理は、キトサンを必要に応じて適当な溶媒中にて
、エピクロルヒドリン、グルタルアルデヒド、有機ジイ
ソシアネート類等の架橋剤を加えて処理することにより
行なうことができる。
、エピクロルヒドリン、グルタルアルデヒド、有機ジイ
ソシアネート類等の架橋剤を加えて処理することにより
行なうことができる。
なお、架橋処理に用いる溶媒としては、メタノール、エ
タノール、イソプロピルアルコール等のアルコール類、
アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、ジメチル
ホルムアミド、ジメチルアセトアミド等のアミド類やジ
メチルスルホキシドが使用できる。これらの溶媒は1f
!のみを使用しても、また、2種以上を混合して使用し
ても良い、また、有機ジイソシアネート類とじては、例
えば、4.4′−ジフェニルメタンジイソシアネート、
1.4−フェニレンジイソシアネート、2.4−トリレ
ンジイソシアネート、ナフタレンジイソシアネート、4
.4°−ジシクロヘキシルメタンジイソシアネート、キ
シリレンジイソシアネート、イソフォロンジイソシアネ
ート、ヘキサメチレンジイソシアネート等が挙げられる
。
タノール、イソプロピルアルコール等のアルコール類、
アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、ジメチル
ホルムアミド、ジメチルアセトアミド等のアミド類やジ
メチルスルホキシドが使用できる。これらの溶媒は1f
!のみを使用しても、また、2種以上を混合して使用し
ても良い、また、有機ジイソシアネート類とじては、例
えば、4.4′−ジフェニルメタンジイソシアネート、
1.4−フェニレンジイソシアネート、2.4−トリレ
ンジイソシアネート、ナフタレンジイソシアネート、4
.4°−ジシクロヘキシルメタンジイソシアネート、キ
シリレンジイソシアネート、イソフォロンジイソシアネ
ート、ヘキサメチレンジイソシアネート等が挙げられる
。
架橋剤の使用量は特に制限はflいが、キトサンのアミ
ノ基1当量に対して0.2〜0.8当量反応する程度と
するのが好ましい。また、溶媒を使用する場合、その使
用量はキトサン粒状体の体積に対して1〜5倍量とする
のが好ましい。
ノ基1当量に対して0.2〜0.8当量反応する程度と
するのが好ましい。また、溶媒を使用する場合、その使
用量はキトサン粒状体の体積に対して1〜5倍量とする
のが好ましい。
架橋処理条件は用いる架橋剤、溶媒の種類によって異な
るが、通常の場合、0〜60℃で0.05〜5時間行な
われる。
るが、通常の場合、0〜60℃で0.05〜5時間行な
われる。
このようにして製造された架橋キトサン粒状物は、その
使用に際しては、まず、塩基性溶液と接触させることに
よりアルカリ洗浄し、吸着しているエンドトキシンを失
活させて除去する。アルカリ洗浄に用いる塩基性溶液と
しては、NaOH。
使用に際しては、まず、塩基性溶液と接触させることに
よりアルカリ洗浄し、吸着しているエンドトキシンを失
活させて除去する。アルカリ洗浄に用いる塩基性溶液と
しては、NaOH。
KOH%N Hsなどの水溶液或いは、これらと有機溶
媒との混合液で、濃度0.01〜INのものを用いるこ
とができる。その後は、エンドトキシンを含まない滅菌
水(エンドトキシンフリー水)を用いて水洗し、余剰の
アルカリを洗浄除去する。水洗後は、これをそのままエ
ンドトキシン除去に用いることができるが、必要に応じ
て、前記キトサンの酸性水溶液の調製に用いた酸の水溶
液或いは、これらと有機溶媒との混合液で、濃度0.0
1〜INのものと接触させて、キトサンのアミノ基を解
離型として用いることもできる。酸と接触させた場合は
、その後更にエンドトキシンを含まない滅菌水で水洗し
て、余剰の酸を洗浄除去する。
媒との混合液で、濃度0.01〜INのものを用いるこ
とができる。その後は、エンドトキシンを含まない滅菌
水(エンドトキシンフリー水)を用いて水洗し、余剰の
アルカリを洗浄除去する。水洗後は、これをそのままエ
ンドトキシン除去に用いることができるが、必要に応じ
て、前記キトサンの酸性水溶液の調製に用いた酸の水溶
液或いは、これらと有機溶媒との混合液で、濃度0.0
1〜INのものと接触させて、キトサンのアミノ基を解
離型として用いることもできる。酸と接触させた場合は
、その後更にエンドトキシンを含まない滅菌水で水洗し
て、余剰の酸を洗浄除去する。
次に、このような架橋キトサン粒状物をエンドトキシン
吸着材として用いる本発明のエンドトキシンの除去方法
について説明する。
吸着材として用いる本発明のエンドトキシンの除去方法
について説明する。
本発明の方法においては、上記架橋キトサン粒状物をカ
ラムに充填し、このカラムに被処理液である蛋白質とエ
ンドトキシンとを含む液を当該蛋白質の等電点以下の酸
性側のPHに調整して通液し、カラム出口の液を回収す
る。液のpHが含有された蛋白質の等電点より塩基性側
であると、蛋白質も架橋キトサン粒状物に吸着され、蛋
白質回収率が低下する。液のpHは、好ましくは、当該
蛋白質の等電点よりも0,5以上低いpHとするのが好
ましい。
ラムに充填し、このカラムに被処理液である蛋白質とエ
ンドトキシンとを含む液を当該蛋白質の等電点以下の酸
性側のPHに調整して通液し、カラム出口の液を回収す
る。液のpHが含有された蛋白質の等電点より塩基性側
であると、蛋白質も架橋キトサン粒状物に吸着され、蛋
白質回収率が低下する。液のpHは、好ましくは、当該
蛋白質の等電点よりも0,5以上低いpHとするのが好
ましい。
本発明において、pHの調整は蛋白質を溶解するバッフ
ァーの酸と塩基の濃度を変えることにより容易に行なう
ことができる。又、必要に応じて食塩等の塩を添加する
ことによっても容易に行なえる。
ァーの酸と塩基の濃度を変えることにより容易に行なう
ことができる。又、必要に応じて食塩等の塩を添加する
ことによっても容易に行なえる。
本発明において、通液速度はエンドトキシンの除去効率
に大きく影響し、通常の場合、SVo、2〜2BV −
h r−’、特に0.5〜IBV−hr−’とするのが
好ましい、Svが2BV・hr″″Iを超えても0.2
BV−hr″″1未満でも、エンドトキシン除去率は著
しく低下し、回収液中のエンドトキシン濃度を極低濃度
にすることが難しい。
に大きく影響し、通常の場合、SVo、2〜2BV −
h r−’、特に0.5〜IBV−hr−’とするのが
好ましい、Svが2BV・hr″″Iを超えても0.2
BV−hr″″1未満でも、エンドトキシン除去率は著
しく低下し、回収液中のエンドトキシン濃度を極低濃度
にすることが難しい。
本発明の方法においては、上記エンドトキシン除去に使
用後の架橋キトサン粒状物は、前述と同様の塩基性溶液
でのアルカリ洗浄及び水洗を行なうことにより再生、再
使用が可能である。
用後の架橋キトサン粒状物は、前述と同様の塩基性溶液
でのアルカリ洗浄及び水洗を行なうことにより再生、再
使用が可能である。
なお、本発明において、処理対象とされる蛋白質及びエ
ンドトキシン含有液の蛋白質としては、特に制限はなく
、その等電点以下のPHにおいて安定な蛋白質であれば
いずれも適用可能である。
ンドトキシン含有液の蛋白質としては、特に制限はなく
、その等電点以下のPHにおいて安定な蛋白質であれば
いずれも適用可能である。
本発明によれば、エンドトキシン濃度は比較的低濃度の
液からもエンドトキシンを選択的かつ効率的に除去し、
エンドトキシン濃度を極低濃度にまで低減することがで
きる。従って、本発明の方法は、特にエンドトキシン濃
度11000n/m1以下の液に極めて有効である。
液からもエンドトキシンを選択的かつ効率的に除去し、
エンドトキシン濃度を極低濃度にまで低減することがで
きる。従って、本発明の方法は、特にエンドトキシン濃
度11000n/m1以下の液に極めて有効である。
[作用]
本発明に係る架橋キトサン粒状物は、キトサン含量が8
0%以上(残部は架橋剤である。)と著しく高いため、
エンドトキシン平衡吸着量が多。
0%以上(残部は架橋剤である。)と著しく高いため、
エンドトキシン平衡吸着量が多。
い、このため、エンドトキシンを効率的に吸着分離除去
し、エンドトキシン濃度を極低濃度まで低減することが
可能である。因みに、特開昭63−287503号に開
示されるポリアミド徴多孔性膜ではキトサン含量が10
%以下であり、また、特開昭83−58300号に開示
される低分子キトサン固定化担体でもキトサン含量は少
ないため、本発明の如く、高いエンドトキシン平衡吸着
量を得ることがで暫ず、従って、エンドトキシンを極低
濃度にまで低減させることは難しい。
し、エンドトキシン濃度を極低濃度まで低減することが
可能である。因みに、特開昭63−287503号に開
示されるポリアミド徴多孔性膜ではキトサン含量が10
%以下であり、また、特開昭83−58300号に開示
される低分子キトサン固定化担体でもキトサン含量は少
ないため、本発明の如く、高いエンドトキシン平衡吸着
量を得ることがで暫ず、従って、エンドトキシンを極低
濃度にまで低減させることは難しい。
しかも、本発明においては、このような架橋キトサン粒
状物を用いて、蛋白質の等電点以下のpHで処理するた
め、蛋白質が架橋キトサン粒状物に吸着されることが殆
どなく、エンドトキシンのみを選択的かつ効率的に除去
することが可能とされる。
状物を用いて、蛋白質の等電点以下のpHで処理するた
め、蛋白質が架橋キトサン粒状物に吸着されることが殆
どなく、エンドトキシンのみを選択的かつ効率的に除去
することが可能とされる。
[実施例]
以下に実施例及び比較例を挙げて本発明をより具体的に
説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の
実施例に限定されるものではない。
説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の
実施例に限定されるものではない。
なお、以下の実施例及び比較例において、エンドトキシ
ンの定量は生化学工業のトキシカラーシステムを用いて
行ない、アルブミンの定量は紫外線(280nm)の吸
光度を測定して行なった。
ンの定量は生化学工業のトキシカラーシステムを用いて
行ない、アルブミンの定量は紫外線(280nm)の吸
光度を測定して行なった。
実施例1
脱アセチル化度90モル%、平均分子量50000のキ
トサン70gを酢酸70gを含む水930gに溶解した
液を、10重量%水酸化ナトリウム水溶液中に攪拌下落
下させ、凝固析出させた。その後、十分洗浄して平均粒
径0.1mmの多孔質キトサンを得た。次に、水分を除
去後アセトンに加え、ヘキサメチレンジイソシアネート
で架橋した。
トサン70gを酢酸70gを含む水930gに溶解した
液を、10重量%水酸化ナトリウム水溶液中に攪拌下落
下させ、凝固析出させた。その後、十分洗浄して平均粒
径0.1mmの多孔質キトサンを得た。次に、水分を除
去後アセトンに加え、ヘキサメチレンジイソシアネート
で架橋した。
こうして得られた架橋キトサン粒状物を用いて次の試験
を行なった。なお、使用に際して、架橋キトサン粒状物
は0.2NのNaOH水溶液でアルカリ洗浄し、その後
エンドトキシンフリー水で十分に洗浄した。
を行なった。なお、使用に際して、架橋キトサン粒状物
は0.2NのNaOH水溶液でアルカリ洗浄し、その後
エンドトキシンフリー水で十分に洗浄した。
ウシ血清アルブミン(等電点4.8)5mg/mj2と
第1表に示す量のエンドトキシンとを含む試料液を、上
記で得られた架橋キトサン粒状物を内径10mm、長さ
100mmのカラムに充填したものに通液した0通液条
件は第1表に示す通りである。回収液のエンドトキシン
濃度を第1表に示す、なお、各試験において、アルブミ
ン回収率を紫外線吸収(波長280 mm)より求めた
結果、いずれも95%以上であった。
第1表に示す量のエンドトキシンとを含む試料液を、上
記で得られた架橋キトサン粒状物を内径10mm、長さ
100mmのカラムに充填したものに通液した0通液条
件は第1表に示す通りである。回収液のエンドトキシン
濃度を第1表に示す、なお、各試験において、アルブミ
ン回収率を紫外線吸収(波長280 mm)より求めた
結果、いずれも95%以上であった。
なお、各試験後、カラム中の架橋キトサン粒状物を0.
2NのNaOHと30分間接触させて再生し、水洗後、
同様の処理を繰り返したところ、いずれの場合において
も、はぼ同様の処理結果が得られた。
2NのNaOHと30分間接触させて再生し、水洗後、
同様の処理を繰り返したところ、いずれの場合において
も、はぼ同様の処理結果が得られた。
比較例1
通液条件のうち、pHを5.3としたこと以外は実施例
1の)ら、3と同様に試験を行なった。
1の)ら、3と同様に試験を行なった。
その結果、回収液のエンドトキシン濃度は0.9ng/
mi、アルブミン回収率は10%以下であり、エンドト
キシンの選択的かつ効率的な除去は達成されなかフた。
mi、アルブミン回収率は10%以下であり、エンドト
キシンの選択的かつ効率的な除去は達成されなかフた。
[発明の効果]
以上詳述した通り、本発明のエンドトキシンの除去方法
によれば、蛋白質及びエンドトキシンを含む液中から、
エンドトキシンのみを選択的かつ効率的に、容易に除去
することができ、エンドトキシン濃度が著しく低い処理
液を得ることができる。しかも、吸着材として用いる架
橋キトサン粒状物は耐アルカリ性に優れることから、ア
ルカリ洗浄により再生再利用が可能であり、極めて経済
的である。
によれば、蛋白質及びエンドトキシンを含む液中から、
エンドトキシンのみを選択的かつ効率的に、容易に除去
することができ、エンドトキシン濃度が著しく低い処理
液を得ることができる。しかも、吸着材として用いる架
橋キトサン粒状物は耐アルカリ性に優れることから、ア
ルカリ洗浄により再生再利用が可能であり、極めて経済
的である。
本発明のエンドトキシンの除去方法は、医薬品用蛋白質
溶液の精製方法等として、工業的に極めて有用である。
溶液の精製方法等として、工業的に極めて有用である。
Claims (1)
- (1)蛋白質とエンドトキシンとを含む液からエンドト
キシンを除去する方法において、該液のpHを該蛋白質
の等電点以下に調整した後、架橋キトサン粒状物を充填
したカラムに通水することを特徴とするエンドトキシン
の除去方法。
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1247014A JPH0720984B2 (ja) | 1989-09-22 | 1989-09-22 | エンドトキシンの除去方法 |
US07/583,657 US5169535A (en) | 1989-09-22 | 1990-09-17 | Method of removing endotoxin |
EP90118145A EP0424672B1 (en) | 1989-09-22 | 1990-09-20 | Method of removing endotoxin |
DE69026333T DE69026333T2 (de) | 1989-09-22 | 1990-09-20 | Methode zur Entfernung von Endotoxinen |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1247014A JPH0720984B2 (ja) | 1989-09-22 | 1989-09-22 | エンドトキシンの除去方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH03109397A true JPH03109397A (ja) | 1991-05-09 |
JPH0720984B2 JPH0720984B2 (ja) | 1995-03-08 |
Family
ID=17157113
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1247014A Expired - Fee Related JPH0720984B2 (ja) | 1989-09-22 | 1989-09-22 | エンドトキシンの除去方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0720984B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
PL443659A1 (pl) * | 2023-01-31 | 2023-09-11 | Uniwersytet Jana Kochanowskiego W Kielcach | Synteza i zastosowanie matrycy polimerowej do oczyszczania białek rekombinowanych z lipopolisacharydu bakteryjnego |
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---|---|---|---|---|
JPS6354285A (ja) * | 1986-08-26 | 1988-03-08 | Nitto Electric Ind Co Ltd | 熱溶融転写記録用被転写シ−ト |
JPS6356300A (ja) * | 1986-04-02 | 1988-03-10 | Dainippon Pharmaceut Co Ltd | 核酸またはエンドトキシンの除去剤および除去方法 |
JPH01158000A (ja) * | 1987-12-14 | 1989-06-21 | Fuji Spinning Co Ltd | 抗体固定化用担体の製造法 |
-
1989
- 1989-09-22 JP JP1247014A patent/JPH0720984B2/ja not_active Expired - Fee Related
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
PL443659A1 (pl) * | 2023-01-31 | 2023-09-11 | Uniwersytet Jana Kochanowskiego W Kielcach | Synteza i zastosowanie matrycy polimerowej do oczyszczania białek rekombinowanych z lipopolisacharydu bakteryjnego |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0720984B2 (ja) | 1995-03-08 |
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