JPH0440234A

JPH0440234A - エンドトキシンの除去方法

Info

Publication number: JPH0440234A
Application number: JP14953290A
Authority: JP
Inventors: Tsuneyasu Adachi; 恒康安達; Mikiji Enomoto; 幹司榎本; Masanori Hashimoto; 正憲橋本
Original assignee: Kurita Water Industries Ltd
Current assignee: Kurita Water Industries Ltd
Priority date: 1990-06-07
Filing date: 1990-06-07
Publication date: 1992-02-10

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明はエンドトキシンの除去方法に係り、特にタンパ
ク買溶液中のエンドトキシンを容易かつ効率的に、極低
濃度にまで除去することが可能なエンドトキシンの除去
方法に関する。

［従来の技術］バイオテクノロジーにより生産されたタンパク買等の医
薬品の精製においては、不純物であるエンドトキシンを
数ｐｇ／ｍｊＺ〜数１０ｐｇ／ｍＩｔにまで除去する必
要がある。従来、エンドトキシンの除去技術としては、
低分子キトサンを用いる方法が提案されている（特開昭
６３−５６３００号）、即ち、低分子キトサンを担体に
吸着させてカラムに充填し、このカラムに被処理液を通
液すると、低分子キトサンにエンドトキシンが特異的に
吸着して液中のエンドトキシンが除去される。

また、エンドトキシンを低濃度にまで除去する方法とし
て、イオンクロマトグラフィー　ゲルクロマトグラフィ
ー　アフィニティクロマトグラフィー（特公平１−１６
３８９号）なども検討されている。その他、特開昭６３
−２８７５０３号公報には、キトサンを固定したポリア
ミド徴多孔性膜を用い、この膜でエンドトキシン水溶液
を濾過することにより、エンドトキシンを吸着する技術
が例示されている。

［発明が解決しようとする課題］特開昭６３−５６３００号に開示される低分子キトサン
による方法では、エンドトキシンの吸着効率が十分では
なく、ｍ　ｇ　／　ｍ　ｊ２オーダーのものをｎ　ｇ　
／　ｍ　ｌオーダーまでに除去するには有効であるが、
ｐ　ｇ　／　ｍ　ＩＬオーダーまでの極低濃度にまで除
去するのは難しい。

イオンクロマトグラフィー　ゲルクロマトグラフィー　
アフィニティクロマトグラフィーによれば、ｐ　ｇ／ｍ
ＩＬオーダーまでの除去を目的として検討されているも
のではあるが、それぞれ欠点を有し、実用上有利な方法
とはいえない。即ち、ゲルクロマトグラフィーは、エン
ドトキシンの分子量分布が非常に広いため、タンパク質
などの高分子量物質との分離は困難であり、また、イオ
ンクロマトグラフィー　アフィニティクロマトグラフィ
ーは、平衡吸着量が小さい上に、ｐＨ、イオン強度、再
生条件などの条件設定が難しい。

更に、特開昭６３−２８７５０３号に開示される方法で
は、用いるポリアミド徴多孔性腹中のキトサン含量が１
０％以下と非常に低いため、エンドトキシンの平衡吸着
量が少なく、タンパク質溶液中のエンドトキシン除去に
は実用上不適当である。

本発明は上記従来の問題点を解決し、エンドトキシンを
極低濃度にまで高い処理効率にて除去することが可能な
エンドトキシンの除去方法を提供することを目的とする
。

［ｉ：１題を解決するための手段］本発明のエンドトキシンの除去方法は、エンドトキシン
含有液をキトサン膜と接触させることを特徴とする。

以下に、本発明の詳細な説明する。

まず、本発明で用いるキトサン膜の製造方法の一例につ
いて説明する。

本発明で用いるキトサン膜の製造に際しては、まず、キ
トサンの酸性水溶液を調製する。

キトサンは、カニ、エビなどの甲殻類の外殻皮などに含
有されているキチンを濃アルカリと共に加熱することに
より、脱アセチル化して得られる。このようにして得ら
れるキトサンは、通常、分子量５，０００〜２，０００
，０００、固有粘度（３０℃、０．２Ｍ酢酸＋０．１Ｍ
酢酸ソーダ）［η］＝０．２５〜２５　ｄ　１１７ｇ−
キトサン、コロイド当量１．０〜６．２ｍｅｑ／ｇ−キ
トサンのものである。本発明においては、特に分子量ｔ
ｏ、ｏｏｏ〜６００．０００、とりわけ２０．０００〜
２００，０００のキトサンを用いるのが好ましい。脱ア
セチル化の程度は特に制限はなく、酸を用いて溶解可能
な程度にまで脱アセチル化されていればよいが、好まし
くは脱アセチル化度８０〜１００ｍｏｕ％程度のものが
好適である。また、キトサンの平均粒径は９〜３００メ
ツシュ程度の粒状であることが好ましい。

このようして得られるキトサンの酸性水溶液を形成する
のに使用される酸は、キトサンを溶解するものであれば
いずれも使用できるが、代表的なものとしては、酢酸、
ギ酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、インプロピオン酸
、イソ酪酸、イソ吉草酸、安息香酸、ケイ皮酸、サリチ
ル酸、フタル酸などの有機酸類、塩酸、硝酸などの鉱酸
類などを挙げることができる。

使用する酸の量はできるだけ少ない方が好ましく、キト
サンを溶解する最低限の量で用いる。

般には、キトサンに対し、０．２〜５倍（重量）の酸を
添加する。

キトサン酸性水溶液におけるキトサンの濃度は、キトサ
ンの分子量と脱アセチル化度により適切な溶解濃度が決
定されるが、通常０．１〜２０重量％、好ましくは０．
５〜５．０重量％である。

なお、キトサン酸性水溶液中に不溶解物がある場合は、
ガラスフィルタあるいはステンレス、銅などの金網で濾
過した後使用するのが好ましい。

次いで、得られたキトサン酸性水溶液を、分子量が１０
，０００以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含
む液をドープ液として、織布上に流延し、これを塩基性
水溶液に浸漬する。用いる塩基性水溶液は、キトサン酸
性水溶液を中和してキトサンを凝固させるものであれば
良く、特に制限はないが、通常の場合、０．５〜１０重
量％程度のＮａＯＨ，ＫＯＨ，ＮＨ３等の塩基性水溶液
が用いられる。なお、この塩基性水溶液中には、必要に
応じて、水溶性の有機溶媒を加えても良い。

なお、キトサン酸性水溶液をＰＥＧを含む液をドープ液
として織布上に流延する場合、キトサン酸性水溶液にＰ
ＥＧ溶液を加えても良いが、キトサン及びＰＥＧに水を
加え、更に酸を加えて溶解させても良い。

用いるＰＥＧ量は、キトサンに対して５０〜２００重量
％程度とするのが好ましい。

′上記操作によりスキン層とハニカム層とからなるフィ
ンガーボイド（Ｆｉｎｇｅｒ−Ｖｏｉｄ）状のキトサン
膜が得られる。得られたキトサン膜は必要に応じて更に
架橋処理する。架橋処理は、キトサン膜に、必要に応じ
て適当な溶媒中にて架橋剤を加えて処理することにより
行なうことができる。ここで、用いる架橋剤としては特
に制限はなく、グルタルアルデヒド、エビクロロヒドリ
ン、有機ジイソシアネート類等を用いることができる。

架橋剤の添加量、即ち、架橋度はキトサンのアミノ基当
たり、０．２〜０．８当量とするのが好ましい。

架ＩＩｉ＆ｍ埋に用いる溶媒としては、メタノール、エ
タノール、イソプロピルアルコール等のアルコール類、
アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、ジメチル
ホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド等のア
ミド類やジメチルスルホキシドが使用できる。これら極
性溶媒は１種のみを使用しても、また、２種以上を混合
して使用しても良い。また、架橋剤の有機ジイソシアネ
ート類としては、例えば、４，４゛−ジフェニルメタン
ジイソシアネート、１．４−フェニレンジイソシアネー
ト、２．４−トリレンジイソシアネート、ナフタレンジ
イソシアネート、４，４°−ジシクロヘキシルメタンジ
イソシアネート、キシリレンジイソシアネート、イソフ
ォロンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソシアネ
ート等が挙げられる。

架橋処理条件は用いる架橋剤、溶媒の種類によって異な
るが、通常の場合、０〜６０℃で０．０５〜５時間行な
われる。

このようにして得られたキトサン膜をエンドトキシンの
吸着に使用するに際しては、まず、アルカリ溶液と接触
させることにより、吸着しているエンドトキシンを失活
させて除去する。アルカリ溶液としては、ＮａＯＨ，Ｋ
ＯＨ，ＮＨ３などの水溶液或いは、これらと有機溶媒と
の混合液で、濃度０．０１〜２Ｎのものを用いることが
できる。その後は、エンドトキシンを含まない滅菌水（
エンドトキシンフリー水）を用いて水洗し、余剰のアル
カリを洗浄除去する。水洗後は、これをそのままエンド
トキシン除去に用いることができるが、必要に応じて、
前記キトサンの酸性水溶液の調製に用いた酸の水溶液或
いは、これらと有機溶媒との混合液で、濃度０．０１〜
２Ｎのものと接触させて、キトサンのアミノ基を解離型
として用いることもできる。酸と接触させた場合は、そ
の後更にエンドトキシンを含まない減菌水で水洗して、
余剰の酸を洗浄除去する。

本発明においては、例えば処理するエンドトキシン含有
液を、上述のキトサン膜に通液することにより接触させ
るが、この場合、通液条件はＬＶ＝１５ｃｍ／ｈｒ以下
、好ましくは２〜１０Ｃｍ／ｈ　ｒ、５Ｖ＝４３０　Ｂ
Ｖ／ｈ　ｒ以下、好ましくは５０〜３００　Ｂ　Ｖ／ｈ
　ｒとするのが好ましい。

なお、本発明において、エンドトキシンの除去を行なう
被処理液であるエンドトキシン含有液中に、キトサン膜
に吸着される可能性のあるタンパク質やアニオン性薬剤
等の吸着性物質が含有されている場合であっても、液の
ｐＨ１イオン強度を調整することにより、他の条件はそ
のままで、容易にエンドトキシンの選択的除去を行なう
ことができる。例えば、被処理液中にエンドトキシン以
外の吸着性物質が含有されていない場合にはｐＨ９以下
で処理するのに対し、タンパク質等の吸着性物質が含有
されている場合には、当該タンパク質の等電点（ｐ＋）
以下であってその近傍のｐＨ１好ましくはｐｉより０．
５以上低いｐＨで処理することにより、エンドトキシン
の選択的除去が可能とされる。即ち、タンパク質はｐＩ
以下ではプラス荷電が多い状態となり、一方、キトサン
もプラスであるため、タンパク質は吸着され難くなり、
エンドトキシンのみが吸着されるようになる。

本発明に使用したキトサン族は、前述と同様のアルカリ
水溶液での洗浄及び水洗を行なうことにより再生、再使
用が可能である。

［作用］キトサンはエンドトキシンの平衡吸着量が大ぎく、単位
体積当りの吸着量が大きいため、大量の負荷が可能であ
り、エンドトキシンを極低濃度にまで効率的に吸着除去
することができる。

また、エンドトキシン吸着液の通液に際しては、適用通
液速度の範囲で差圧が殆ど生じることがなく、工業的に
有利である。

しかも、ｐＨ調整を行なうことにより、ｐＩ以下のｐＨ
で安定なすべてのタンパク買含有液に適用することがで
き、液中のエンドトキシンの選択的な吸着除去が可能で
ある。

［実施例］以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。

なお、本発明において、用いるキトサン膜は実施例の方
法で製造されたものに何ら限定されず、他の方法で製造
されたキトサン膜を用いることができることは言うまで
もない。

以下の実施例において、エンドトキシンの定量は生化学
工業のトキシカラーシステムを用いて行ない、アルブミ
ンの定量は紫外Ｍ（２８０ｎｍ）の吸光度を測定して行
なった。

実施例１［キトサン膜の製造］固有粘度［η］が３．２　（ｄｕ／ｇ）、コロイド当量
値がｓ　、　２　（ｍ　ｅ　ｑ　／　ｇ　）　、分子量
約１０万、粒径９メツシユパス〜８０メツシユ・オン、
平均粒径１６〜２４メツシユ、脱アセチル化度１００ｍ
ｏＡ％であるキトサン７ｇ及び分子量２万のＰＥ０６ｇ
に水を加え全量をｉ　００ｇとして、これに氷酢酸２．
７ｇを加えた。キトサンが完全に溶解した後、濾過及び
脱気を行ない、この溶液をガラス板上のポリエステル織
布（２００メツシユ）上に流延した。これを４重量％Ｎ
ａＯＨ水溶液に浸漬して、キトサンを凝固させた後、十
分に水洗し、キトサン膜を得た。

得られたキトサン膜をＤＭＦ／アセトン＝２／１　（Ｖ
／Ｖ）の溶液で置換した後、同組成のＤＭＦ／アセトン
溶液中に浸漬し、キトサンのアミノ基当り０．２モルの
へキサメチレンジイソシアネートを加え、室温で１時間
放置した。これにより、直径４７ｍｍ、厚さ０．３５ｍ
ｍのキトサン膜を得た。

［エンドトキシンの除去試験コ上記方法により得られたキトサン膜を、ホルダーにセッ
トして、０．５ＮＮａＯＨ水溶液で洗浄後、滅菌水（エ
ンドトキシンフリー水）でアルカリを洗浄した。更に、
ｐＨ４，３、イオン強度０．０２の酢酸バッファーで置
換して試験に用いた。

試験は、ｐＨ４，３、イオン強度０．０２の０．５重量
％アルブミン水溶液（アルブミンのｐｌ＝４．８．２２
０ｎｇ／ｍＡのエンドトキシンを含む、）を、膜体積０
．６ｍｆ＝ＩＢＶとして、５７　Ｂ　Ｖ　／　ｈ　ｒで
通液して、膜圧口のエンドトキシン濃度及びアルブミン
濃度を測定することにより行なった。その結果、アルブ
ミンの回収率は９０％以上であるのに対し、膜圧口のエ
ンドトキシン濃度は４０ｍＪ２通液時点でｏ、　３万ｇ
／ｍｌＬにまで減少しており、エンドトキシンの選択的
な吸着除去が行なわれたことが確認された。

［発明の効果］以上詳述した通り、本発明のエンドトキシンの除去方法
によれば、エンドトキシン含有液から、エンドトキシン
を選択的かつ効率的に、工業的に有利に吸着除去して、
その含有量を極低濃度にまで低減することができる０本
発明の方法によれば、用いるキトサン膜の平衡吸着量が
多いため、少量のキトサン膜で大量の液を処理すること
が可能とされる。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）エンドトキシン含有液をキトサン膜と接触させる
ことを特徴とするエンドトキシンの除去方法。