JPH0297396A - 生理活性を有するオリゴガラクツロニドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

（イ）産業上の利用分野 本発明は、植物の微生物感染に対する防御機能を増強し
、農作物を安全かつ効率的に栽培することを可能とする
物質であるオリゴガラクツロニド（ｏｌｉｇｏｇａｌａ
ｃｔｕｒｏｎｉｄｅ）を、高純度かつ高収率で製造する
方法を提供するものである。 （「Ｉ）従来の技術とその課題 本来、植物には様々な感染防御機能か備わっており、多
くの微生物感染に抵抗力を持つことか知られているか、
それらは決して完全なものとは云えず、高収量、高品質
をめざす現在の作物栽培においては、微生物感染を防ぐ
ための大量の農薬散布か必要とされている。例えば、種
蒔時に種子に薬剤を施して健全な発芽を促し、生長期、
結実間にさらに薬剤を散布して微生物感染からの被害を
低減させている。 しかし、従来の方法では作物に残留した農薬の人体に対
する影響や、環境中への農薬の拡散ににるｌη染）、安
全性の面で問題点が多くみられる。 一方、高等植物の細胞壁を構築する多糖類は種々のもの
か知られているが、近年、これらの多糖類の分解物の中
に、感染防御反応や分化誘導などの植物の生理機能を調
整する因子が発見され、報告されている。 例えば、特定のオリゴガラクツｌ’ｆｆ　７酸は、ダイ
ズの抗菌性物質（ファイトアレキシン（ｐｈｙｔ。 ａｌｅｘｉｎ））、　　プロテアーセイ／ヒビター等の
誘導生成を促進し、感染抵抗性をイ１与する働きかあり
、さらに、タバコカルスの開花促進作用を示すことが知
られている。また、ザイカモアカエデの組織培養細胞か
ら調製されるキンログルヵンのオリゴ糖は、エントウの
芽生えに対するオーキシンの生長促進作用を抑制する効
果があることか知られている。 このようなオリゴ糖類の生理活性は、今後の作物栽培の
革新に大いに寄与するものと考えられており、これらの
生理活性を佇するオリゴ糖の調製方法の効率化、高収量
化が必要とされている。 （ハ）課題を解決するための手段 本発明者は、抗菌性物質誘導効果（エリジター（ｅｌｉ
ｃ己ｏｒ）活性）を有するオリゴガラクツロニドを高収
率で製造する方法について検討した。その結果、高メト
キシルポリα−１４−Ｄ−ガラクツ「１ニドを主成分と
するペクチ／にペクチン酸リアーゼを作用させることに
Ｊ、す、高収率でオリゴガラクツ

【」ニドを産生でき、
さらにとのオリゴ糖のメチルニスデルを加水分解処理す
ることにより、イオン交換クロマトグラフィーによる分
離精製か容易になることを見出し、本発明を完成するに
至った。 さらに、本発明者は、単離したオリゴガラクノ口二Ｆの
うち、重合度が６．９．１０または１１のものか特に強
いエリジター活性を有していることを見出した。なかで
も重合度６のオリゴガラクツ０ニドに関しては、従来エ
リジター活性についての報告か全くなされておらず、本
発明の方法にて高度に純粋に単離することによって初め
て、その強い活性が確認されたものである。 本発明で用いられる高メトキシルα−】　４Ｄ−ガラク
ツロン酸を主成分とするペクヂノ質多糖類としては、い
かなる植物由来のものでもよい。 例えばリンゴペクヂン、シトラスペクヂノ、愛玉子ペク
チン等が用いられるが、純度が高く、主鎖中にラムノー
スや分岐をほとんど含まない愛玉子ペクチンが特に好ま
しい。愛玉子ペクチンは、愛玉子イタビ（Ｆｉｃｕｓ　
ａｗｋｃｏｔｓａｎｇ　Ｍａｋｉｎｏ）の種子を加熱し
てペクヂ／に作用する酵素を失活させた後、抽出１分離
、精製することによって得られ、直鎖の高メトキシルα
−１，，４−Ｄ−ガラクツロニドから構成される。 ペクチンに作用させるペクチン酸リアーゼは、ペクチン
リアーゼやペクヂ／エステラーゼの活性を実質的に含ま
ないものであることが必要とされるが、本発明において
は、植物病原菌ノ一種テあるＥｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏ
ｔｏｖｏｒａの培養濾液をＣＭ−ＳｅｐｈａｄｅｘＣ−
５０を用いたイオン交換クロマトグラフィーで精製した
ものを用いた。 本発明によれば、ペクチン酸リアーゼが高メトキシルペ
クチン主鎖中のメチルエステル化されていないガラクツ
ロン酸部分に作用し、β−説離作用によってグリコシド
結合が切られ、適当な鎖長のオリゴガラクツロニドか生
成される。生じたオリゴガラクツ０ニドは、エタノール
添加により白色沈殿として容易に得られる。このように
して得られるオリゴガラクンロニトは、種々の重合度の
ものを含む混合物であり、そのまま生理活性物質として
用いることもてきるが、活性を効率的に利用するために
は、活性の強いオリゴガラクツロニドを単離して用いた
方が好ましい。 本発明によれば、オリゴガラクツロニド混合物の水溶液
に水酸化ナトリウムを加えて脱メチルエステルした後に
イオン交換クロマトグラフィーで分離することにより、
重合度１から１２のオリゴガラクツ０ニドを高純度、高
収率で得ることができる。 （ニ）作用 本発明によって得られるオリゴガラクツロニトは、種子
への塗布、土壌中への添加１葉面への散布の他、水耕栽
培時における液体肥料中への添加等の方法で植物に投与
することにより、栽培植物の微生物感染に対する生体防
御機能の促進物質として利用することかできる。 （ホ）実施例 り下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが
、本発明はこれに限定されるへきものてはない。 ［実施例１コ　オリゴガラクンロニトの製造方法（１）
　　区玉子ペクチンの調製 本発明において用いられる愛玉子ペクチ／は、特開昭６
３−２０９５５３号に記載の方法に準じて調製した。 （２）　　ペクチン酸リアーゼの調製 野菜類の軟腐病病巣から分離したＥｒｖｉｉｎｉａ　ｃ
ａｒｏ−ｔｏｖｏｒａの野生体の培養濾液から得られた
酵素標品５０００単位（ｐＩ４９．０の緩衝液の条件下
３０°Ｃて反応して、１分間あたり１μＭのガラクツロ
ン酸を遊ｉ１Ｅすることかできる酵素量を、１単位とす
る。、）を、ｌ０ｍＭす／酸カリウム緩衝Ｇ　（ｐｌｌ
　７．３）　２００＋１に７Ｂ解し、遠心分離により不
溶物を除去した後、同緩衝液で平衡化したＣんｌ−５ｅ
ｐｈａｄｅＸＣ−５０のカラム（２，ＧＸ　７０ｃ＋＋
）に添加し、同緩衝液で洗浄した。 溶出は同緩衝液に塩化ナトリウムを添加し、塩化リート
リウム濃度かＱ−０，８Ｍのグラジエントにより溶出を
行った。 に３）　　ペクグーンの酵素分解 愛玉子ペクチン１ｇをＯ，１Ｍアンモニア緩衝液（１）
Ｉ−Ｔ　９．０）　４００ｍ１に溶解し、Ｅｒｗｉｎｉ
ａ　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａのペクチン酸リアーゼ１１５
単位を加え、３０°Ｃで１時間インキュベートした。反
応終了後、遠心分離により不溶物を除去し、等量のエタ
ノールを加え。 沈殿物を乾燥し、分解物０］Ｏｍｇを得た。 （４）　　オリゴガラクツロニトの分離精製ペクチン溶
液にＮ　ａ　Ｏ］（溶液を加え、０．０５ＮＮ　ａ　Ｏ
Ｉ（とじ、Ｏ″Ｃ１９０分間脱エステル処理した後、２
倍量のエタノールを加え、生じた沈殿物を脱イオン水に
溶解後、真空凍結乾燥によりペクチノ酸す−）・リウム
塩を調製した。このペクチン酸づ−）　ＩＪウム塩（０
，９４ｇ　）を＋００ｍＭイミダゾール緩衝液（ｐＩ−
１７，０）　５００ｍ１に溶解し、同緩衝液で平衡化し
たＱＡＥ−３ｅｐｈａｄｅｘ　Ａ−２５のカラム（２，
５Ｘ　２０ｃｍ）に添加し、同緩衝液で洗浄後、同緩衝
液２７２の０．２−０．８Ｍのグラジェントにより溶出
した。なおガラクツロン酸の定量方法はｍ−ｈｙｄｒｏ
ｘｙｄｉｐｈｅｎｙｌ法（旧ｕｍｅｎｋｒａｎｔｚ、Ｎ
、　　ａｎｄ　　Ａｓｂｏｅ−１１ａｎｓｅｎ、Ｇ、（
１９７３）Ａｎａｌ、旧ｏｃｈｅｍ、、５４，４８４＞
に従った。これにより、図１に示すように、１２のフラ
クションに分離でき、重合度が１２以下のオリゴガラク
ツロニトがそれぞれ単離できた。オリゴガラクツロニド
の重合度はＦＡＩＩ−ＭＳを用いて確認した。例えば、
図１における第６番目のフラクションの場合は、図２に
示すように、１０５５．８７９．７０３．５２７．３５
１とフラグメンテーションによるイオンピークがみられ
ることから、重合度６のオリゴガラクツロニドであると
とが確認できた。 ［実施例２コニリンター活性（ファイトアレキシン誘導
活性）の測定 発芽後８−９日経過したダイズ子葉を水道水て洗浄し、
濾紙」−で表面の水分を取った後、メスを用いて表面下
１ｍ１Ｎの深さでツノ・ソトした。この子葉１０個を１
群として濾紙を敷いたシャーレ」―番こ置き、オリゴガ
ラクツ０ニド溶液５０１ｚｇ／９０μβ／子葉をン仇下
した。細菌による汚染を防ぐために０．０２％のストレ
プトマイシンを添加した水３ｍｌをσ・２紙にしみこま
せ、湿潤状態とし、２６°Ｃで２４時間インキュベート
した。 イノキュベート終了後、子葉１０個を脱イ詞−ンｙｋ１
０ｍｌに２１し、ファイドアレキジノを抽＋Ｊ４　Ｌ　
、この抽出液をさらに１０倍に希釈した。ダイズのファ
イトアレキシンの主成分であるグリセＪ　’Ｊ　７類番
よ２８ＧｎｌＩＸ付近に強い吸収極大をもつため、２Ｂ
６ｎｍの吸収を測定し、エリジター活性とした。なお」
二Ｊ己実験は２回繰り返し、その平均価を測定価として
下した。 単離した重合度４〜１２のオリゴガラク゛７０ニドそれ
ぞれについて、この方法により測定した工１ノンター活
性を表１に示す。 表１ 」１記の結果から、オリゴガラクツロニドのうち重合度
６，９．１０または１１のものが特に強いニリンター活
性を有することがわかった。

【図面の簡単な説明】

図１はＱＡＥ−５ＥＰＩＩＡＤＥＸ八−２５のカラムを
用いて溶出した重合度１〜１２のオリゴガラクツロニド
の分離パターンを示す。 図２は重合度６のオリゴガラクンロニトのＦへＢＭＳの
結果を示す。 特許出願人　大日本製薬株式会社

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）ペクチンにペクチン酸リアーゼを作用させること
   を特徴とするオリゴガラクツロニドの製造方法。
2. （２）ペクチンが愛玉子（￥Ｆｉｃｕｓ￥￥ａｗｋｅｏ
   ｔｓａｎｇ￥￥Ｍａｋｉｎｏ￥）の種子より得られるペ
   クチンである特許請求の範囲第（１）項記載のオリゴガ
   ラクツロニドの製造方法。
3. （３）ペクチンにペクチン酸リアーゼを作用させて得ら
   れるオリゴガラクツロニド混合物から生理活性を有する
   オリゴガラクツロニドを単離するに際し、オリゴガラク
   ツロニド混合物を脱メトキシルした後に、イオン交換ク
   ロマトグラフィーによって分離することを特徴とするオ
   リゴガラクツロニドの単離方法。
4. （４）オリゴガラクツロニドの重合度が６である特許請
   求の範囲第（３）項記載のオリゴガラクツロニドの単離
   方法。