JPH029393A

JPH029393A - ウシの伝染性病原ウィルスと特異的に反応するモノクローナル抗体の製造方法

Info

Publication number: JPH029393A
Application number: JP63158035A
Authority: JP
Inventors: Hironori Murakami; 浩紀村上
Original assignee: Sapporo Breweries Ltd
Current assignee: Sapporo Breweries Ltd
Priority date: 1988-06-28
Filing date: 1988-06-28
Publication date: 1990-01-12

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明はウシの伝染性病原ウィルスと特異的に反応する
モノクローナル抗体の製造方法に関する。

〔従来の技術および発明が解決しようとする課題〕牛に
重大な疾病を引き起こすウィルスは各種あり、例えばア
ルボウィルス利に属するアカバネウィルスは牛の流産、
早産、死産および異常分娩を引き起こす流行性の病原ウ
ィルスである。ラブドウィルス科に属するウシ流行熱ウ
ィルスは象、外熱性の伝染病である牛流行熱を引き起こ
す。この疾病は感染率が高いが、その症状が激しい割に
は死で率は低い、しかしながら、泌乳の減少や停止。

肉質や産肉の低下などによる経済的損害は大きい。

また、レオウィルス科のオルビウィルス属に分類される
イバラキウィルスは牛にイバラキ病を引き起こす流行性
病原ウィルスである。この疾病は［］内炎、咽喉頭およ
び食道の麻ひによる曝下障害を主機とし、感染率が高く
死亡率も高い。

家畜のウィルス病を診断する際、ウィルスが血流中に存
在しなかったり、あるいは存在した場合でも濃度が極め
て低い場合は、血流中に妨害物質が多く含まれることか
ら、血液検査によってウィルス自体を検出することは当
然のことながら容易ではない。しかしながら、動物がウ
ィルスに感染すると免疫系が働き、ウィルスに対する抗
体が血流中に多く産出されるため、この抗ウイルス抗体
が血流中に存在することは、その動物が過去にウィルス
に感染していたことを示し、抗ウイルス抗体の血流中に
おける濃度が高いことは、その動物が現在ウィルスに感
染していることを示す。抗ウイルス抗体を検出すること
は、ウィルスを検出することよりも比較的容易であり、
また感度が高い。

この方法は、ウィルス感染の有無を検査する場合の間接
的手段として利用できる。

現在の動物ウィルス用ワクチンは、免疫原物質以外の不
純蛋白による副作用が問題となっている。

また、診断薬においてもポリクローナル抗体使用に起因
する非特異的反応や、感度の低さ等の問題点が指摘され
ている。従って、ワクチンにおいてはより安全で有効な
ものが望まれ、診断薬においては手技が節便であり、か
つより非特異的反応が少なく、しかも高感度のものが望
まれている。

このような現状において注目されているのが病原ウィル
スに対するモノクローナル抗体である。

病原ウィルスに対するモノクローナル抗体は、特異抗原
の検出・同定による診断、アフィニティーカラムクロマ
トグラフィーによる特異抗原の精製。

更にこれを用いての抗体測定やコンポーネントワクチン
の作出、ウィルス構成蛋白やその変異に関する研究、抗
イデイオタイプワクチンの作出等に利用できる有用なも
のである。

〔課題を解決するための手段〕

そこで６１本発明者は牛に重大な疾病を引き起こすアカ
バネウィルス、牛流行熱ウィルスおよびイバラキウィル
スに特異的に反応するモノクローナル抗体を得ることを
目的として鋭意研究を行った結果、本発明を完成させた
。

すなわち、本発明はウシの伝染性病原ウィルス弱毒株を
免疫原として得られた怒作Ｂリンパ球をハイブリドーマ
として選別し、これを培養してウシの伝染性病原ウィル
スと特異的に反応するモノクローナル抗体を産生させ、
該抗体を回収することを特徴とするウシの伝染性病原ウ
ィルスと特異的に反応するモノクローナル抗体の製造方
法を提供するものである。

本発明のモノクローナル抗体は、アカバネウィルス、牛
流行熱ウィルスおよびイバラキウィルスの中の少なくと
も１種を免疫原として得られた感作Ｂリンパ球をハイプ
リドーマとして選別し、これを培養することによって得
ることができる。

免疫原としてのウィルス株には、例えば＾ｋａｂａｎｅ
ｖｉｒｕｓ　０ＢＥ−１株、　　Ｂｏｖｉｎｅ　ｌＥｐ
ｈｅｍｅｒａｌ　　Ｆｅｖｅｒ（ＢＥＦ）ＹＨＬ株、　
ｆｂａｒａｋｉν１ｒｕｓｋ２株などがある。これらは
いずれもワクチン用に作製された弱毒株であり、牛に対
する感染性を持たないことが確認されている。これらウ
ィルス株はいずれも農林水産省家畜衛生試験場から分与
されたものである。

ウィルスワクチン製剤製造のためのウィルスは、従来か
ら血清含有環地中で増殖させた宿主細胞を用いて生産さ
れてきた。しかし、この方法には二つの難点がある。そ
の一つは、細胞の培養に使用する血清中に、そのウィル
スに対する抗体が含まれていないことが必要なことであ
る。もし、使用する血清中に目的ウィルスに対する抗体
が存在すれば、ウィルスの増殖を阻害する。従って、使
用する血清はあらかじめ抗ウイルス抗体を含んでいない
ことを磯定する必要がある。さらに、大規模にウィルス
を生産しようとする場合には当然多量の血清が必要とな
るが、抗ウイルス抗体を含んでいない血清、すなわちウ
ィルスに感染していない個体の血清を多量に得ることは
必ずしも容易ではない。第二は、血清は物理的、化学的
に性質の異なったタンパク譬を大量に含んでいるため、
血清含培養からウィルスを精製するためには多くの操作
を必要とし、ウィルスの回収量も少なくなることである
。現在のワクチン製剤は、大なり小なり血清タンパク質
（−最にはウシ由来）を含んでいる。このことは、この
ウィルス製剤を特に異種動物に繰り返し投与する場合に
はウシ血清タンパク質に基づく抗原抗体反応を惹起し、
重大な障害となることがある。無血清培地で増殖させた
ウィルスから製造されるワクチン製剤にはこのような欠
点はないため、これらの点で無血清培地中でウィルスを
生産することが強く望まれる。

そこで、本発明者は上記ウィルスの増殖に用いる培地に
ついて検討した。ハムスター胎児由来のＨｍＬｕ−１細
胞は各種ウィルス生産に用いられるが、このＨｍＬｕ−
１細胞を無血清で培養する条件を検討した結果、この細
胞が無血清ＤＦ培地中で旺盛に増殖することを見出した
。さらに、この無血清培地中のＨｍＬｕ−１細胞のウィ
ルス生産性を試験したところ、無血清培地中でウィルス
量が最高値に達するための期間は血清培地中でのそれに
比較して若干遅れるが、生産されるウィルスの量は画壇
地間で差が認められないこと、血清培地中ではウィルス
量が最高値に達した後活性が低下することを見出し、無
血清培地でも十分にウィルスが生産されることを確認し
た（後記の参考例を参照）。

ウィルス増殖用の宿主細胞であるハムスター胎児由来の
細胞株Ｈｍ　Ｌ　ｕ　−１は血清を含まないＤＦ培地（
ＤＭＥ培地：　ｆｌａｎｋ’ｓ　Ｆ　−１２培地−１：
Ｉ。

Ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ　Ｄ　Ｆ培地、以下５Ｆ−ＤＦ培
地と称す。）で継代したものを用いる。なお、５Ｆ−Ｄ
Ｆ培地１１中にはバクテリアの増殖防止のためにペニシ
リンＧカリウムｌＯ万単位、ストレプトマイシン硫酸塩
０．１ｇ、緩衝剤としてＨＥＰＥＳ１５ｍＭ、ｐＨ調節
のためにＮ　ａ　ＨＣＯｚ　　１４　ｍＭを添加する。

ｌ１ｍＬｕ−１細胞はプラスチックシャーレに接種し、
加湿した５％ＣＯ□−９５％空気を通気した炭酸ガス恒
温器中で培養する。

ウィルスの増殖は次のようにして行うことができる。Ｈ
ｍＬｕ−１細胞をＩ　Ｘ　１０５ｃｅｌｌｓ／Ｒの割合
で９０［ｌｌｆｆ１径のシャーレにまきこみ、５Ｆ−Ｄ
Ｆ培地中で２日間培養し、培地を除去後、ｐｈｏｓｐｈ
ａ　ｔｅ〜ｂｕｆｆｅｒｅｄ　５ａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）
に懸濁した上記のウィルスを接種し、３７°Ｃで９０分
間保持する。細胞に吸着していないウィルスをＰＢＳで
洗浄後、５Ｆ−ＤＦ培地を添加し、３７°Ｃの炭酸ガス
恒温器中で培養を継続する。経口的に墳養液を回収し、
項九中の活性ウィルス粒子を以下に述べるプラーク法に
よって測定する。３５ｍ５径のシャーレにＨｍＬｕＶ−
１細胞をｌ　Ｘ　１０　’　ｃｅｌｌｓ／ｉｄでまきこ
み２日間培養し、次に５Ｆ−ＤＦ培地で希釈したウィル
ス液０．５ｄ！を培地を除去した上記シャーレに接種し
て９０分間恒温器中に放置し、ウィルスを吸着させる。

ウィルス液を除去した後に、後述する寒天添加維持培地
を２ｄ加え、寒天が固まってから３７゛Ｃの炭酸ガスイ
ンキュベーター中で２日間培養する０次いで、後述する
中性赤添加維持培地を１雇重層し、１日後プラーク数を
数える。なお、寒天添加維持培地はアガロース（ＭＥ、
　シーケム社）の１％溶液と２倍濃度の５Ｆ−ＤＦ培地
を４０゛Ｃで保温し、使用直前に等量ずつ混合する。中
性赤添加維持培地は０．２５％ニュートラルレッド（和
光純薬）、１％アガロース溶液および５倍濃度５Ｆ−Ｄ
Ｆを４０°Ｃで保温し、使用直前に３；５；２の割合で
混合して調製する。

このようにして得られたウィルスの部分精製を（１）８
０％硫安分画、（２）ゲルろ過（ＴＳＫ−ＧＥＬＨＷ−
５０）、（３）陰イオン交換クロマトグラフ４−（Ｍｏ
ｎｏ　Ｑ）、　（４）真空凍結乾燥、（５）ゲルろ過（
ＴＳＫ−ＧＥＬ　　Ｇ３０００ＳＷ）の５ステツプで行
う。ウィルス画分の溶出位置はＨｍＬｕ−１細胞に対す
る感染活性を観察することで決定する。

まず、最初に、ウィルスを濃縮する目的で８０％硫安分
画を水冷しながら４時間行う、硫安沈澱物は１０　ｍ　
Ｍ　　Ｎａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ
７，３）に溶解してゲルろ過を行い、ｖｏｉｄ　ｖｏｌ
ｕｍｅ画分を回収する。この操作によって、宿主細胞お
よび培地由来の低分子画分と硫安を除く。続くゲルろ過
はＴＳＫ−ＧＥＬ　　ＨＷ−５０（東ソー）カラムをＦ
　Ｐ　Ｌ　Ｃ（Ｆａｓｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１ｉｑｕｉ
ｄ　　Ｑｌｌｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）システムに接
続して行う６次に、陰イオン交換クロマトグラフィーを
Ｍｏｎｏ　Ｑ（ファルマシア）カラムを用いて行う。５
ｔａｒｔ　ｂｕｆｆｅｒはゲルろ過のｅｌｕｔｉｏｎｂ
ｕｆｆｅｒと同じｌ　ＯｍＭ　Ｎａ−ｐｈｏｓｐｈａｔ
ｅ　ｂｕｆｆｅｒを用い、これにＩＭ　　ＮａＣｆｆ１
を含むｂｕｆｆｅｒでリニアグラジェントをかけて溶出
させ、ＮａＣｆ　　６６０８１０ｍＭの溶出画分を回収
する。さらに、凍桔乾燥とゲルろ過を組み合わせて脱塩
と濃縮を行う。ゲルろ過はＨＰ　Ｌ　ＣシステムにＴＳ
Ｋ−ＧＥＬＧ３０００ＳＷ（東ソー）カラムを接続して
行う。

ｅｌｕｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒは１０　ｍＭ　Ｎａ−ｐ
ｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｐｌ！７．３を用い、
νｏｉｄ画分をウィルス部分精製品とする。

次に、ハイブリドーマの作製を行う、　Ａｋａｂａｎｅ
ｖｉｒｕｓ　０ＢＥ−１およびＢＥＰ　ＹＩＩＬについ
ては、ウィルス培養液を免疫原として用い、またＩｂａ
ｒａｋｉ　ｖｉｒｕｓＮａ２については、部分精製ウィ
ルスを免疫原とする。ハイブリドーマの作製は、Ｐ３Ｘ
６３Ａｇ８Ｕ１細胞を親細胞として常法のポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ）法により行う。

続いて、このようにして得られたハイブリドーマを培養
してアカバネウィルス、牛流行熱ウィルスおよびイバラ
ギウィルスに特異的に反応するモノクローナル抗体を生
産する。培養は上記ハイブリドーマが増殖しうる培地、
例えばＩＴＥＳ−ＤＦなどを用いて行えばよい、培養液
から抗体を回収するには、遠心分離、塩析、透析等の手
段を適宜組合せて行えばよく、必要により、さらに精製
する。

なお、抗体の検出は以下の方法で行えばよい。

Ａｋａｂａｎｅ　ｖｉｒｕｓ　０ＢＥ４については、１
次スクリニングは０８ｆ？−１感染ＨｍＬｕ−１ｔｔｉ
Ｂ胞と非感染８ｍＬｕ−１細胞を抗原としてＥＬＩＳＡ
法により行い、２次スクリーニングは蛍光抗体法で行う
。

ｒｂａｒａｋｉ　ｖｉｒｕｓ　Ｎｏ、２とＢＥＩ’　Ｙ
ＨＬについては、部分精製ウィルスを抗原としＥＬＩＳ
Ａ法により行う。

このようにして、ウシのウィルス性伝染病であるアカバ
ネ病、牛流行熱およびイバラキ病の病原ウィルスの１種
もしくは２種以上と特異的に反応するモノクローナル抗
体、具体的には４　Ｆ−１２゜８Ｂ−９，８Ｂ−１０，
８Ｂ−１１，ＩＡ−４゜２Ａ−２，５Ｇ−７，Ｙ−ＩＥ
６−８．Ｙ−ＩＡ９−１１．Ｙ−ＩＡ９−１９．ｌ−ｌ
Ａｌ、ｌ−ＩＦ５などを製造することができる。

本発明のモノクローナル抗体は、マウス型抗ウイルスモ
ノクローナル抗体と呼ばれるものであり、このモノクロ
ーナル抗体を一次抗体としてサンドインチ法により、牛
がウィルスに感染しているかどうかを調べることができ
る。その方法は以下に示す通りであり、この方法は特殊
な技術を要しない前便な診断法である。また、サンドイ
ンチ法を採用することにより、検体の前処理を簡便に済
ませることができる。

まず、イムノアッセイ用９６六マイクロタイタープレー
ト上に本発明の病原ウィルスを認識するマウス型抗ウイ
ルスモノクローナル抗体（−次抗体）を吸着させる０次
いで、非特異的な結合を阻止する目的で反応系とは無関
係のタンパクＸ（例えば、牛血清アルブミン等）を吸着
させる。続いて、ウィルス粒子あるいはウィルス抗原を
加えると、特異的にマウス型抗ウイルスモノクローナル
抗体に結合される。検体である牛の血液をＰＢＳで希釈
してプレートに加えると、血液中の抗ウイルス抗体は特
異的にウィルス粒子あるいはウィルス抗原と結合する０
次いで、ペルオキシダーゼなどの酵素で標識されたマウ
ス型抗ウシイムノグロブリン抗体（市販品）をプレート
に加えると、ウシ型ウィルス抗体に特異的に結合する。

ここに、基質を加えて酵素反応を行わせた後、吸光度を
測定することにより、ウィルスに感染しているかどうか
を判定することができる。

〔実施例〕

次に、実施例により本発明を説明する。

参考例（ＨｍＬｕ−１細胞の無血清培養とウィルス生産
性）基本合成培地ＤＭＨに成長因子ＩＴＥＳを添加したＩＴ
ＥＳ−ＤＭＥ培地および基本合成培地ＤＦ（ＤＭＥ培地
：Ｈａｎｌ”ｓ　Ｆ　−１２培地＝１　：　１）に成長
因子ＩＴＥＳを添加したＩＴＥＳ−ＤＦ培地で各ＨｍＬ
ｕ−１細胞を６　Ｘ　１０　’　ｃｅｌｌｓ／ｍｌの割
合でφ３５ｍｍのシャーレにまきこみ、１０日間培養を
行ったところ、到達密度がＩＴＥＳ−ＤＭＥ。

培地では４．　ＯＸ　１０　’　ｃｅｌｌｓ／ｄに留ま
ったのに対し、ＩＴＥＳ−ＤＦ培地では２．５　Ｘ　１
０　’　ｃｅｌｌｓ／−にも達し、Ｈｍ　Ｌ　ｕ　−１
細胞の栄養要求性を高度に満たしていることを示した。

次に、ＤＦ培地にＮＢＣ３（ウシ胎児血清）を１０％添
加したＮＢＣＳ−ＤＦ培地および血清と成長因子を含ま
ない５Ｆ−ＤＦ培地で各々Ｈｍ　Ｌ　ｕ−１細胞を６　
Ｘ　１０　’　ｃｅｌｌｓ／ｍＩｌの割合でφ３５Ｍの
シャーレにまきこみ、ＩＯ日間培養を行ったところ、倍
加時間ではＮＢＣＳ−ＤＦ培地の方が苫干短かったもの
の、Ｓ終到達密度ではほぼ同等のレベルに達した。この
結果を第１表に示す。

第１表基本合成培地　添加物　倍加時間　到達密度（ｈｒ）　
　　（ｃｅｌｌｓ／ｍｅ）Ｄ計　　　　　　　ＩＴＥＳ　　　　　　３１　　　　
４．０Ｘ１０’ＤＭＥ／Ｆ−１２３０２，４Ｘ　１０”
（ＤＦ）　　　　　　　ＩＴＥＳ　　　　　３０　　　
　２．５Ｘ１０″ＮＢＣ３２５２，８Ｘ１０’ 次に、ＮＢＣＳ−ＤＦ墳地および５Ｆ−ＤＦ培地で各々
Ａｋａｂａｎｅ　ｖｉｒｕｓ　０ＲＥ−１を培養し、ウ
ィルスの増殖の度合いをプラーク数で測定したところ、
培養２日目まではＮＢＣＳ−ＤＦ培地での培養の方が優
れていたが、培４１３日目以降は５Ｆ−ＤＦ培地での培
養の方が上回った。この結果を第１図に示す。これは、
ＮＢＣＳ−ＤＦ培地ではウィルス活性が培養日数ととも
に失活するのに対し、５Ｆ−ＤＦ培地ではそのようなこ
とがないことによる。

以上の結果より、ウィルスの生産には５Ｆ−ＤＦ培地が
優れていることが明らかとなった。

実施例１（モノクローナル抗体の製造）ＳＦ−ＤＦ培地
（培地１戚中に、バクテリア増殖防止のためにペニシリ
ンＧカリウム１０万単位。

ストレプトマイシン硫酸塩０．１ｇ、１１街剤としてＨ
Ｅ　Ｐ　Ｅ　Ｓ　　１５　ｍＭ、　ｐＨ調節のためにＮ
ａＨＣＯ。

１４ｍを添加したもの）中でＨｍ　Ｌ　ｕ　−１細胞を
Ｉ　Ｘ　１０　’　ｃｅｌｌｓ／−の割合でφ９０ｍの
プラスチックシャーレにまきこみ、加湿した５％ＣＯ□
−９５％空気を通気した炭酸ガス恒温器中で２日間培養
した。培地を除去後、ＰＢＳに懸濁したウシの病原ウィ
ルスであるＡｋａｂａｎｅ　ｖｉｒｕｓ　ＯＢε−１株
、ＢＥＦ　　ＹＨＬ株およびＩｂａｒａｋｊ　ｖｉｒｕ
ｓ　Ｎ（１２株を接種し、３７゛Ｃで９０分間保持した
。細胞に吸着していないウィルスをＰＢＳで洗浄後、５
Ｆ−ＤＦ培地を添加し３７°Ｃの炭酸ガス恒温器中で培
養を継続した。経口的に培養液を回収し、培地中の活性
ウィルス粒子を以下に述べるプラーク法によって測定し
た。φ３５ｍシャーレにＨｍＬｕ１細胞をＩ　Ｘ　１０
　’　ｃｅｌｌｓ／−でまきこみ、２日間培養し、次に
５Ｆ−ＤＦ培地で希釈したウィルス液０．５ｄを培地を
除去したシャーレに接種して９０分間恒温器中に放置し
、ウィルスを吸着させた。ウィルス液を除去した後に、
後述する寒天添加維持培地を２−加え、寒天が固まって
から３Ｔ１°Ｃの炭酸ガス恒温器中で２日間培養した０
次に、後述する中性赤添加維持培地をｌｄ重層し、１日
後プラーク数を数えた。なお、寒天添加維持培地はアガ
ロース（ＭＥ、　　シーケム社）の１％溶液と２倍濃度
の５Ｆ−ＤＦ培地を４０°Ｃで保温し、使用直前に等量
ずつ混合し、中性赤添加維持培地は０．２５％ニュート
ラルレッド（和光純薬）、１％アガロース溶液および５
倍濃度５Ｆ−ＤＦを４０°Ｃで保温し、使用直前に３：
５：２の割合で混合した。

このようにして得られたウィルスの部分精製を次の（１
）１３０％硫安分画、（２）ゲルろ過（ＴＳＫＧＥＬ　
　）（Ｗ−５０）、（３）陰イオン交換クロマトグラフ
４−（ＭＯｎｏ　Ｑ）、　（４）真空凍結乾燥、（５）
ゲルろ過（ＴＳＫ−ＧＥＬ　Ｇ３０００ＳＷ）の５ステ
ツプで行った。ウィルス画分の溶出位置はＨｍＬｕ−１
細胞に対する感染活性を観察することで決定した。最初
に、ウィルスを濃縮する目的で８０％硫安分画を氷冷し
ながら４時間行った。

硫安沈澱物は１０　ｍＭ　　Ｎａ−ｐｈｏｓｐｔ＋ａｔ
ｅ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７，３）に溶解してケ°ルろ過
を行い、シｏｉｄシｏｌｕｍｅ両分を回収した。この繰
作によって宿主細胞および培地由来の低分子画分と硫安
を除いた。続いて、ゲルろ過はＴＳＫ−ＧＥＬ　　ＨＷ
−５０（東ソー）カラムをＦＰＩ、Ｃ（Ｆａｓｔ　ｐｒ
ｏｔｅｉｎ　１ｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｓ＋ａｔｏｇｒａ
ｐｈｙ）ｓｙｓｔｅｍに接続して行った。次に、陰イオ
ン交換クロマトグラフィーをＭＯｎｏ口（ファルマシア
）カラムを用いて行った。５ｔａｒｔ　ｂｕｆｆｅｒは
ゲルろ過のｅｌｕｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒと同じ１０　
ｍ　Ｍ　　Ｎａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕ４ｆｅｒを用
い、これにＬＭ　　ＮａＣ１を含むｂｕｆｆｅｒでリニ
アグラジェントをかけて溶出させ、Ｎａ（１！６６０　
８１０ｍＭの溶出画分を回収した。さらに凍結乾燥とゲ
ルろ過を組み合わせて脱塩と濃縮を行った。ゲルろ過は
ＨＰ　Ｌ　ＣｓｙｓｔｅｍにＴＳＫ−ＧＥＬ　　Ｇ３０
００ＳＷ（東ソー）カラムを１妾続して行った。　ｅｌ
ｕｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒは１０ｍＭＮａｐｈｏｓｐｈ
ａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ　ｐＨ７，３を用い、ｖｏ　ｉｄ
画分をウィルス部分精製品とした。

続いて、Ａｋａｂａｎｅ　ｖｉｒｕｓ　ＯＢ　Ｅ　−１
およびＢＥＦＹ　ＨＬについてはウィルス培養液を免疫
原として用い、Ｉｂａｒａｋｉ　ｖｉｒｕｓ　Ｎａ２に
ついては部分精製ウィルスを免疫原として用い、Ｐ３Ｘ
６３Ａｇ８Ｕ１細胞Ｙｅｌｔｏｎ、　Ｄ、Ｅ、　　ら；
　Ｃｕｒｒ、　Ｔｏｐ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

Ｉｍ＋ｎｕｎｏ１．、８１．　Ｈ１９７９）を親細胞と
して、ＰＥＧ法Ｇａ１ｆｒｅ、　Ｇ、ら；　Ｍｅｔｈｏ
ｄｓεｎｚｙｔａｏ１．７３．３（１９８１）によりハ
イブリドーマの作製を行った。

ｉ７られたハイプリドーマを常法により選択培養し、抗
体産生細胞を検出した０次いで、抗体産生細胞のクロー
ニングを行ったのち、該細胞をＰＢＳで洗浄した。この
細胞をＩＴＥＳ−ＤＦに浮遊させ、２日間培養した。遠
心分離によって得た上清について以下のようにして抗体
の検出を行った。

Ａｋａｂａｎｅ　ｖｉｒｕｓ　ＯＢ　Ｅ　−１について
は、１次スクリーニングは０ＢＥ−１１’Ｓ染ＨｍＬｕ
−１細胞と非感染ＨｍＬｕ−１細胞を抗原としてＥＬＩ
ＳＡ法により行い、２次スクリーニングは蛍光抗体法で
行った。Ｉｂａｒａｋｉ　ｖｉｒｕｓ　ｋ　２とＢ　Ｅ
　Ｆ　　Ｙ　ＨＬについては、部分精製ウィルスを抗原
としてＥＬＪＳＡ法により行った。

このようにして、アカバネウィルス、牛流行熱ウィルス
およびイバラキウィルスに特異的に反応する４Ｆ−１２
，８Ｂ−９，８Ｂ−１０，８Ｂ−１１、ＩＡ−４，２Ａ
−２，５Ｇ−７，Ｙ−ＩＥ６〜８．Ｙ−ＩＡ９−１１．
Ｙ−ＩＡ９−１９゜１−ＩＡＩ、ｌ−ＩＦ５などのモノ
クローナル抗体が得られた。

実施例２（モノクローナル抗体の特異性の検定）実施例
１で得られたモノクローナル抗体４Ｆ−１２について、
宿主細胞である未感染Ｈｍ’　Ｉ、ｕ−１細胞をＰＢＳ
に懸濁し、超音波処理で破砕した後、１５００ｘｇで遠
心して得られた上清（ＨｍＬｕ−１細胞の破砕１）、Ｈ
ｍＬｕ−１細胞にアカバネウィルスを感染させ２日培養
後、１５００ｘｇで遠心して得られたウィルスを含む培
養上清（アカバネウィルス培養液）およびウィルスを含
む培養上清の８０％硫安沈澱物のゲルろ過（Ｉ（Ｗ　　
５０）Ｖｏｉｄ画分を陰イオン交換クロマトグラフィー
（Ｍｏｎｏ　Ｑ。

ファルマシア）にかけ、ＮａＣ１６６０−８１０ｍＭの
溶出画分（部分精製ウィルス）の各々に対する反応性を
調べた。この結果を第２表に示す。

第２表試料　　　　　０．０゜Ｊ（ｍＬｕ−１細胞の破砕液　　　０．０６１アカバネ
ウイルス培養液　　　　０．０７９部分精製ウィルス　
　　　　　　０．５９４表から明らかなように、ウィル
スの精製度が高くなるにつれ、モノクローナル抗体４Ｆ
−１２の反応性が上がった。このことは、モノクローナ
ル抗体４Ｆ−１２がウィルスと反応する抗体であること
を強く示唆している。

次に、モノクローナル抗体４Ｆ−１２について、Ａｋａ
ｂａｎｅ　ｖｊｒｕｓ　ＯＢ　Ｅ　−１を５ＤＳ−ＰＡ
ＧＥにかけた後、ウェスタン−プロッティング法により
特異性の検定を行った。この結果を第２図に示す。

第２図から明らかなように、モノクローナル抗体４Ｆ−
１２はＡｋａｂａｎｅ　ｖｉｒｕｓ　ＯＢ　Ｅ　−１由
来の分子量約３０にの物質に特異的に反応する。また、
他の抗体８Ｂ−９，８Ｂ−１０，８Ｂ−１１，ＩＡ４．
２Ａ−２，５Ｇ−７についても同様の結果が得られた。

このことより八ｋａｂａｎｅ　ｖｉｒｕｓ　ＯＢ　Ｅ−
１を免疫原として得られた７種のモノクローナル抗体は
同一のウィルス構成成分を認識していることが示唆され
た。

実施例３（モノクローナル抗体の交叉反応の検定）実施
例１で得られたモノク１′Ｊ−ナル抗体Ｙ−ＩＥ６８、
Ｙ−ＩＡ９−１１．Ｙ−ＩＡ９−１９．ｌ−ｌＡｌ、ｌ
−ＩＦ５．４Ｆ−１２，ＬＡ−４の７つについて、交叉
反応性を牛に対する病原ウィルスであるＩｂａｒａｋｉ
　ｖｉｒｕｓ　ｋ　２株、ＢＥＦ　　ＹＨＬ株、　Ａｋ
ａｂａｎｅ　ｖｉｒｕｓ　ＯＢ　Ｅ　−１株、　Ｃｈｕ
ｚａｎ　ｖｉｒｕｓＫ−４７株の４種類を抗原としてＥ
ＬＩＳＡ法により試験した。なお、Ｙ−ＩＥ６−８．￥
−ＩＡ９−１１．Ｙ−ＩＡ９−１９はＢＥＦ　　ＹＨＬ
を免疫原とし、ｌ−ｌＡｌ、ｌ−ＩＦ５はＩｂａｒａｋ
ｉ　ｖｊｒｕｓＮα２を免疫原とし、また４Ｆ−１２と
ＩＡ−４はＡｋａｂａｎｅ　ｖｉｒｕｓ　ＯＢ　Ｅ　−
１を免疫原として得られたモノクローナル抗体である。

この結果を第３表に示す。

／／／／／表より明らかなように、４Ｆ−１２とＩＡ−４は免疫原
であるアカバネウィルスとのみ反応し、他のウィルス株
との交叉反応はなかった。［−１ＡＩおよびｌ−ＩＦ５
も免疫原であるイバラキウィルスとのみ弱くではあるが
特異的に反応した。Ｙ−１Ｅ６−８は免疫原である牛流
行熱ウィルスとのみ特異的にしかも強く反応した。また
、Ｙ−ＩＡ９１１およびＹ−ＩＡ９−１９は複数の抗原
と反応した。この様に各モノクローナル抗体は、その各
ウィルスに対する反応性の違いから、各々異なる抗原決
定基を認識していることが明かとなった。

また、中白ウィルスにはいずれのモノクローナル抗体も
反応しなかったことから、これらのモノクローナル抗体
がアカバネウィルス、牛流行熱ウィルスおよびイバラキ
ウィルスに特異的に反応することがわかった。

実施例４（モノクローナル抗体のウィルスに対する親和
性の評価）Ｂ　Ｅ　Ｆ　　Ｙ　ＨＬを抗原とし、実施例１で得られ
たモノクローナル抗体Ｙ−ＩＥ６−８．Ｙ−ＩＡ９−１
９．Ｙ−ＩＡ９−１１のウィルスに対する親和性を調べ
た。この結果を第３図に示す。

第３図より明らかなように、これら３つの抗体は同じウ
ィルス構成成分を認識してはいるが、Ｙ−ＩＥ６−８は
Ｙ−ＩＡ９−１９およびＹ−ＩＡ９−１１よりもＢＥＦ
　　ＹＨＬに対して強い親和性を示した。また、実施例
３の結果からもＹ−ＩＥ６−８は他の２つの抗体とは異
なっており、Ｙ−ＩＥ６−８が認識している抗原決定基
はＢＥＦ　　ＹＨＬに固有のものであることが示唆され
た。

つぎに、Ａｋａｂａｎｅ　ｖｉｒｕｓ　ＯＢ　Ｅ　　ｌ
を抗原とし、実施例１で得られたモノクローナル抗体Ｉ
Ａ−４および４Ｆ−１２のウィルスに対する親和性を上
記と同様にして調べた。この結果を第４図に示す。

この２つのモノクローナル抗体は、実施例２において同
じウィルスの構成成分を認識していることが示唆されて
いるが、第４図から明らかなように、抗原に対して全く
異なる親和性を有していることがわかった。また、モノ
クローナル抗体ＩＡ−４はＡｋａｂａｎｅ　ｖｉｒｕｓ
　ＯＢ　Ｅ　−１抗原に対して強い親和性を有している
ので、抗体濃度が低い場合でもウィルス抗原と特異的に
、しかも強く反応することが可能であることを示唆して
いる。

実施例１〜４の結果から、モノクローナル抗体１−ＩＡ
Ｌおよびｌ−ＩＦ５がＩｂａｒａｋｉ　ｖｉｒｕｓ　Ｎ
（Ｌ２と、モノクローナル抗体Ｙ−ＩＥ６−８がＢ　Ｅ
、　ＦＹＨＬと、モノクローナル抗体４Ｆ−１２および
ＩＡ−４がＡｋａｂａｎｅ　ｖｉｒｕｓ　ＯＢ　Ｅ　−
１に対して選択的に反応することが明らかとなった。ま
た、モノクローナル抗体Ｙ−ＩＡ９−１１およびＹ−１
Ａ９−１９は異なる２種以上のウィルス株とも反応する
ものであった。なお、モノクローナル抗体Ｙ−ＩＡ９−
１１についてはＢＥＦ　　ＹＨＬおよびＡｋａｂａｎｅ
　ｖｉｒｕｓ　ＯＢ　Ｅ　　１に反応したが、Ｉｂａｒ
ａｋｉ　ｖｉｒｕｓ　ｋ２およびＣｈｕｚａｎ　ｖｉｒ
ｕｓ　　Ｋ　−４７には反応しないことから、この抗体
はＢＥＦ　　ＹＨＬとＡｋａｂａｎｅ　ｖｉｒｕｓ　Ｏ
Ｂ　Ｅ　−１に共通した抗原に反応している可能性があ
る。また、モノクローナル抗体Ｙ−ＩＡ９−１９はＢ　
Ｅ　Ｆ　　Ｙ　ＨＬ、　Ｉｂａｒａｋｉｖｉｒｕｓｋ２
およびＡｋａｂａｎｅ　ｖｉｒｕｓ　ＯＢ　Ｂ　−１の
３種に共通する抗原と反応している可能性がある。

さらにＡｋａｂａｎｅ　ｖｉｒｕｓＯＢ　Ｅ　−１に対
するモノクローナル抗体ＬＡ−４とＢ　Ｅ　Ｆ　　Ｙ　
ＨＩ、に対するモノクローナル抗体Ｙ−ＩＥ６−８は免
疫原に対し特異的に、しかも強く反応することにより診
断薬として利用できる可能性が示唆された。

〔発明の効果〕

本発明によれば、ウシのウィルス性伝染病であるアカバ
ネ病、牛流行熱およびイバラキ病の病原ウィルスと特異
的に反応するモノクローナル抗体を得ることができる。

得られたモノクローナル抗体は、その特異性を活かして
、伝染病の診断薬としての利用が期待できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、参考例における＾ｋａｂａｎｅ　ｖｉｒｕｓ
　ＯＢ　Ｅ−１の増殖の度合いを示すものである。第２
図は、実施例２におけるモノクローナル抗体４Ｆ−１２
のＡｋａｂａｎｅ　ｖｉｒｕｓ　ＯＢ　Ｅ　−１に対す
る特異性をウェスタン−ブロッティング法で検定した結
果である。第３図は実施例４におけるＢＥＦ　　ＹＨＬ
を抗原とした場合のモノクローナル抗体の親和性を示し
たものである。第４図は、実施例４におけるＡｋａｂａ
ｎｅ　ｖｉｒｕｓ　ＯＢ　Ｅ　−１を抗原とした場合の
モノクローナル抗体の親和性を示したものである。Ｏ第図培養日数（日）第図抗体濃度（ｕｇ／ｍｌ）第図Ａ−Ａｋａｂａｎｅ　ｖｌｒｕｓ　０８Ｅ−１感染細胞
の培養上清２０倍濃縮液Ｂ：非感染細胞の培養上清２０
倍濃縮液１：モノクローナル抗体４Ｆ−１２２二市販マウス１（ＩＧ第図抗体濃度（ｕｇ／ｒｎｔ）

Claims

【特許請求の範囲】１）ウシの伝染性病原ウィルス弱毒株を免疫原として得
られた感作Ｂリンパ球をハイブリドーマとして選別し、
これを培養してウシの伝染性病原ウィルスと特異的に反
応するモノクローナル抗体を産生させ、該抗体を回収す
ることを特徴とするウシの伝染性病原ウィルスと特異的
に反応するモノクローナル抗体の製造方法。２）ウシの伝染性病原ウィルス弱毒株が、無血清培地で
培養したハムスター胎児由来のＨｍＬｕ−１細胞を用い
て増殖させたものである請求項１記載の製造方法。３）ウシの伝染性病原ウィルスがアカバネウィルス、牛
流行熱ウィルスおよびイバラキウィルスのいずれかであ
る請求項１記載の製造方法。