JPH0283390A - ｐ−ニトロフェニル セロオリゴ糖誘導体及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、セルラーゼの活性測定用基質として、またそ
の作用機構の解析に有用なＩ〕−二トロフェニル　セロ
オリゴ糖誘導体に関するものである。

〔従来の技術〕

セルラーゼは、植物や微生物などに広く存在しているセ
ルロース分解酵素である。

近年、エネルギー問題や未利用資源の有効利用などの観
点から、セルロースを糖化しグルコ−人から１タノール
に変換しようとする研究が盛んに行われており、セルラ
ーゼは、このような研究に重要な役割を果たしでいる。

また、最近ではセルラーゼを配合した洗剤が開発され、
産業用酵素としてもその利用分野が拡大しつつある酵素
である。

従来からセルラーゼの活性測定は、セルロースやセルロ
ース誘導体で・あるカルボキシメチルセルロースなどを
用いて、濁度法、粘度法や遠几糖を測定する方法などに
よっておこなわれている。また、セルラーゼの作用機構
などの解析にはセルロースの部分加水分解物であるセロ
オリゴ糖などが用いられている。

〔発明か′解決しようとする課題〕

然しながら、従来のセルラーゼ活性測定法は、操作が煩
雑で基質となるセルロースやセルロース誘導体の（ｉη
造が明確でないことから、その測定値にバラツキを生じ
やすいといった欠点があった。また、セルラーゼの作用
８！横の解析に、セロオリゴ糖を用いた場合には、その
分解物の解析が複雑になるなどの欠点がある。このよう
なことから、セロビオースの１ビニトロフエニルβクル
コシ）（ｐ−ニトロフェニル　β−セロビオシド）を合
成し、これを用いてセルラーゼの作用機構の解析がなさ
れている。しかし、この合成基質だけでは、セルラーゼ
の作用機構についての光分な解析結果を得ることができ
なかった。また、従来のｐ−ニトロフェニル　β−セロ
ビオシドの合成法は、セルロースを部分加水分解してイ
（トられるセロビオースを無水酢酸と反応させてベルア
セチル誘導体とするか、セルロースをアセトリシス（加
酸分解）して得られるセロビオースのベルアセチル誘導
体をハロゲン化水素と反応させてベルアセチルセロビオ
シルハライドとし、これとｌビニトロフェノールとを反
応させｐ−ニトロフェニルベルアセチル−β−セロビオ
シトヲ４：）　、さらにこれを脱アセチル化して目的物
であルｐ−二トロフェニル　β−セロビオシドを得ると
いった操作を経ている。しかし、この方法では、合成中
間体であるベルアセチルセロビオシルハライドが湿気に
対して不安定であるため取扱いに光分な注意を要するこ
とやこの中間体を経るため合成が多段階になるなど操作
が非常に煩雑になるといった欠点がある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明考らは、上述のような状況に鑑み、セロオリゴ糖
の１】−二トロフェニル誘導体について説′Ｘ５．研究
を屯ねた結果、セルラーゼの活性測定ＩｔＪ　）、Ｉ、
質やその作用！９１構の解析に有用なｐ−ニトロフェニ
ル　β−セロオリゴシドの１７！ｌｉ便な合成法を見出
し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、３種類の新規合成化合物１）−二トロ
フェニル　β−セロトリオシト、ｐ−ニトロフェニル　
β−セロテトラオシド及びｐ−ニトロ７エ二ル　β−セ
ロペンタオシドとｐ−二トロフェニルβ−セロオリゴシ
ド　の新しい合成法を提供するものである。

〔発明の構成〕

本発明）こおけるセロオリゴ糖のｐ−ニトロフェニル誘
導体は、下記の一般式（１）。

で示される新規物質であって、Ｆ記の各式（２，３，４
）′ｃ表される１ビニトロフエニル　β−セロオリゴシ
ドである。

式（２） で示される　（−形式（１）でｎ−１のもの）１ビニト
ロフエニル　β−セロ）リオンドで、以下の物理化′４
°的性質を示す。

分（式：　Ｃ：、）Ｉ　７．Ｏ、、Ｎ　−Ｉ＋　２０分
子畝　：　６４：Ｌ５５　（理論値）融　点　：２２４
〜２２６℃（分Ｍ） 溶解性：水、２ツタノール水溶液、エタノール水溶液に
可溶、アセトン、クロ ロホル！１、ヘキサンなどには不溶１゜比旋光度：〔α
］２ｏ’−７０，８°（０，５３％、水）紫外吸収スペ
クトル：λ惑３００．Ｏｎ＋ｎ式（：（） ％式％（） 溶解性：水、メタノール水溶液、エタノール水）δ液に
可溶、アセトン、クロ ロホルム、ヘキサンなどには不溶。

比旋光度：〔α〕２♂−５１，０°（０，５２％、水）
紫外吸収スペクトル：λ帰醒ｒＩＯｏ、　６ｎ＋ｎ式（
４） で示される　（−形式（１）でｎ＝２のらの）ｐ−二ト
ロフェニル　β−セロテトラオシドで、以下の物理化学
的性質を示す。

分子式：　Ｃ）０１−１１５０　＝ｘｌ’Ｊ　−Ｌ’２
Ｈ：。

で示される　（−形式（１）でｒ＋”３のもの）１）−
二トロフェニル　β−セロペンタオシドで、以下の物理
化学的性質を示す。

分子式：　ＣｙｂＩ−Ｔ　５，０２１１Ｎ・トＩ２０分
子量：　９６７．８３　（理論値） 融　点＝２７１〜２７２”Ｃ（分解） Ｌ８解性：水、メタ／−ル水溶液、エタノール水溶液に
可溶、アセトン、クロ ロホルム、ヘキサンなどには不溶。

比旋光度：（（Ｉ　］　”、’−４２，０”　（０，５
０％、水）紫外吸収スペクトル：λ損ｆｆ　３ｏｔ　−
Ｏｎｍ次）こ、Ｆ記の一般式（５）で示されるｐ−ニト
ロフェニル　β−セロオリゴシドの製ａ　方法について
説明する。

式（５） 本発明に係るｐ−ニトロフェニル　β−セロオリゴシド
は、セルロースをｆｆｌｓ分加水分解して１１）たセロ
オリゴ糖であるセロビオース、セロトリオース、セロテ
トラオース、及ブセロペンタオーベルアセチル誘導体と
したのち、この透導体と１）−二トロフェ７−ルとを反
応させ、ｐ−二トロ７工二ル　ベルアセチル　β−セロ
オリコ゛シトｆ：得１、−れを脱−アセチル化すること
により製造できる。

例えば、セル゛ロースを、発煙濃塩酸を用いて゛（ソγ
Ｗで１〜５時間部分加水分解し、分解物を活性炭カラム
に吸着させた後、水−エタ／−ル水溶液によるｊｊｉ：
＃ｉｔ儂度勾配法でオリゴ糖を溶出し、セロビオースか
らセロペンタオースまでのセロオリゴ糖を得る。次各こ
、これらのセロオリゴ糖を無水酢酸ソーダを含む無水酢
酸中に加え、反応温度９０〜１４０°Ｃで２０〜１２０
分間攪拌し、ベルアセチル化反応を行う。この反応液を
氷水中に注ぎ込み、室温で１〜４時間攪拌する。析出し
た結晶を濾過により婁ぬるか、あるいはクロロホルム溶
液で抽出後、結晶化させ下記−形式（６）のベルアセチ
ルセロオリゴ糖誘導体をＩＢる。

式（６） 又を出発材料とし、これを無水酢酸と反応させ次に、上
記−形式（６）のベルアセチルセロオリゴ糖誘導体とｐ
−ニトロフェ／−ルとの混合物を１威圧下１７０〜２０
０℃で１０〜１８０分間加熱溶融し反応させる。反応後
、メタノールから結晶化し、さらに二の粗結晶をエタ／
−ル、エタノール水；δ液やメタ７−ルークロロホルム
などから再結晶化して、下記−形式（７）のｌ）−二ト
ロフェニルベルアセチルーβ−セロオリゴシドを得る。

式（７） 続いて、−形式（７）で示されろ化合物をメタ／−ル中
ナトリウムメトキシドの存在下に室温で３０〜１８０分
間処理することに上り脱アセチル化し、本発明の上記−
形式（５）で示されるｐ−二トロフェニル　β−セロオ
リゴシドをイ：）ることができる。

〔発明の効果〕

本発明によれば、セルラーゼの活性測定やその作用機構
の解析に准用なｐ−ニトロフェニルβ−セロオリゴシド
を提供することができる。

〔実施例〕

以下に実施例を示して本発明を更に置体的に説明するが
、係る説明によって本発明が何ら限定されるものでない
ことは勿論である。

（実施例１） セルロース６００ｇをＯ″Ｃで発煙；・農塩酸８ｕにｉ
１’；ＭＬ、この溶液を室温で２時間攪拌した。

この部分加水分解液に水１２磨を加えた後、２５％町性
ソーダ溶液を用いてｐ＋＋を４〜５に調整した。不溶物
を吸引濾過して除去後、濾液の生４５ｔ　（２０１）を
活性炭−セライトカラム（＋（ＭＬ）に展開した。カラ
ムを十分量の水で洗浄し、す１．糖と塩を除去した。次
に、オリゴ糖を０〜５０％エタノール水溶液による直線
濃度勾配法を用いて溶出した。糖の検出は、シャール法
で還丸力を測定することにより行った。セロビオースか
らセロペンタオースまでの各画分を婁め減圧濃縮後、凍
結乾燥した７」二記の操作を２回繰り返すことによって
セロビオース１０．５ｇ、セａトリオース１８．０ｇ、
セロテトラオース１９．０ｇ、及びセロペンタオースｔ
ｓ、ｅｇを得た。

上記提作で得たセロトリオース＋０．０．を無水酢酸ソ
ーダ１５ｇを含む無水酢酸溶ｌ］４ｏｍｉ中に徐々に加
え、反応温度１３０−１４０°Ｃでセロトリオースが完
全に溶解するまで攪拌した。

、二の反応混合物を１．５ｆｌ　の氷水中に注ぎ込んだ
後、３時間室温でへしく攪拌した。析出した結晶を集め
真空乾燥して、セロトリオースヘンデカアセテ−）　１
６．４Ｈ（理論値の８５．６％）を得た。このセロトリ
オース　ヘンテ゛カアセテート５．　ｏｇとｐ−二トロ
フェノール９．０ｇを混合し、減圧下］ＳＯ・〜２００
°Ｃで６０分間加熱した。反応？ｆｉ：介物を冷却後、
これにメタノール］ＯＯ＋ｎＪｌｌを加え、−夜冷蔵庫
に放置した。析出した結晶を集め〆り／−ルで洗浄した
。この結晶をクロロホルム−メタ／−ル（１：　３　）
２５０＋ｎｉ　　に溶解し、活性炭を用いて悦色後、脱
色液を一夜冷Ｎ＆陣に放置しｊこ。析出した結晶を集め
真空乾燥して、１）−ニトロフェニル　テ゛カアセチル
ーβ−セロトリオシト２．Ｏｇ（理論値の３７％、１犠
点　：２２０〜２２２°Ｃ）を得た。

次に、ｐ−ニトロフェニル　デカアセチルβ−セロトリ
オシト２．０ｇ　を無水メタノール８０１１１１に懸濁
し、１．０Ｍナトリウム　メトキシド２１１Ωを加え室
温で２時間攪拌後、−夜冷蔵渾に放置した。析出した結
晶を集め、メタ／−ルで洗浄後、真空乾燥して、ｐ−二
トロフェニルβ−セロトリオシト１．０２ｇ（理論値の
ｓ６．６９．＜）を得た。この結晶は、活性炭を用いて
脱色し、エタノール−水から再結晶化しで精製した。

、二の物質は、高速液体クロマトグラフィーで単一ピー
クを示した。また、この物質の物理化′７的性質は、次
の通りであった。

分子式：　ＣｘＨａ５０１８Ｎ　’　Ｈ２０分子猜：　
６４３．５５　（理論値） 融　点：２２４〜２２６°Ｃ（分解） 溶解性：水、メタ／−ル水溶液、エタノール水溶液に可
溶、アセトン、 クロロホルム、ヘキサンなどに は不溶。

比旋光度：〔α〕２♂−７０．８°（０，５３％、水） 紫外吸収スペクトル　、＾、、ｘ３００．Ｏｎ＋ｎ（実
施例２） 実施例１で得たセロテトラオース５．Ｏｇを無水酢酸ソ
ーダ５．０ｇを含む無水酢酸溶液１００＋ｎ　Ｑ中に徐
々に加え、この混合物を攪拌しながら２時間冷却管を附
して加熱還流した。反応混合物を　氷水］、ＯＪｌ中に
注ぎ込み、室温で１時間攪拌した。次に、この混合物か
らクロロホルム（１００＋ｎ　Ａ　Ｘ　３　＞で反応生
成物を抽出した。

抽出液を脱水し溶媒を除去した後、生成物をエタ／−ル
から結晶化してセロテトラオーステトラデカアセテ−）
８．１０ｇ（理論値の８６．１％、融点２２１〜２２４
°Ｃ）を得た。

このセロテトラオース　テトラデカアセテ−）　５．Ｏ
ｇとｐ−ニトロフェノール９．０ｇを混合し、減圧下１
８０〜２００’Ｃで６０分間加熱した。反応混合物を冷
却後、メタノール１００＋ｎＱを加え、夜冷蔵庫に放置
した。析出した結晶を婁め、メタノールで洗浄後、この
粗結晶を９５％エタノール水溶液２００ｍ　５１に加温
して溶かし、活性炭を用いて脱色後、脱色液を一夜冷蔵
庫に放置した。析出した結晶を集め真空乾燥して、］ド
ニトロフェニル　トリデカアセチル−β−セロテトラオ
シド２．Ｏｇ（理論値の３５．７％、融点２１２〜２１
，４°Ｃ）を得た。

この結晶をを無水メタノール４０＋ｎＪｌｌ　　１ｍ懸
濁し、１　、０　Ｍナトリウム　、／トキシド１．０＋
ｎ没を加几室温で３時間攪拌後、−夜冷蔵庫に放置した
。析出しｒこ結晶を婁め、メタ／−ルで洗浄後、真空乾
燥して、ｐ−ニトロフェニルβ−セロテトラオシド１．
ｌ１ｇ（Ｑ論値の９９％）を得た。

二の結晶は、活性炭で脱色後、エタノール水から両結晶
化してさらに精製した。この物゛ａは、高速液体クロマ
トグラフィーにおいて１ｉｔ−−ビークを示した。また
、この物質の物理化学的性質は、次の通りであった。

分−４式：　Ｃ３，Ｈ、，０２，Ｎ　−１／２Ｈ２０分
子徹：　７９６，６８　（理論値） 融　点：２５２〜２５４°Ｃ（分解） 溶解性：水、メタノール水溶液、エタノール水溶液に可
溶、アセトン、 クロロホルム、ヘキサンなどに は不溶。

比旋光度：〔α）２ｏ’−５１，０’　（０，５２％、
水） 紫外吸収スペクトル：λ：３００．６ｎ＋ｎ（実施例３
） 実施例１で得ｒこセロペンタオース５．Ｏｇを、実施例
２と同様にしてベルアセチル化し、セロペンタオース　
へブタデカアセテート８．９３ｇ（理論値の９６％、融
点２３４〜２３６°Ｃ）を得た。

、二のセロペンタオース　へブタデカアセテ−）　５．
Ｏｇと１）−二トロ７工／−ル９　、０ｇ／；：実施例
２と同様な条件で反応させて得られた粗結晶を７０％エ
タノール水溶液２００＋ｎＪ１に加温して溶解後、活性
炭を用いて脱色しｒこ。この脱色液を一夜冷蔵庫に放置
し析出した結晶を集め、真空ケ乞燥して、１）−二トロ
フェニル　ヘキサデカアセチル−β−セロペンタオシド
２．７５ｇ　（理論値の５２．３％、融点２２９〜２３
０”Ｃ）を得た。

この結晶をを無水メタ／−ル１００ｍ　、ＣＬに懸濁し
、Ｉｊ１Ｍナトリウム　メトキシド４０１立を加え室温
で：１時間攪４’ｔ’　した。この反応混合物を一夜冷
蔵庫に放置し、析出した結晶を集め、メタ／−ルで洗浄
後、真空乾燥して、ｐ−ニトロフェニルβ−セロペンタ
オシド’　−’　ｇ　（１’ｌ！　論＆Ｉの９９％）を
１（１ｊこ。この結晶は、活性炭を用いて脱色後、エタ
／−ルー水から再結晶化しさらに精製した。この物質は
、高速液体クロマトグラフィーでｊ…−ビークを示した
。また、この物Ｖｔの物理化学的性質は、次の通りであ
った。

分子式：　Ｃ３６Ｈｑ、Ｏ：ａＮ　−１（２（−１分子
猜：　９６７．８３　（理論値） 融　　点　：　２７１〜２７２℃（分Ｍ）／８角イ性：
水、メタノール水溶液、メタノール水溶液に町）Ｈ、ア
セトン、 クロロホルム、ヘキサンなどに は不溶。

比旋光度：〔α）’、’−４２．０°（０，５０％、水
） 出 願 ム 焼津水産化字エヱ株式会社

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表されるｐ−ニトロフェニルβ−セロオリゴシドのう
   ち、ｎ＝１で示されるｐ−ニトロフェニルβ−セロトリ
   オシド、ｎ＝２で示されるｐ−ニトロフェニルβ−セロ
   テトラオシド、及びｎ＝３で示されるｐ−ニトロフェニ
   ルβ−セロペンタオシド。
2. （２）下記の一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ｎ＝０、１、２、３
   （Ａｃは、アセチル基を示す。）で表されるセロオリゴ
   糖のペルアセチル誘導体とｐ−ニトロフェノールとの混
   合物を溶融法によって反応させ、ｐ−ニトロフェニル基
   をアグリコンとするペルアセチルセロオリゴシドを得、
   これを脱アセチル化することによりなるｐ−ニトロフェ
   ニルβ−セロオリゴシドの製造方法。