JPH0276586A - エラスターゼをコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はアルカリ性エラスターゼ活性を有するポリペプ
チドをコードする遺伝子、該遺伝子を含有するベクター
、及びこのベクターに６１、り形質転換された宿主を用
いる前記ポリペプチドの製造方法に関する。

〔従来の技術〕

エラスターゼは蛋白分解酵素、すなわちプロテアーゼの
一種で、通常のプロテアーゼでは分解しにくい蛋白質の
一つであるエラスチンをもよく分解する酵素である。エ
ラスチンはを椎動物の動脈、項靭体、真皮等に存在して
いる弾性繊維を構成する蛋白質で、その構造中にデスモ
シン、リジノノルロイシンなどの特殊な架橋構造を持ｊ
う、またアミノ酸組成も偏った硬蛋白質であるために、
通常のプロテアーゼによっては容易に分解することが出
来ない。

従来、通常のプロテアーゼに関する報告は多数みられる
がエラスターゼに関するものは少ない。

現在知られているエラスターゼには豚すい臓から得られ
るエラスターゼ（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　ｅｌａｓｔａ
ｓｅ）を始め、シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ７）　、ストレプトマイセス・グリセウ
ス（旦朋１叩五匹　釘ｙ鳩眩）およびフラボバクテリウ
ム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ、）等の微
生物が生産するエラスターゼが有る。しかし、これらは
いずれも至適ｐｌ＋が中性あるいは微アルカリ性にある
、いわゆる中性エラスターゼであり、アルカリ領域では
活性を示さないかあるいは活性が低い。例えば、豚すい
臓エラスターゼの至適ｐ＋は８．８である（酵素ハンド
ブック：丸尾他、朝倉書店、１９８６）。

アルカリ域で活性のあるエラスターゼ、すなわちアルカ
リ性エラスクーゼとして、本発明者等の一部が先に見出
だした好アルカリ性バチルスＹａ−Ｂ株のエラスターゼ
が知られているのみである。

これは、分子量約２５．０００の蛋白質で、４゛、適温
度６０℃、至適ｐｎ　１１．７５と極めて高い至適ｐｌ
＋をもつエラスターゼである（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　
ｅＬ　ＢｉｏｂｐｙｓｉｃａＡｃｔａ　８８３（１９８
６）４３９−４４７）。

しかし、本菌株のエラスターゼ生産量は微量であり、工
業生産に必要な大量培養の方法なども確立されていない
。そこで、本菌株からエラスターゼをコードする遺伝子
を取り出し、これをすでに大量培養技術が確立されてい
る宿主に導入することができれば、前記エラスターゼの
大量生産が可能になると考えられる。

しかしながら、その様な技術はまだ確立されていない。

〔発明が解決しようとする課題〕

従って、本発明は遺伝子組換え法を用いてアルカリ性エ
ラスターゼを工業的に製造することができる方法を提供
するものであり、そしてその前提として目的とするアル
カリ性エラスターゼ全体をコードするクローン化された
遺伝子、及び該遺伝子を含有するベクターを提供するも
のである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者等は好アルカリ性バチルスＹａ−Ｂ株（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　ｓｐ、Ｙａ−Ｂ）が生産するアルカリ性エ
ラスターゼの特異性に着目し、該エラスターゼを容易に
生産する方法を見出だすべく鋭意研究を進めた結果、該
エラスターゼをコードする遺伝子をクローニングし宿主
で発現させることに成功し、本発明を完成するに至った
。

従って、本発明は、アルカリ性エラスターゼ活性を有す
るポリペプチドをコートする遺伝子；該遺伝子を含むベ
クター；及び該ベクターにより形質転換された宿主を培
養し、この培養物からアルカリ性エラスターゼ活性を有
するポリペプチドを採取することをコードする、該ポリ
ペプチドの製造方法を提供しようとするものである。

〔具体的な説明〕

本発明の方法により生産されるアルカリ性エラスターゼ
活性を有するポリペプチドとして、例えば次の性質： （１）分子量：　２５，０００　（Ｓ　Ｄ　Ｓ−ポリ）
′クリルアミドゲル電気泳動Ｑこよる）： （２）等電点：　１０．６　； （３）至適反応温度：６０℃： （４）至適反応ｐＨ：　Ｌｌ、７５　　；及び（５）安
定ｐＨ範囲：５．０〜１０．００　　；を有し、バチル
ス属微生物に由来するアルカリ性エラスターゼ活性を有
するポリペプチドが挙げられる。上記の様なアルカリ性
エラスターゼ生産性バチルス属細菌の具体例としてバチ
ルスＹ　ａ−Ｂ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、Ｙａ−８）
が挙げられ、本発明の遺伝子はこの株から得ることがで
きる。ごの菌株は、工業技術院微生物工業技術研究所に
微］−研条寄第２０１７号（ＦＥＲＭ　ＵＰ−２０１７
）として寄託されている。

バチルスＹａ−Ｂ株からクローン化されたアルカリエラ
スターゼ酵素の遺伝子の塩基配列及びそれから推定され
るアルカリエラスターセのアミノ酸配列を第１−１図〜
第１−３図に示′□Ｊ−ｏＪ二列はクローン化された遺
伝子の全塩基配列であり、この内、１２３位のヌクレオ
チドから１２５６位のヌクレオチドにより３７８個のア
ミノ酸（下行）から成るポリペプチドがコードされてい
る。このアミノ酸配列のＮ−末端側には１位のＭｅｔか
ら２１位のＳｅｒまで又は２７位のＡｌａまでのシグナ
ル配列、及び２８位のへｌａから１１０位のＮｅｔまで
のプロ配列を含む。活性酵素は１１１位のＧｉｎから３
７８末のΔｒｇまでのアミノ酸配列を有する。

本発明においては、市＋ｉされているプラスミド、又は
その他の容易に人手することができるプラスミド、例え
ばｐ１１ｃ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２Ｂ、ｐＨＹ
３００ＰＬＫ等を使用するごとができる。

以下に、本発明の内容を段階を追って説明する。

ａ、１だ戸医乞馬二と／ｌ 最初に、バチルスＹａ−Ｂの染色体遺伝子にハイブリダ
イズさせ、遺伝子の選択に用いるプローブを作成する。

これには、まず、該エラスターゼのアミノ酸配列の一部
を構成する６個のアミノ酸配列Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ
−１１ｅ−Ａｓｎ−Ａｒｇを選ふ。この選定が重要であ
る。

このアミノ酸配列の選定方法は本発明の研究の初期段階
において、実施例に詳述するごとく、バチルスＹａ−Ｂ
を培養し、培養液から得た微量の該エラスターゼを精製
分離し、これを［ｉｄｍ、ｌＨの方法に従いベックマン
社製アミノの酸シークエンサーを用いて化学分析を繰り
返した結果得たＮ末端の５０個のアミノ酸配列の中から
最適な配列部分を選ぶ。

つぎに、この６個のアミノ酸配列にり・１応する１７塩
基からなる塩基配列を化学合成する。化学合成法は、例
えば、ホスホアミダイト法による合成法が用いられるが
、これに拘るものではない。

また、詳細手順は市販ＤＮＡ自動合成機（例えば、Ａｐ
ｐｌｉｅｄ　　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社　Ｍｏｄｅｌ　
　３８０八　ＤＮＡ５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）の取扱い
説明書によることができる。

アミノ酸配列に対応する塩基配列は、複数の遺伝暗号を
もつアミノ酸が存在するため一種類ではなく、下記のと
うり合計９６種類合成する必要があり、これらを混合し
てプローブとずろ。

ＣＣＡＴＧＧＧＧＡＡＴＡＡＡＣＣＧ このうち３位の塩基ＡはＧ、Ｃ又はＴと置換され、９位
の塩基ＡはＧ、Ｃ又は１゛と置換され、１２位の塩基Ａ
はＣ又はＴと置換され、１５位の塩基ＣばＴとそれぞれ
置換され、合計９６種類の組み合わせが得られる。

次に、プローブを用いて遺伝子のクローニングを行う。

バチルスＹａ−Ｂをニゲルコース２％、グリセロール２
％、カゼイン２％を含むｐＨ１０，０の培地で培養し、
培養後菌体を集め、菌体内のＤＮＡを取り出す。これら
の操作および後述のクローニングに伴う操作の詳細は、
底置、例えばｒＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＪ　
　（Ｍａｎｉａｔｉｓら著、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　
１ｌａｒｂｏｒ１、ａｂｏｒａ　Ｌｏｒｙ　１９８２ｆ
ｌ）記載の方法にしたがって行うことができる。

得られたＤＮＡを制限酵素１１ｉｎｄｌｌｌで切断する
。

ここで得られたＩ）　Ｎ　Ａ断片群を３Ｊ）で放射性ラ
ヘルした前記混合合成プローブを用いザザンハイプリダ
イセーション法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｌ＋ｙｂｒｉｄｉ
ｚａｔｉｏｎ法）によりハイブリダイズさせ、プローブ
とハイブリダイズするＤＮＡ断片（ｌｌｉｎｄ　Ｉｌｌ
　２．２　ｋｂ断片）を得る。これには、まず、ＤＮＡ
断片群をアガロース電気泳動で分画し、ゲルのままアル
カリ溶液（０，５Ｍ　ＮａＯＨ，１，５Ｍ　ＮａＣＩ）
に浸し、リル内でＤＮＡを変成させ一本鎖とする。ゲル
を中性にもどした後（０，５Ｍ　Ｔｒｉｓ−１１ｃＩ、
　３　Ｍ　ＮａＣｌ、ｐＨ７、０）ニトロセルロースフ
ィルターを密着し、高温）容液で毛細管現象を利用して
移動、ゲル内のｌ’）　Ｎ　Ａ分画区分を一本鎖のまま
フィルターに吸着保持させる。これを固定化後放射性ラ
ベルした＋”＋ｉｉ記混合合成プローブとハイブリダイ
ズさせる。余分のプローブを洗浄除去した後、オートラ
ジオグラフィーをとる。ポジティブシグナルを示すパン
Ｉ・の位置が遺伝子を構成するＤＮＡ断片の位置となる
。

このようにして得たＤＮＡ断片（ｌｌｉｎｄ　ＩＩＩ　
２．２　ｋｂ断片ンはしかし該エラスターゼ遺伝子の全
部ではない。Ｃ未約４分の１を欠いている。てこで、ク
ロモソームラオーキングによりこのＩＩ　ｉ　ｎｄ　Ｉ
ｌｌ　２．２　ｋｂ断片を新たなプローブとして用い、
次のととく遺転子の残部をコートするＤＮＡ断片を得る
。

バチルスＹａ−ＢのＤＮＡを制限酵素１１ａｐＨで切断
する。ここで得られたＩ）　Ｎ　Ａ断片群を３２ｐ放射
性ラヘルした前記１１ｉｎｄ　ＩＩＩ　２．２　ｋｂ断
片をプローブに用い、−１−記同様すザンハイブリダイ
ゼーション法によりハイブリダ・イズさせ、プローブと
ハイブリダイズするＤＮＡ断片（Ｈａｐ　ＩＩ　２．５
　ｋｂ断片）を得る。かくして得られたＨａｐ　ＩＩ　
２．５　ｋｂ断片中に遺伝子の残部をコードするｌ’）
　Ｎ　Ａが含まれる。

ｂ、−γプメ尉上ｑ様策 ベクターとしてプラスミドｐＵｃ１Ｂを用いる。図２に
示ずごと＜　、ｐＨｃ１Ｂを制限酵素１１ｉｎｄｌｌｌ
で切断し、前記１１ｉｎｄ　ＩＩＩ　２．２　ｋｂ断片
と合わせ、リガーゼ処理して組換えプラスミドｐＥｒ１
１１　とし、カルシウム法により大腸菌（Ｅ、　　ｃｏ
ｌｉ）ＭＣ１０６１株に導入し、目的の旧ｎｄｌｎ２．
２ｋｂ断片を持つクローンを、前記３２ｐ放射性ラヘル
した合成プローブを用い、コロニー・ハイブリダイモー
ション法によって選択する。

同様にして、プラスミドｐＵｃ］８の八Ｃ（，１ｓｉｔ
ｅに（］　Ｉｌｌ） 前記１１ａｐ　１１２．５断片を結合して組換えブ）ス
ミトｐＥＤ１０２とし、大腸菌（ｈ　竺旦）ＭＣ１０６
１に導入し、前記旧ｎｄｌｌ１２．２ｋｂ断片をプロー
ブとのコ目ニー・ハイブリダイゼーションにより、Ｈａ
ｐ　ＩＴ　２．５断片のクローンを得る。

これらの操作も、前述の、例えばｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇｊ　　（Ｍａｎｉａｔｉｓら著、Ｃｏ１
ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ　１９８２刊）記載の方法にしたかって行うことがで
きる。

これらｐＥＤＬｌおよびｐＥＤＩＱ２をそれぞれアルカ
リＳＤＳ法により宿主株より分離し、これらを第３図に
示すごとくそれぞれを制限酵素Ｂａｍ１ｌ　ｌとＨｉｎ
ｄ　ｍおよびＢｇｌ　Ｕと旧ｎｄｌｌｌで切断後再連結
し、遺伝子全体を含む組換えプラスミド’　ｒｐＥｌ］
ｌ０３Ｊを構築し、大腸菌（ＩＴ　並旦）ＭＣ１０６１
に導入しクローンを得る。

かくして得た遺伝子の塩基配列をダイ）−オキシ法によ
り求めた結果は第１−１図〜第１３図のとうりであり、
この塩基配列から得られろアミノ酸配列は同じく第１−
１図〜第１−１図の示す所である。

Ｃ０光−隠見 こうして得られた遺伝子の機能は以下の方法で確認出来
る。

まず、ρＥＤ］０３にクローン化された遺伝子を大腸菌
（旦１匹旦）と枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　５ｕｂｔ
ｉｌｉｓ）のシャトルヘクタ−ｐＨＹ３００ＰＬＫ（Ｔ
ＡＫＡＲＡ　５ＨＩＪＺＯＣＯ，。

ＬＴＤ）に第３図に示すとうり連結して新規組換えプラ
スミドρＥＸ３０１を得る。これを枯草菌（Ｂ、１ｃｉ
ｌｌｕｓｓｕｂｔｉ１ｉｓ）２０７−２１株に導入し、
導入菌をＮ８１．８％を含む培地で３７℃で振とう培養
し、上澄液のエラスチン分解活性を調べることにより確
認できる。

これら一連の操作に用いる技（ネｉ、すなわち、ザザン
ハイプリダイゼーション、染色体ＤＮＡの調製、制限・
修飾酵素によるＤＮＡの切断・連結方法等は例えばｒＭ
ｏｌｅｃｕｌａｒ　ＣＩｏｎｉｎＢ　Ｊ　（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓら著、Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉｒ＋Ｂ　１ｌａｒｂｏ
ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　１９８２刊）記載の方法に
したがって行うことができる。

次に実施例により本発明をさらに詳しく述べる。

爽１１潰Ｌ　逍訟ｊ領し写町ニョｒにじ（ｑ作成 バチルスＹａ−Ｂ　（機工研条寄第２０１７号）を、１
００βのグルコース２％、グリセロール２％、カゼイン
２％を含むｐｌｌｌｏ、ｏの培地で３７　’Ｃ１２３時
間培養し、得られた培養液を１０．００Ｏｒｐｍ　、Ｉ
　Ｏ分間遠心分離処理し、次に、ろ液に硫安を加え酵素
を沈殿分離した。この硫安全飽和沈殿物を透析後、ＤＥ
ＡＩＥ−Ｓｅｐ＋＋ａｄｅｘ八−２５のカラムクロマト
クラフィー（６Ｘ　８０ｃｍ　、　２　（１、１ｍｌ／
ｍ１ｎ）にかＧノ、その未吸着通過区分を次にＣＭ−５
ｅｐｈａｄｅｘ　Ｃ−５０カラムクロマトグラフイー　
　（５Ｘ８０ｃｍ、　１．４　Ｆ　、　０．５ｍｌ／ｍ
１ｎ）に張り込み０．５　Ｍ　ＮａＣ１で溶出すること
により精製酵素をえた。

この精製酵素ヲＥｄｍａｎの方法に従いヘソクマン社製
液相アミノ酸シークエンサーを用いＮ末端から約５０ア
ミノ酸の配列を調べたとこ７．以下のとうりであった。

Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　□ｊＨユｌｅ　Ａｓｎ　Ａｒ
６　ＶａｌＧｉｎ　　Ａｌａ　　Ｐｒｏ　　ｌｉｅ　　
Ａｌａ　　Ｇｌｎ　　Ｓｅｒ　　Ａｒｇ　　Ｇｌｙ　　
Ｐｈｅ（２■） Ｔｈｒ　　Ｇｌｙ　　Ｔｈｒ　　Ｇａｙ　　Ｖａｌ　　
Ａｒｇ　　Ｖａｔ　　Ａｌａ　　Ｖａｌ　　ＬｅｕＡｓ
ｐ　　１’ｈｒ　　Ｇｌｙ　　Ｉｃｅ　　Ｓｅｒ　　Ａ
ｓｎ　　Ｈｉｓ　　Ａｌａ　　Ａｓｐ　　Ｌｅｕ八ｒへ
　　Ｉｌｅ　　Ａｒｇ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｙ　　Ａｈａ
　Ｓｅｒ　　Ｐｈｅ　　Ｖａｌ　　Ｐｒ。

Ｇｌｙ　　Ｇｌｕ　　Ｐｒｏ　　八ｓｎこの配列の一部
Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−＋１ｅ−八ｓｎ−＾ｒｇ（上
記下線部分）に対応する下式の１７塩基配列９６種の混
合合成プローブをホスホアミダイト法により合成した。

このうち３位の塩基ＡはＧ、Ｃ又はＴと置換され、９位
の塩基ＡはＧ、Ｃ又はＴと置換され、１２位の塩基Ａは
Ｃ又はＴと置換され、１５位の塩基ＣばＴとそれぞれ置
換され、合計９６種類の組み合わせが得られる。

久 バチルスＹａ−Ｂ（機工研条寄第２０１７号）を２ｐの
グルコース２％、グリセロール２％、カゼイン２％を含
むｐｌｌｌｏ、０の培地で３７℃、３時間培養し、培養
後１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して菌体を集
め、染色体ＤＮＡを取り出した。染色体ＤＮＡの調整方
法及び以下に述べる制限・修飾酵素によるＤＮＡの切断
・連結方法は［ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ　Ｊ
（Ｍａｎｉｔｉａｓら著、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１
ｌａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　１９８２刊）記載
の方法にしたがって行った。次に、この染色体ＤＮＡ　
５０ｐｇを制限酵素１１ｉｎｄ■で切断した（３７℃、
２時間、１ｕｎｉｔ酵素／１■ＤＮＡ）。ここで得られ
た断片群から、サザンハイブリダイゼーション（Ｓｏｕ
ｔｈｅｒｎ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）の手法に従
い、遺伝子を含む断片を探索した。これには、まず、断
片群をアガロース電気泳動で分画し、ゲルのままアルカ
リ溶液（０，５Ｍ　ＮａＯＨ。

１、５　Ｍ　ＮａＣ１）に室温で３０分間浸し、ゲル内
でＤＮＡを変性させ一本鎖とした。ゲルを中性に戻した
後（０，５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　３　Ｍ　ＮａＣｌ
、ｐＨ７、０）、ニトロセルロースフィルターを密着し
、高塩溶液（３Ｍ　ＮａＣ１，０，３Ｍ　Ｔｒｉ−ｓｏ
ｄｉｕｍ　ｃｉｔｒａｔｅ、　ｐｌ＋７．６）で毛細管
現象を利用して移動、リル内のＤＮＡ分画区分を一本鎖
のままフィルターに吸着保持させた。これを室温で乾燥
し、８０°Ｃで２時間加熱してＤＮＡを固定化後、ｆｆ
２ｐで放射線標識した上記混合合成プローブと溶液（１
，８Ｍ　ＮａＣ１゜０、２　Ｍ　Ｔｒｉ−３ｏｄｉｕｍ
　ｃｉｔｒａｔｅ　ｐＨ７，６）中で４５℃、１６〜２
４時間ハイブリダイスさせた。余分のプローブ゛を同ン
容液（１，８Ｍ　ＮａＣ１，０，２Ｍ　Ｔｒｉ−３ｏｄ
ｉｕｍｃｉｔｒａｔｅ　ｐＨ７、６）を用い４５℃、１
時間洗浄除去した後、オートラジオグラフィーをとった
ところより２．２ｋｂの位置にポジティブシグナルを示
し、ごのバントの位置を遺伝子を構成するＤＮＡの位置
と同定した。同条件で分画したゲルの２．２ｋｂの位置
よりＤＮＡを抽出して、求めるＤＮＡ断片（ｌｌｉｎｄ
　ｍ　２．２　ｋｂ断片）を得た。　この２．２ｋｂＤ
Ｎ＾断片をプラスミドヘクタ−ｐｔｌｃ１８の旧ｎｄｌ
ｌＩ部位に結合して第２図に示すごとく、組換えプラス
ミドｐＥＤ１］　とした。これを塩化カルシウム法で大
腸菌（Ｅ、　　ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１株に導入し、寒
天培地上で一晩培養した。２．２　ｋｂ　ＤＮＡ断片を
もつクローン（クローンａ）は３Ｊ）で放射線標識した
」−記混合合成プローブによるコロニー・ハイブリダイ
ゼーシヨンによって選択した。これには、寒天培地上に
ηニじたコロニー上にニトロセルロースフィルターを密
着してコロニーをうつし、アルカリ溶液（０，５Ｍ　Ｎ
ａ０１ｌ、　１．５　Ｍ　ＮａＣ’ｌ）でＤＮＡを変性
、−本鎖とした後中性に戻しく　０．５　Ｍ　Ｔｒｉｓ
−１１ｃＩ、　３Ｍ　ＮａＣｌ。

ｐＨ７，０）、室温で乾燥、８０℃で２時間加熱してＤ
ＮＡを固定化後、３２ｐで放射線標識した上記混合合成
プローブとハイブリダイズさせ、余分のプローブを洗浄
除去した後、オートラジオグラフィーでクローンを検出
した。このりＬ７−ン（クローンａ）は、しかし、アル
カリ性エラスターゼを発現せず、結局、２．２　ｋｂ　
ＤＮＡ断片は遺伝子の一部に過ぎない事が判明した。ま
た、この塩基配列を決定したところ、Ｃ末の一部を欠く
ことかわかった。

ｂ、後オ迎Ｊ■ｊ（ｋ外煕二之」つのり【−ｊ−−ろＺ
−久そこで、次に、前記染色体１）ＮＡ　５０ｐｇを制
限酵素ｌａｐ　Ｉｔで切断（３７℃、２時間、１ｕｎｉ
ｔ酵素／１μｇ　ＤＮＡ）　　シ、ここで得たＤＮＡ断
片群を、上記と同様に、アガロース電気泳動で分画後、
クロモソーム・ウオーキング（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ−
ｗａｌｋｉＢ）の手法にり、次のごとく、残りのＤＮＡ
を含む断片を得た。

アガロース電気泳動で分画したプレートに３２ｐで放射
線標識した旧ｎｄ１１１２．２ｋｂ断片を新たなプロー
ブとして用い、前記ザザンハイプリダイゼーション（Ｓ
ｏｕｔｈｅｒｎ　ｈｙｂｒｉ旧ｚａＬｉｏｎ）と全く同
し手法でハイブリダイスさせた結果、オートラジオグラ
フィーで２．５ｋｂの位置にポジティブシグナルを示し
た。前記同様にゲルの２．５　ｋｂの位置より抽出して
新たなりＮＡ断片（Ｈａｐ　ＩＩ　２．５　ｋｂ断片）
を得た。

これを第２図に示すごとく、プラスミドヘクタｐｔｌｃ
］８のＡＣＣＩ部位に結合し、組換えプラスミドｐＥＤ
１０２とした。これを塩化カルシウム法で大腸菌（Ｅ、
　　ｃｏｌｉ）ＭＣＩ’０６１株に導入し、ｆｌａｐ　
１１２．５　ｋｂ断片をもつクローン（クローンｂ）は
３２ｐで放射線標識した１ｌｉｎｄ　ｍ　２．２　ｋｂ
断片をプローブにしてコロニー・ハイブリダイセーショ
ンによって選択した。このクローン選択操作は、プロー
ブに３２ｐで放射線標識した１目ｎｃｌｌＩＩ２．２ｋ
ｂ断片を用いた他は、前記２．２　ｋｂ　ＤＮＡ断片を
もつクローンの場合と全く同し操作で行った。

ｃ、゛　云　全　をもつプラスミー［ｑ＠染前記クり−
ンａおよびクローンｂからそれぞれ組換えプラスミドｐ
ＥＤ１１　　、ｐＥＤ１０２をアルカリＳＤＳ法により
分離し、両プラスミドを第３図に示すごとく連結し、遺
伝子全体を包含するプラスミドｐＥＤ１０３を構築した
。

すなわち、ｐＥＤＩＩ　　、ｐＥＤＩ０２はそれぞれ重
なり合う部分を持つため、第３図に示すように、ｐＥＤ
ｌｌ及びｐＥＤ１０２を種々の制限酵素で処理し、制限
酵素地図を作成したところ、ｐｌＥＤｌｌ　とｐＥＤ１
０２は約９００塩基対長にわたり重なり合う部分がある
ことが分かった。そこで、予め、ｐＥＤｌｌを制限酵素
Ｂｇｌ　ＩＩと旧ｎｄ１１１で、また、ｐＨ１Ｄ１０２
を制限酵素Ｂａｍ１ｌ　Ｉと旧ｎｄｌ［［で切断してお
き、その後両者を合わせ、丁４ＤＮＡ　リガーゼを用い
て繋いだ。これを塩化カルシウム法で大腸菌（Ｅ、　　
ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１株に導入し、寒天培地で一晩培
養し、生じたコロニーから無作為に２０個を選び、別々
に一晩培養した後、アルカリＳＤＳ法によりプラスミド
を調整し、それぞれをアガロース電気泳動で分画し、予
定した組換え体を得た。このＤＮＡが求めるｐＥＤＩ０
３に相当し、同様に、大腸菌（Ｅ、　　ｐｏｌｉ）ＭＣ
ＩＯ（ｉ１株にクローン化した。これらの操作もｒＭｏ
ｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｊ（ＭａｎｉａＬｉ
ｓら著、Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉｒ＋ｇｌｌａｒｂｏｒ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ１９８２刊）記載の方法にしたがっ
て行った。

かくして得た遺伝子のＤ　Ｎ　Ａ配列をグイデオキシ法
により調べた結果、および、ごのＤＮＡ配列から得られ
るアミノ酸配列は第１−１図〜第１−３図の示す所であ
った。この配列決定に当っては第４図４Ｙ示すストラテ
ジーを用いた。

次１１久　光−視 ｐＥ［）１０３にり１１−ン化された遺伝子を枯草菌で
発現させた。このために、大腸菌（Ｌ　並置）と枯草菌
（軸回ユ几旦　ω旦匡ジ）のシャトルベクターｐＨＹ３
００１’ＬＫ（ＴＡＫＡＲＡ　５ＨＬＩＺＯＣＯ，、Ｌ
ＴＤ）を用い、第３図に示すごとく、両プラスミド各１
０μｇを制限酵素Ｓａｌ　ＩおよびＥｃｏＲＩで切断（
３７℃、１時間）後合わせてＴ４ＤＮＡ　リガーゼで連
結して組換えプラスミドｐＥＸ３０１を構築した。これ
を塩化カルシウム法で大腸菌（Ｌ　延）ＭＣ１０６１株
に導入し、ρＥＤ１０３の場合と同じ操作で８．　Ｏｋ
ｂのプラスミド、すなわちｐＥＸ３０１を保有するクロ
ーンを選定した。かくして得た組換えプラスミドｐｌｕ
Ｘ３０１を今度は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　５ｕｂ
ｔｉ１ｉｓ）２０７−２１株に塩化カルシウム法で導入
した。導入菌を栄研ブイヨン１．８％を含むＮＢ培地に
接種し、３７℃で振とう培養し、６時間、２４時間、７
２時間後に培地を採り、それぞれエラスターゼ活性を測
定した結果第１表のとうりであった。

比較のためｐＥＸ３０１を導入しない枯草菌（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ−ｓｕｂＬｉｌｉｓ）　２０？−２１株を同様
に培養しエラスターゼ活性を測定した結果第１表のとう
りであった。

エラスターゼ活性の測定方法は次のごとく行った。

水平部４　ｃｍのミニＬ字管に１５■のｅｌａｓｔｉｎ
−ｏｒｓｅｉｎ　（Ｓｉｇｍａ社Ｅ１５００）を採り、
１ｍｌの緩衝液（ＮａＨＣＯ＋−ＮａｚＣＯ＋　５０ｍ
Ｍ　、ｐＨｌＯ，５）とＩｎ＋Ｉの菌体培養上澄液を入
れ、３７℃で振とうしなから反応させ、３０分後、２ｍ
ｌの反応停止液（ＮａＨＰＯ，、−Ｎａ、ＰＯ４０、７
　Ｍ、　ｐＨ６、０）を添加し、遠心分離で基質ｅｌａ
ｓＬｉｎ−ｏｒｓｅｉｎを除去し、上澄の５９０ｒ＋Ｉ
１１吸光度を測定した。全量１５曙のｅｌａｓ　ｔｉｎ
−ｏｒｓｅｉｎの半分を分解できる酵素量を１０ｕｎｉ
ｔとした。

第一−−Ｖ−俵 エラスターゼ活性 これら一連の操作に用いる技術すなわちサザン・パイプ
リダイゼーション（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｈｙｂｒｉｄｉ
ｚａ−ｔｉｏｎ）　、染色体ＤＮＡの調製、制限・修飾
酵素によるＤＮＡの切断・連結方法等はｒ　Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒＣ］ｏｎｉｎｇＪ　　（Ｍａｎｉａｔｉｓら著
、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ　１９８２刊）記載の方法にしたがって行った
。

〔発明の効果〕

本発明の遺伝子は完全なアルカリ性エラスターセ遺伝子
をコードしており、遺伝子をｋＪｌみ込んだプラスミド
は宿主細胞内で発現可能であり、アルカリ性エラスター
ゼの生産方法としてイ１用なものである。遺伝子の塩基
配列は完全なアルカリ性エラスターゼ生産遺伝子の塩基
配列を示し、アルカリ性エラスターゼのアミノ酸配列を
コートしている。

【図面の簡単な説明】

第１−１図〜第１−３図は本発明のアルカリ性エラスタ
ーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列および該
ポリベフチドをコードする遺伝子の塩基配列を示す。 第２図は制限酵素による切断部位、並びにプラスミドｐ
ＥＩ１１１及びｐＥＤ１０２の構築方法を示す。 第３図は本発明のプラスミＦ　ｐＥＤ１０３才ノよびｐ
ＥＸ３０１の構築方法を示す。 第４図は塩基配列の決定に用いたストラテジーを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アルカリ性エラスターゼ活性を有するポリペプチド
   をコードする遺伝子。 ２、次の性質： （１）分子量：２５，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルア
   ミドゲル電気泳動による）； （２）等電点：１０．６； （３）至適反応温度：６０℃； （４）至適反応ｐＨ：１１．７５；及び （５）安定ｐＨ範囲：５．０〜１０．００；を有し、バ
   チルス属微生物に由来するアルカリ性エラスターゼ活性
   を有するポリペプチドをコードする、請求項１に記載の
   遺伝子。 ３、次のアミノ酸配列： 【アミノ酸配列があります】 を有するポリペプチドをコードする、請求項１に記載の
   遺伝子。 ４、次の塩基配列： 【アミノ酸配列があります】 を有する、請求項１に記載の遺伝子。 ５、次のアミノ酸配列： 【アミノ酸配列があります】 を有するポリペプチドをコードする、請求項１に記載の
   遺伝子。 ６、次の塩基配列： 【アミノ酸配列があります】 を有する、請求項１に記載の遺伝子。 ７、請求項１〜６のいずれか１項に記載の遺伝子を含む
   ベクター。 ８、請求項７に記載のプラスミドにより形質転換された
   宿主を培養し、この培養物からアルカリ性エラスターゼ
   活性を有するポリペプチドを採取することを特徴とする
   、該ポリペプチドの製造方法。