JPH0272889A - トロパン系アルカロイドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はスコポラミン、ヒヨスチアミンなどのトロパン
系アルカロイドを効率的に製造する方法に関する。

〔従来の技術〕

トロパン系アルカロイドの主成分であるヒヨスチアミン
、スコポラミンは鎮痛、鎮痙作用を有すする医薬品およ
び医薬品原料として用いられており、天然の植物体中か
ら抽出して製造されている。

これらのアルカロイドは植物体中の含量も微量であり、
また植物の栽培は環境条件に著しく左右され、しかも収
穫に長期間を要する為、植物の細胞培養により生産しよ
うとする研究が数多く行われた。しかし、脱分化したカ
ルスでは母植物に比較して含量が低く、また選抜して得
られた高生産株の特性が継代培養中に失われるなどの問
題があった。山田らはヒヨスのカルスから再分化した不
定根はカルスに比較しスコポラミン含量が大幅に向上し
たと報告した（　ＰｌａｎＬａ　Ｍｅｄｉｃａ　４７．
１９５〜１９９　（１９８３））。また、ズボイシアで
も組織培養中に得られる不定根から著量のスコポラミン
およびヒヨスチアミンを検出した（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１
ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ３、１８６〜１８８（１９８４）　
）。一方、真野ら（住友化学）はズボイシアにアグロバ
クテリウム・リゾゲネス菌を感染させ、誘発された毛状
根をタンク培養することで４週間でスコポラミンを７８
■生産可能にした。（第１０回植物組織培養シンポジウ
ム１９８７．７）〔発明が解決しようとする課題］ 上記の従来技術では、工業的規模でトロパン系アルカロ
イドの生産を可能にするためにはその生産量はまだ充分
とは言えず、さらに生産性を向上させることが課題であ
った。

本発明者らは既に、ナス科植物の朽培養等により得られ
た半数体由来不定根（染色体数＝１４）は２倍体由来不
定根に比べ各クローン間のトロパン系アルカロイド生産
量の相異が大きいことを明らかにし、この中より高生産
株を選抜して、該選抜株の不定根を培養することにより
トロパン系アルカロイドを効率よく製造する方法を見出
し、特願昭６２−３２３７４４号として出願した。

本発明の目的はさらに生産性の高いトロパン系アルカロ
イドの製造方法を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、上記目的を達成すべく研究した結果、ナ
ス科植物の不定根を培養することによるトロパン系アル
カロイドの製造方法において、前記不定根として、ナス
科植物の半数性組織から再分化した不定根を倍数化せし
め、得られた倍数性不定根の中からトロパン系アルカロ
イド高生産株を選抜し、前記選抜株の不定根を使用する
ことにより上記目的が良好に達成されることを見出した
。

本発明は上記新知見に基づいて完成されたものであって
、その要旨は、 「ナス科植物の不定根を培養することによるトロパン系
アルカロイドの製造方法において、ナス科植物の半数性
Ｍｉ織から再分化した不定根を倍数化せしめ、得られた
倍数性不定根の中からトロパン系アルカロイド高生産株
を選抜し、前記選抜株の不定根を培地で培養し、トロパ
ン系アルカロイドを採取することを特徴とするトロパン
系アルカロイドの製造方法。」 にある。

本発明で用いるナス科植物としてはヒヨスチアムス属、
アトロバ属、スコボリア属、ダツラ属、ズボイシア属に
属する植物が挙げられる。

半数性組織としては例えば豹、花粉培養により直接得ら
れたカルス、半数性植物体、前記植物体から誘導したカ
ルス、が挙げられる。

半数性組織の作成方法としては親植物から採取した蕾を
次亜塩素酸ナトリウム等で滅菌後、蕾の中から杓を取り
出し培養するか、さらには朽から花粉を取り出し培養す
ると１〜３ケ月で半数性の植物体もしくはカルスが得ら
れる。豹、花粉の培養に用いる培地としては必要に応じ
て植物ホルモンを添加した一般の植物の培養に用いられ
る８５゜ＭＳ等の培地が挙げられる。また、植物ホルモ
ンは例えば２．４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−
Ｄ）、インドール醋酸（ＩＢＡ）　、インドール酢酸（
ＩＡＡ）　、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）等のオーキシン
類、およびカイネチン、ベンジルアデニン等のサイトカ
イニン類が挙げられるが半数性組織の形成に適したホル
モンの種類、ホルモン濃度は植物の種類によって異なる
。

半数性組織からの不定根の誘導および培養に用いる培地
としては、植物ホルモン無添加または必要に応じて植物
ホルモンを添加したＢ５．　？ＩＳ等の培地が挙げられ
る。添加する植物ホルモンは上記同様のオーキシン類単
独あるいは、オーキシン類とサイトカイニン類を組み合
わせて用いることができる。植物ホルモンの濃度はオー
キシン類は１ｍｇ／ｊ２以下、サイトカイニン類は０．
３■７１以下で用いることができるが、不定根の誘導お
よび培養に適したホルモン濃度は植物の種類によって異
なる。

本発明ではトロパン系アルカロイドを製造するに当たり
、豹、花粉培養等により得られた半数性組織から再分化
した不定根を例えばコルヒチン、ポドフィリン、亜酸化
窒素等の処理により倍数化した倍数性不定根（半数体由
来不定根）を使用するものである。

次いで、上記のようにして得た倍数性不定根（半数体由
来不定根）の中から、例えばガスクロマトグラフィー等
でヒヨスチアミン、スコポラミン等の含量を測定し、高
含量株を選抜することによって２倍体（親植物）由来不
定根よりも生産能力の高い株を取得することができる。

詳しくは、朽、花粉等の培養により得られた基本数の染
色体しか持たない半数体由来不定根の中からトロパンア
ルカロイド高生産株を選抜することにより２倍体（親植
物）由来不定根よりも生産能力の高い株を所得できるが
、選抜した前記不定根を基本数の整数倍の染色体をもつ
例えば２倍体、３倍体、４倍体等を倍数化することによ
り、さらに倍数化前の半数体由来不定根を上回るトロパ
ンアルカロイド高生産株を取得することができる。

即ち、２倍体（親植物）由来不定根に比べ墨かに生産性
の高いトロパンアルカロイド高生産株を取得することが
できる。

〔実施例１］ 以下、本発明の方法を実施例によって更に具体的に説明
する。

温室内で生育させた２倍体（染色体数＝２８）のヒヨス
（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ　ｎｉｇａｒ　Ｌ、）の蕾を採
取し、１％次亜塩素酸ナトリウム溶液で１５分間表面滅
菌した後、５０〜６０個の豹を蕾から取り出し、０．０
３ｍｇ／Ａ２．４−Ｄ、　０．３■／２カイネチンを添
加したＢ５寒天培地上に植え付けた。１〜２ケ月後に７
個の豹から半数体（染色体数＝１４）として幼植物およ
びカルスが得られた。幼植物については葉の切片を０．
１　ｍｇＩＱ　２．４−Ｄ、　０．３ｍｇ／Ｉ！、カイ
ネチンを添加したＢ５寒天培地上に植え付はカルスを誘
導した。

上記の異なる朽から得られた７系統の半数性カルスをホ
ルモン無添加の８５寒天培地に移すとカルスから不定根
が生じ、増殖を続けた。

これらの７系統の半数体由来不定根（染色体＝１４）を
各々０．０１％コルヒチン溶液に４８時間浸し、倍数体
として各々に対応する７系統（Ｎα１ｌ−Ｎｏ、１７）
の不定根（染色体数＝２８または染色体数＝５６）を得
た。

以上の７系統（Ｎｏ、１１〜Ｎα１７）の半数体由来不
定根（染色体数・２８または染色体数＝５６）について
各々乾燥重量で０．１ｇをホルモン無添加の８５液体培
地（２００Ｌ［１／）を含む三角フラスコ（３００ｎｔ
／）に植え付け、回転振の培養した（回転数１５０ｒｐ
ｍ、温度２８°Ｃ１光２０００１ｕｘ）。

培養中、細胞および培地の一部からアルカロイドを抽出
し、不定根のヒヨスチアミン、スコポラミン生産量（含
量、培地への分泌量）を調べた。

細胞からのアルカロイド抽出方法としては乾燥させた不
定根を一部エタノール：アンモニア（９：１）に浸し、
アルカロイドを抽出した。抽出液を減圧δ：締縮後１ｒ
ｎｌの０．ＩＮ　ＩＩｃＩを加え濃縮物を溶解しＫＯＩ
Ｉでアルカリ性にした後、クロロホルムでアルカロイド
を再抽出した。抽出液を減圧濃縮し、濃縮物をクロロホ
ルム二Ｎ、０−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド
（４：１ｖ／ν）に溶解し、ガスクロマトグラフィーの
試料とした。一方、培地からのアルカロイド抽出は培地
をＫＯｌｌでアルカリ性にした後、クロロホルムで抽出
し、以後上記と同様の操作を行なった。

また、ガスクロマトグラフィー〇カラムとしてキャピラ
リー０ｖ−１を用い、ヒヨスチアミン１　スコポラミン
を定量した。（カラム温度２３０°（：、ｔｌｅｉ速５
Ｑａ／／ｗｉｎ） 半数体由来不定根（Ｎｏ、１１〜Ｎα１７）の１ケ月当
たりのヒヨスチアミン、スコポラミン生産量と培養中の
含量の最大値を表−２に示す。

〔比較例１］ 実施例１における倍数化前の半数体由来不定根を用いて
、実施例１と同様の方法で培養し、不定根（Ｎｏ、　１
〜Ｎα７）の１ケ月当たりのヒヨスチアミンスコポラミ
ン生産量と培養中の含量の最大値を測定し、その結果を
表−１に示す。

また、実施例１で用いた２倍体ヒヨス（Ｈｙｏｓｃｙａ
ｍｕｓ　ｎｉｇｅｒ　Ｌ、）の異なる部位（葉）から３
系統のカルス誘導し、以下実施例１と同様の操作で不定
根（Ｎｏ、８〜Ｎｏ、１０）を誘導し、各々についてヒ
ヨスチアミン。

スコポミン生産量を調べた。２倍体（親植物）由来不定
根（Ｎｏ、８〜Ｎｏ、１０）の１ケ月当たりのヒヨスチ
アミン、スコポラミン生産量と培養中の含量の最大値を
表−１に示す。

表−１及び表−２から明らかなように、本発明により倍
数体として得られた半数体由来不定根（Ｎｏ。

１１〜Ｎｏ、１７）の中からさらに倍数化前の半数体由
来不定根（表−１，Ｎｏ、１〜Ｎｏ、　７　）を上回る
スコポラミン高生産株を取得することができた。即ち、
２倍体由来不定根に比べ遥かに生産性の高いスコポラミ
ン高生産株が得られた。

［実施例２］ 温室内で生育させた２倍体（染色体数＝２４）のヨウシ
ュチョウセンアサガオ（Ｄａｔｕｒａ　ｔａｔｕｌａ　
Ｌ、）の蕾を採取し、１％次亜塩素酸ナトリウム溶液で
１５分間表面滅菌した後、１２０個の豹を蕾から取り出
し、Ｏ，１ｍｇ／ｌ　２．４−Ｄ、０．３ｍｇ／ｆｆｉ
カイネチンを添加したＢ５寒天培地上に植え付けた。１
ケ月後に１０個の朽から半数体（染色体数＝１２）とし
てカルスが得られた。

上記の異なる豹から得られた１０系統の半数性カルスを
１．０■／１ｌＢＡを添加したＢ５液体培地に移すとカ
ルスから不定根が生じた。誘導した不定根はＢ５培地中
でＩＢＭ濃度を段階的に減少させることにより、増殖速
度が高まり最終的にはホルモンフリーで増殖することが
できた。

これらの１０系統（Ｎα１〜Ｎｏ、１０）の半数体由来
不定根（染色体数＝１２）を各々１．０χコルヒチン溶
液に４８時間浸し、倍数体として各々に対応するＩＯ糸
系統ＮＯ。

１１〜Ｎα２０）の不定根（染色体数＝２４または染色
体数・４８）を得た。以上の１０系統（Ｎｏ、１１−Ｎ
α２０）の半数体由来定ｍ（染色体数＝　２４　、４８
）について各々乾燥重量で０．１ｇを０．００５ｍｇ／
　ｆｆｉ　ＩＢＡを添加したＢ５液体培地（２００ｍｌ
りを含む三角フラスコ（３００ｍｅ）に植え付は回転振
盪培養した（回転数１１００ｒｐ、温度２８°Ｃ１暗所
）。

培養中、細胞および培地の一部からアルカロイドを抽出
し、不定根のヒヨスチアミン、スコポラミン生産量（含
量、培地への分泌量）を調べた。

細胞からのアルカロイド抽出方法としては乾燥させた不
定根を一部エタノールーアンモニア（９：１）に浸し、
アルカロイドを抽出した。抽出液を減圧濃縮後、１　ｍ
ｌの０．１Ｎ　ＨＣＩを加え濃縮物を溶解しＫＯＨでア
ルカリ性にした後、クロロホルムでアルカロイドを再抽
出した。抽出液を減圧濃縮し濃縮物をクロロホルム二Ｎ
、０−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（４：　
１　ｖ／ｖ）に溶解し、ガスクロマトグラフィーの試料
とした。一方、培地からのアルカロイド抽出は培地をに
Ｏｌｌでアルカリ性にした後、クロロホルムで抽出し、
以後上記と同様の操作を行なった。

また、ガスクロマトグラフィー〇カラムとじてキャピラ
リーｏＶ−１を用い、ヒヨスチアミン、スコポラミンを
定量した。（カラム温度２３０°（、Ｉｌｅ流速５０ｍ
ｆｉ／ｍ１ｎ） 半数体由来不定根（Ｎｏ、１１〜Ｎｏ、２０　）の１ケ
月当りのヒヨスチアミン、スコポラミン生産量と培養中
の含量の最大値を表−３に示す。

〔比較例２〕 実施例２における倍数化前の半数体由来不定根を用いて
、実施例２と同様の方法で培養し、不定根（Ｎα１〜Ｎ
α１０）の１ケ月当たりのヒヨスチアミン。

スコポラミン生産量と培養中の含量の最大値を測定し、
その結果を表４に示す。

また実施例２で用いた２倍体ヨウシュチョウセンアサガ
オ（Ｄａｔｕｒａ　ｔａｔｕｌａ　Ｌ、）の異なる部位
（葉）から１０系統のカルスを誘導し、以下実施例１と
同様の操作で不定根（Ｎｏ、２１〜Ｎα３０）を誘導し
、各々についてヒヨスチアミン、スコポラミン生産量を
調べた。２倍体由来不定根（Ｎｏ、２１〜Ｎｏ、３０　
）の１ケ月当りのヒヨスチアミン、スコポラミン生産量
と、培養中の含量の最大値を表−３および表−４に示す
。

表−３及び表−４から明らかなように、本発明により倍
数体として得られた半数体由来不定根（Ｎｏ、１１＝Ｎ
ｏ、２０）の中から倍数化前の半数体由来不定根（表−
４Ｎｏ、　１〜Ｎｏ、　１０　）をさらに上回る総アル
カロイド高生産株を取得することができた。即ち、２倍
体由来不定根に比べ溝かに生産性の高い株が得られた。

（実施例３〕 温室内で生育させた２倍体（染色体数＝２４）のキダチ
チョウセンアサガオ（Ｄａｔｕｒａ　５ｕａｖｅｏｌｅ
ｎｓ　ｌイｕｍｂ）の蕾を採取し、１％次亜塩素酸ナト
リウム溶液で１５分間表面滅菌した後、８０個の朽を蕾
から取り出し、Ｏ，ｌ　ｍｇ／　ｆ　ＩＢＡ、　０．に
／　ｆｆｉカイネチンを添力１１シたＢＳ寒天培地上に
植え付けた。１ケ月後に６個の朽から半数体（染色体数
＝１２）としてカルスが得られた。

］二記の異なる豹から得られた６系統の半数性カルスを
０．８　ｍｇ／　ｅ　ＩＢＡを添加したＢ５液体培地に
移すとカルスから不定根が生じた。誘導した不定根はＢ
５培地中でＩＢＭ−４度を段階的に減少させることによ
り、増殖速度が高まり最終的にはホルモンフリーで増殖
することができた。これらの６系統（Ｎｏ、　１〜Ｎｏ
、　６　）の半数体由来不定根（染色体数＝１２）を各
々１．０％コルヒチン溶液に４８時間浸し、倍数体とし
て各々に対応する６系統（Ｎｏ、７〜Ｎｏ、　１２　）
の不定根（染色体数−２４，４８）を得た。以上の６系
統（Ｎα７〜Ｎｏ、１２）の半数体由来不定根（染色体
数−２４，４８，）について実施例２と同様の方法で培
養し、各々についてヒヨスチアミン、スコポラミン生産
品を調べた。１ケ月当りのヒヨスチアミン、スコポラミ
ン生産品と培養中の含量の最大値を表−５に示す。

〔比較例３〕 実施例３における倍数化０１１の半数体由来不定根を用
いて、実施例３と同様の方法で培養し、不定１艮（Ｎｏ
、　１〜Ｎｏ、　６　）の１ケ月当たりのヒヨスアミン
、スコポラミン生産量と培養中の含量の最大値を測定し
、その結果を表−６に示す。

また、実施例３で用いた２培体キダチチョウセンアサガ
オ（Ｄａｔｕｒａ　５ｕａｖｅｏｌｅｎｓ　Ｉｌ、）の
異なる部位（葉）から６系統のカルスを誘導し、以下実
施例３と同様の操作で不定根（Ｎｏ、１３〜Ｎｏ、　１
８　）を誘導し、各々についてヒヨスチアミン、スコポ
ラミン生産量を調べた。２倍体由来不定根（Ｎｏ、１３
〜Ｎｏ、　１８　）の１ケ月当りのヒヨスチアミン、ス
コポラミン生産量と、培養中の含量の最大値を表−６に
示す。

（本頁以下余白） 表−５及び表−６から明らかなように、本発明により倍
数体として得られた半数体不定根（Ｎｏ、７〜！ｉｏ、
　１２　）の中から倍数化前の半数体由来不定根（表６
Ｎｏ、１〜Ｎｏ、　６　）をさらに上回るスコポラミン
高生産株を取得することができた。即ち、２倍体由来不
定根に比べ墨かに生産性の高いスコポラミン高生産株が
得られた。

〔実施例４〕 温室内で生育させた２倍体（染色体数＝７２）のベラド
ンナ（Ａｔｒｏｐａ　ｂｅｌｌａｄｏｎｎａ　Ｌ、）の
蕾を採取し、１％次亜塩素酸ナトリウム溶液で表面滅菌
した後、７０個の朽を蕾から取り出し、０．０３■／１
２，４−Ｄ、０．３ｍｇ＃！カイネチンを添加したＢＳ
寒天培地上に植え付けられた。１ケ月後に６個の豹から
半数体（染色体数−３６）として幼植物が得られた。さ
らに、幼植物の葉の切片を０．１　ｍｇ／　Ｑ　２，４
−Ｄ、０．３　ｍｇ／　１カイネチンを添加したＢ５寒
天培地上に植え付はカルスを誘導した。

上記の異なる朽から得られた６系統の半数性カルスをホ
ルモン無添加の８５寒天培地に移すとカルスから不定根
が生じ、増殖を続けた。これらの６系統（Ｎα１〜Ｎｏ
、　６　）の半数体由来不定根（染色体数＝３６）を各
々０．１％コルヒチン溶液に４８時間浸し、倍数体とし
て各々対応する６系統（Ｎα７〜Ｎｏ、１２）の不定根
（染色体数−７２，１４４）を得た。以上の６系統（Ｎ
α７〜Ｎα１２）の半数体由来不定根（染色体数＝８２
，１４４）について実施例２と同様の方法で培養し、各
々についてヒヨスチアミン、スコポラミン生産量を調べ
た。１ケ月当りのヒヨスチアミン、スコポラミン生産量
と培養中の含量の最大値を表−７に示す。

〔比較例４］ 実施例４における倍数化前の半数体由来不定根を用いて
、実施例４と同様の方法で培養し、不定１１（Ｎα１〜
Ｎα６）の１ケ月当たりのヒヨスチアミン、スコポラミ
ン生産量と培養中の含量の最大値を測定し、その結果を
表−８に示す。

また、実施例４で用いた２倍体ベラドンナ（Ａｔｒｏｐ
ａｂｅｌｌａｄｏｎｎａ　Ｌ、）の異なる部位（葉）か
ら６系統のカルスを誘導し、以下実施例４と同様の操作
で不定ｔｌ（Ｎｏ、１３〜Ｎへ１８）を誘導し、各々に
ついてヒヨスチアミン、スコポラミン生産量を調べた。

２倍体由来不定根（Ｎα１３〜Ｎｏ、１８）の１ケ月当
りのヒヨスチアミン、スコポラミン生産量と、培養中の
含量の最大値を表−８に示す。

（木頁以下余白） 〔発明の効果〕 本発明により、きわめて生産性の高いトロパン系アルカ
ロイドの製造方法が提供される。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、ナス科植物の不定根を培養することによるトロパン
   系アルカロイドの製造方法において、ナス科植物の半数
   性組織から再分化した不定根を倍数化せしめ、得られた
   倍数性不定根の中からトロパン系アルカロイド高生産株
   を選抜し、前記選抜株の不定根を培地で培養し、トロパ
   ン系アルカロイドを採取することを特徴とするトロパン
   系アルカロイドの製造方法。