JPH0272867A - 細胞培養培地の交換方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は細胞培養培地の交換方法に関する。

〔従来の技術・発明が解決しようとする課題〕近年、バ
イオテクノロジーの進歩にともない微生物や細胞などを
培養して利用する装置も種々提案されてきている。

しかし、細胞培養に必要な培地およびその他必要とされ
る成分（たとえば血清、リンホカインなどの生理活性物
質など）の補給はできても老廃物を除去するのに適した
装置はなく、毎日〜数日に１回の割合で培地などを取か
えなければならないというのが実情である。

培地などの取替えは、たとえばカルチャーボトルを使用
して細胞培養を行なうばあいには、これらの操作を無菌
的に行なうために、通常クリーンベンチで行なっている
。それゆえ、クリンベンチなどの設備が必要であるとい
う問題がある。そのうえ、とくに浮遊性細胞の培地を交
換するばあいには培地の交換前に細胞を分離しなければ
ならないという問題がある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は上述のごとき問題、とくにクリーンベンチのご
とき設備を用いずに、無菌的に、しかも細胞を分離した
すせずに容易に培地などを交換して好ましい状態で培養
することを目的としてなされたものであり、 細胞培養培地の交換を行なうに際し、培地は透過するが
細胞は透過しない中空糸束を含んでなる培地交換装置を
用いて行なうことを特徴とする細胞培養培地の交換方法 に関する。

〔作　用〕

本発明の方法では、培地容器中に特定の中空糸束を用い
た培地交換装置を配置しているため、クリーンベンチな
どを用いることなく、無菌的に、また細胞を分離したり
することなく培地を連続的かつ容易に交換することがで
き、培地を一定の好ましい状態に保ちうる。

この結果、長期間安定して効率よく細胞を培養すること
ができる。

〔実施例〕

本発明においては、細胞を培養する際に、細胞は透過し
ないが培地は透過する中空糸束を含んでなる培地交換装
置により培地などが交換される。

前記中空糸束を含んでなる培地交換装置は、培養により
生じた老廃物などを含む培地を排出する培地取出装置と
して機能し、培地などの供給は別に培地供給装置を設け
て行なってもよく、また培地供給兼培地取出装置として
機能してもよい。

まず前記培地交換装置が培地取出装置として機能し、培
地などの供給は別に培地供給装置を設けて行なうばあい
について説明する。

前記培地取出装置として機能する培地交換装置は、たと
えば第１図に示すように、中空糸束（１）の両端が支持
手段（２）、（３）で支持され、上端、下端が開口され
ており、該開口部（９）、（１０）には液体通路（４）
、（５）を有するキャップ（６）、（′７）が被冠され
ている装置がその一例としてあげられる。

第１図の装置における中空糸束は上端が開放された例で
あり、使用前の培地取出装置（８）のブライミングが容
易であり、また上下対称形に形成可能なので製造も容易
であるが、必ずしも上端は開放されている必要はなく、
支持手段（２）やキャップ（６）によって封鎖された形
になっていてもよい。ただし、上端が支持手段（′２Ｊ
などによって直接封鎖されたものは使用前の培地取出装
置のブライミングが困難であり、またブライミングをし
ないばあいにはエアブロツクがおこり、培地などの取出
効率がわるくなる。

中空糸束（１）を構成する中空糸としては、細胞を透過
しないものであるかぎりとくに限定はないが、通常平均
ポアサイズ３０人〜１論程度、さらには３０人〜０．２
−程度の中空糸が好ましく使用される。ことに、たとえ
ば平均ポアサイズが３０〜５０人のばあいには、細胞の
みならず血清やリンホカインなどの細胞活性化物質も透
過しないため、これらが節約される。またアルブミンや
フィブリノーゲン、リンホカインなどの産生物が透過し
ないので、これらの産生物の回収を必要とするばあいに
有用である。

該中空糸を構成する材質などにもとくに限定はないが、
培地などを透過させるため、たとえば再生セルロースな
どの親水性材料が好ましい。

たとえばセルローストリアセテート、セルロースジアセ
テート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル
、ポリアミド、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスル
ホンなどの親水性でない材料からなる中空糸のばあいに
は、表面を親水化した中空糸を用いる必要がある。

前記中空糸は通常３００〜６００本程度束ねて両端を、
たとえばウレタン樹脂などでボッティングして支持手段
（２）ｉ３）となるボッティング部を形成することによ
り中空糸束（１）とされる。

中空糸を束ねた際の断面形状、長さなどは、適宜選択す
ればよいが、培地との接触面積が大きくなるようにする
のが好ましく、通常円形の断面形状のものが採用される
。また、中空糸膜の表面に細胞が付着して目詰りするお
それのあるばあいには、中空糸の数を多くして膜の表面
積を広げるなどすればよい。

つぎに培地供給装置から新しい培地などを供給し、老廃
物などを含む培地などを培地取出装置から取出す本発明
の方法を、本発明に用いる細胞培養装置の一例に関する
説明図である第２図に基づき説明する。なお、本発明の
方法に用いる培養装置には培地取出装置として機能する
培地交換装置以外とくに限定はなく、従来から使用され
ているのと同様の装置であれば使用しつる。

第２図において（８）は培地取出装置、０１）は細胞培
養装置、Ｑ２１は培地などを収容する培地容器、旧は培
地供給装置、０４）はガス抜き手段、Ｇは培養系に雑菌
などが入るのを防止するためのエアフィルター、０■は
培地取出ライン、口は培地取出装置（８）と連通ずる液
体通路を有する保持手段であり、その上端がコックなど
で開放可能に閉鎖されている。

培地などの供給は培地供給装置■より行なわれる。この
際、培地容器０２）内の空気を抜くためガス抜き手段０
４）の開放下で行なうのが好ましい。

培養する細胞の取出しは、培地供給装置ｎにより行なっ
てもよいが、別に装置を設けて行なうのが培地の連続的
な供給・取出しが容易であるなどの点から好ましい。

培地容器０′２Ｊに培養すべき細胞、血清、リンホカイ
ンなどの細胞活性化物質、培地などが供給され、細胞の
培養条件に応じた温度などの条件下、培養が行なわれる
。

この際、エアポンプなどにより、たとえば０．２虜程度
のエアフィルターをとおしてガス供給手段（図示されて
いない）からガスが供給され、ガス交換が行なわれ、排
気ガスが、たとえばガス抜き手段０Φから排気される。

また、培地供給袋ｗｔＣｒ３から培地などが供給され、
老廃物などを含む培地は培地取出装置（８）の中空糸を
透過して培地取出ライン０■により取出される。培地な
どの取出しに際し、要すればポンプなどを使用してもよ
いことは当然のことである。

培地供給装置口から供給される新しい培地などの供給量
は、培地量、培養する細胞の種類や密度などにより異な
り、−概に規定できないが、１時間当り培地量の３〜６
％程度になるのが好ましい。また培地などの取出量は供
給される新しい培地などの量に応じて適宜選択すればよ
く、培養液量がほぼ一定になるようにするのが好ましい
。

たとえば培地の量１０１００Ｏ，細胞数ｌＸ１０８個／
　ｍｌ程度で培養するばあい、新しい培地などの供給量
を３０〜３５ｍ１／ｈｒとし、培地取出装置（８）とし
て膜表面積２５０ｃｊのごとき性能のものを使用するの
が好ましい。

このような方法で培養することにより、たとえばリンパ
球のばあい、３７℃の条件で１０６個／ｍｌから１０７
個／　ｍｌに培養することができる。

前記説明においては、培地などの供給を培地供給装置口
により行ない、培地の取出しを培地取出装置（８）によ
り行なったが、培地などの供給と取出しとを１つの装置
である培地供給兼培地取出装置で行なってもよい。

前記培地供給兼培地取出装置は、培地などの供給と取出
しとを１つの装置で行なえるものであるかぎりとくに限
定はないが、たとえば第１図に示す培地取出装置（８）
と同様の装置を用いて行なってもよい。

第１因に示す装置と同様の装置を培地供給兼培地取出装
置として用いるばあいの本発明の方法を、本発明に用い
る細胞培養装置の一例に関する説明図である第３図に基
づき説明する。

第３図に示される装置は、第２図に示される培地供給装
置■および培地取出装置（８）のかわりに培地供給兼培
地取出装置のが設けられているほかは、第２図に示され
た装置とほぼ同様の装置である。なお、図中の旧は培地
供給ラインである。

培地供給ラインＵから新しい培地などが導入されるが、
培地供給兼培地取出装置ＯＦ３の中空糸の内外で培養液
の濃度が異なるため、培地交換はこの中空糸の内側と外
側の濃度差をなくするような拡散作用によって行なわれ
る。

したがって培地の交換には長時間を要するうえ、このま
までは培地の交換効率もわるく、培地の交換効率を上げ
るためには培地の撹拌手段を設ける必要がある。撹拌手
段を設けて培地を撹拌すると、培地の交換効率が向上す
るだけでなく、培地を一定の状態に維持しやすくなり、
細胞を培養しやすくなる。なお強く撹拌するばあいには
、中空糸束装置として、たとえば空隙のある枠体を有す
るような装置を用いるのが好ましい。

前記枠体は、撹拌により破断などのトラブルが生じやす
い中空糸を保護するためのものであるから、なるべく培
地などの通過がおこりやすいものであるのが好ましく、
このような目的を達成しうるちのであるかぎり、形状、
大きさなどにはとくに限定はない。それゆえ、枠体に存
在する空隙の形状も、たとえば巾広く、長いストリップ
状の空隙であってもよく、スリット状、格子状、円形〜
楕円形などの空隙であってもよい。また空隙率としては
中空糸束（１）を支持しうる限りなるべく大きい方が好
ましい。

第２図、第３図には培養中の培地の状態をモニターする
手段などは記載されていないが、随時モニターしながら
培養しうることは当然のことである。

本発明の方法により培養される細胞の代表例としては、
たとえばリンパ球、骨髄細胞、マクロファージなどが、
その際に使用される細胞活性化物質としては、たとえば
リンホカインやインターフェロンなどが、さらに培地と
しては、たとえば牛胎児血清培地、無血清培地、ヒト血
清培地などがあけられる。

前記説明においては主として培養細胞をうるばあいを念
頭において説明したが、産生物の回収を目的とするばあ
いには産生物を透過させない中空糸を使用する必要があ
る。

そして産生物の具体例としては、たとえばイムノグロブ
リン間１フィブリノーゲン、アルブミン、リンホカイン
、インシュリン、インターフェロン、ウロキナーゼ、成
長ホルモン、モノクローナル抗体などの生理活性物質な
どがあげられる。

つぎに本発明の方法を実施例に基づき説明する。

実施例１ 第２図に示す装置とほぼ同様の装置を用いた。

第２図における培地容器０２＋は硬質ガラス製で容量３
８００ｍｌ、直径約１５０ｍｍＸ高さ約１９０　ａｍの
円筒状容器、培地取出装置（８）は親水化されたセルロ
ーストリアセテート製の平均ポアサイズ０．１」の中空
糸３００本を束ねて有効長が１２０■■になるようにボ
ッティングしたもの（全表面積２５０Ｃシ）でそれぞれ
液通路を有するキャップが被冠されている。そして培地
容器Ｏｚを外部から遮断する蓋体に、培地取出装置（８
）、培地供給装置０および０．２Ｊ、ＩＭのエアフィル
ター旧を有するガス抜き手段０４）が配置された装置で
ある。なお図示していないが、エアフィルター（０，２
，ｃａ）を介してエアポンプからＣＯ２を５容量％含有
する空気を１０ｍ１／ｍ１ｎの流量で供給し、ガス抜き
手段０４）から排気した。

ガス抜き手段（＋４１の開放下、培地としてＲＰ旧−１
８４０（味の素■製）　１０００　ｍｌを供給したのち
、リンパ球１０６個／　ｍｌ　Ｘ　　１００ｍ１　、血
清１０ｍ１．リンホカイン２００単位からなる細胞浮遊
成約１１０ｍ１を培地容器側に供給した。そののち、３
７℃で培養を行なった。この間、培地供給装置にから培
地を１　ｍｌ　／　ｓｉｎの割合で供給するとともに、
１　ｍｌ／ｓｉｎの割合で培地取出装置（８）から取出
しながら２０日間培養した。

培養中、１日ごとに培地のｐＨ１炭酸ガス分圧（ＰＣＯ
２）を１１定し、７．２≦ｐＨ≦７．３．３６ｍ＋ｅＨ
ｇ≦ＰＣＯ２≦４０關Ｈｇであることを確かめた。

２０日間培養後、培養液には５　Ｘ　１０６個／　ｍｌ
の細胞が存在していた。

〔発明の効果〕

本発明の方法によると培地を交換する際に細胞を分離す
る必要がなく、クリーンベンチなどを使用しなくても無
菌的に、かつ連続的に培地交換が行なえ、長期間安定し
て培養を行なうことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法に使用される装置に用いる培地取
出装置の一例に関する説明図、第２図および第３図はそ
れぞれ本発明の方法に用いる装置の一例に関する説明図
である。 （図面の主要符号） （１）：中空糸束 （８）：培地取出装置 ａａ　：培地供給兼培地取出装置 特許出願人　　株式会社　ニラショー 第２図 第１ 第３図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　細胞培養培地の交換を行なうに際し、培地は透過す
   るが細胞は透過しない中空糸束を含んでなる培地交換装
   置を用いて行なうことを特徴とする細胞培養培地の交換
   方法。 ２　前記培地交換装置が培地取出装置として機能する請
   求項１記載の方法。 ３　前記培地交換装置が培地供給兼培地取出装置として
   機能する請求項１記載の方法。 ４　前記中空糸束が、平均ポアサイズ３０〜５０Åを有
   する再生セルロース製の中空糸、または親水化されたセ
   ルローストリアセテート、セルロースジアセテート、ポ
   リエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアミ
   ド、ポリテトラフルオロエチレンもしくはポリスルホン
   製の中空糸を束ねたものである請求項１記載の方法。