JPH0253767A - ジヒドロカフェイン酸アミド化合物およびそれを有効成分として含有する治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【産業上の利用分野〕 本発明は、ジしドロカフェイン酸アミド誘導体およびそ
の医薬品への利用に関する。さらに詳しくは、脳内特定
組織での神経成長因子（Ｎｅｒνｅ　ｇｒ−ｏｗｔｈ　
ｆａｃｔｏｒ、以下ＮＧＦと略す）の産生・分泌誘発作
用を有するジしドロカフェイン酸アミド誘導体およびそ
れを有効成分として含有する中枢性神経退行性疾患の進
行防止および治療剤に関する。

〔従来の技術〕

世界的に平均寿命の延長に伴い、各種老人病の早′ｕＩ
ｈ断、原因治療の確立のための研究は急速に進展してい
る。中枢性の神経退行性疾患もその主要な研究対象であ
る。特に、その典型疾患であるアルツハイマー型老年性
痴呆症（Ｓｅｎｉｌｅ　Ｄｅ＋ｍｅｒ＋ｔｉａｏｆ　Ａ
ｌｚｈｅｉｍｅｒ　Ｔｙｐｅ＋以下５ＤＡＴと略す）は
先進諸国、を中心に増加の傾向が著しいこと、進行性の
悲惨な経過を辿ることから大きな社会問題となりつつあ
る。とりわけ近年、本病態に関し多くの研究者、臨床家
が挑戦しているにもかかわらず、根本的な病因解明はも
とより、実効的な早期診断法および治療法は未だ確立し
ていない。

しかしながら、５ＤＡＴの特徴的早期症状である記銘力
の低下や失見当識の直接原因が、大脳基底部から記憶・
学習中枢である大脳皮質や海馬へ投射する大細胞性コリ
ン作動性神経束の進行性の変性と、それによる該支配領
域の機能不全であることを示す病理学的所見は多数蓄積
されている。また実際、脳内コリン作動系の賦活治療と
して、アセチルコリン生合成前駆体ないしコリンエステ
ラーゼ阻害剤が５ＤＡＴ患者に投与され、若干の症状改
善例も報告されているが、全般的には、期待されたほど
の効果は認められていない。

ＮＧＦは、Ｒ，Ｌｅｖｉ−ＭｏｎｔｅｒｌｃｉｎｉやＳ
、Ｃｏｈｅｎ等によって発見されて以来、数多くの研究
の対象となり、すでに抹梢神経系とくに胎生期の知覚お
よび交感神経細胞の分化と成長、さらに成Ｐ期の交感神
経細胞の生存と機能保持に必須の因子であることが生理
学的実験によって証明されている。

しかしながら、ＮＧＦは超微量生理活性物質であり、長
年の研究にもかかわらず、生体内での作用を直接裏付け
る組織内分布と動態についての正値な成績は得られなか
った。ごく最近、ＮＧＦの活性サブユニット（β−ＮＧ
Ｆ　’＋以下単にＮＧＦと言う）に対する高感度酵素抗
体測定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ＬｉｎｋｅｄＩｍｏ＋ｕｎｏ
ｓｏｒｂ、ｅｎｔ　Ａｓ５ａｙ、以下ＥＬＩＳＡ）の開
発、改良が進み、上記の検討に耐えうる検出感度と特異
性とが確保されるにいたった（Ｓ、Ｆｕｒｕｋａｗａら
：Ｊ、ＮｅｕｒｏｃｈｅＭ、４０．７３４−７４４．１
９８３およびＳ、ＫｏｒＳｈｉｎｇとＨ２Ｔｈｏｅｎｅ
ｎ：Ｉ’ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ
　８０３５１３−３５１６１９８３）　。

また、ＮＧＦの遺伝子がクローニングされ、構造解析さ
れて、β−ＮＧＦの相補的ＤＮへ（ｃＤＮＡと略す）を
プローブとして、そのメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮ
Ａと略す）を定量する方法も確立された（Ｄ、　Ｌ、５
ｈｅｌ　ｔｏｎとり、Ｆ、Ｒｅ１ｃｈａｒｄｔ：Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　ｊｌｌ。

７９５１−７９５５．１９８４およびＲ，ｔｌｅｕｍａ
ｎｎ　ら：ＥＭＢＯＪ、３゜３１８３−３１８９．１９
８４）　。

これらの技法を用いて、まず、抹梢神経系で交感神経支
配の度合いと支配組織におけるＮＧＦの遺伝子発現との
間に正の相関が成り立つことが実証された。

さらに驚くべきことに、ラットの中枢、とりわけ、海馬
、新皮質、嗅球および前脳基底部の中隔野、ブロー力対
角帯、大細胞性基底核にもＮＧＦが検出され、しかもそ
のｍＲＮＡ含量は海馬、新皮質に高く、基底部の中隔野
ではＮＧＦの検出されない脳の他の領域程度に低いこと
が判明した（Ｓ、Ｋｏｒｓｈｉｎｇら：ＥＭＢＯＪ、４
．１３８９−１３９３．１９８５）　、本成績は、その
後他の研究グループによっても次々に追試された（Ｄ、
Ｌ、５ｈｅｌｔｏｎとり、Ｆ、Ｒｅ１ｃｈａｒｄｔ：Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ　８３．
２７１４−２７１８．１９８６およびＳ、Ｗｈｉｔｔｅ
−ｍｏｒｅ　ら：Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｉ、ｔｌＳＡ　狼、８１７−１３２Ｌ１９８６）や この事実ばＮＧＦが抹梢神経系のみならず、中枢神経系
においても遺伝子発現されていること、しかも大脳基底
部の起始核から記憶・学習の中枢である新皮質、海馬へ
投射しているコリン作動性神経束の支配領域で産生・分
泌されて、神経終末よりとりこまれ、逆軸策輸送によっ
て起始核の細胞本体に到ることを示している。ＮＧＦが
木コリン作動性神経の生存と、機能維持に必須の因子で
あることはすでに一連の生理学的実験により証明されて
おり、したがって、この成績によって中枢神経系でもＮ
ＧＦが「神経栄養因子」の一つとして特異的にＳ能して
いることが証明されたことになる。

その後、この成績はい（つかの研究グループによっても
追試され、また脳におけるＮＧＦ　レセプターおよび分
布に関する研究からも舅付けられた。

本発明者らは、ＮＧＦの中枢神経系での神経栄養因子と
しての機能を研究して行く中で、５ＤＡＴの早期症状で
ある記憶・学習障害の直接原因がコリン作動神経束の進
行性の変性とそれによっておこる支配領域の機能性不全
にあるとしても、該神経支配領域におりるＮＧＦの産生
・分泌不全こそがより根本的な病因たり得るとの見地に
立つに至った。

すなわぢ、従来の５ＤＡＴに対する対症療法、例えば、
アセチルコリンの補充療法やａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ
の向上療法では顕著な改善は得られず、大脳皮質および
海馬でのＮＧＦの産生・分泌を確保して、支配神経との
間で成立している機能上の悪循環を断つことが可能であ
れば、はるかに効果的であると考えるものである。

尚、既に遺伝子のクローニングによってヒト型のβ−Ｎ
ＧＦの大量調製への道は拓かれたとは言うものの、分子
１１０，０００を越える蛋白質であるＮＧＦ自身の補充
療法によっては、薬理学および薬剤掌上の制約が大きい
。とくに中枢神経系の適用に関しては現時点では開発の
目途は立っていない。

以上の様な観点から、ＮＧＦの実質的、かつ効果的補充
療法として、ＮＧＦの特定組織における産生・分泌能を
誘発する能力を有する低分子化合物の探索は重要な意味
を持つ、我々は既に本作用を存するカテコール誘導体に
ついて報告した（池田：特開昭６３−８３０２０．特願
昭６３−６３５１６等）。さらに古川等の報告もある（
Ｙ、　Ｆｕｒｕｋａｗａ等：　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ
。

２６１　、６０３９　（１９８６）およびＦＥＢＳ　Ｌ
ｅｔｔｅｒｓ　２０８２５８（１９８６））　　。

【発明が解決しようとする課題〕

本発明の課題は、ＮＧＦの実質的、かつ効果的補充療法
として、ＮＧＦの特定組織における産生・分泌能を誘発
する能力のある医薬品を提供することである。すなわち
、特定神経に対して「神経栄養因子」として機能してい
るＮＧＦの該神経支配組織の産生・分泌促進活性をもつ
化合物それ自身ないし薬理学および薬剤学的配慮に基づ
くその修飾化合物は、通常の投与方法によって神経変性
局部へのＮＧＦの供給量を増大させ、該神経機能を回復
させることを可能にすると期待される。特に、いまだに
根本的治療法の確立されていない中枢性疾患である５Ｄ
ＡＴに対して、これらの化合物の利用は理想的である。

発症早期であれば、これらは法相投与によって中枢神経
系の大脳皮質や海馬領域のＮＧＦの産生・分泌能を高め
て、支配神経たるコリン作動性神経系の特徴的変性の進
行を防止し、損傷神経細胞の修復ないし残存神経細胞に
よる再支配を促して、脳機能の可塑性に依拠した新しい
作用概念に基づく画期的な治療法を提供しうるちのであ
る。

〔課題を解決するための手段］ 本発明者らは、ＮＧＦの特定組織における産生・分泌能
を誘発する能力を有する低分子化合物を探索してきた。

その結果、特定のジヒドロカフェイン酸アミド誘導体が
ＮＧＦ産生・分泌能誘発作用を有し、中枢性神経退行性
疾患の進行防止および治療に有効であることを見出し本
発明を完成した。

すなわち、本発明は一般式（１） 枢性神経退行性疾患の進行防止および治療剤である。

本発明の一般式（１）で表わされるジヒドロカフェイン
酸アミド誘導体において、アルキル基はメチル基、エチ
ル基、プロピル基、ブチル基を示し、アリル基はフェニ
ル基、ナフチル基等を示し、置換アリル基はベンジル基
、フェネチル基、ジフェニルメチル基等を示し、アルコ
キシカルボニル基は、メトキシカルボニル基、エトキシ
カルボニル基等を示す。

さらに具体的に示せば、−数式（１）における下記の部
分構造である一般式（ｎ） （式中、Ｒ６は水素原子またはアセチル基を、Ｘは無置
換、メチレン基、酸素原子または窒素原子を、Ｒ２は水
素原子、アルキル基、アリル基、置換アリル基、または
アルコキシカルボニル基を示す、）で表わされるジヒド
ロカフェイン酸アミド誘導体およびそれを有効成分とし
て含有する中で表わされる置換基としては、ピペリジノ
基、モルホリノ基、ピペラジノ基、ピロリジ／Ｌ−４−
メチルピペラジノ基、４−ベンジルピペラジノ基、４−
ジフェニルメタンピペラジノ基、プロリル・基、ニベコ
チニル基、イソニペコチニル基等カ好ましい。

次に本発明化合物の製造方法について述べる。

第１の方法は、入手容易なジヒドロカフェイン酸エチル
エステルと相当するアミン類を熱的に縮合させる方法で
ある。ここに熱的とは、室温から場合によっては２００
°Ｃまでの範囲で加熱することをいう、この場合、多く
は無溶媒で反応は進行するが、場合によっては過剰の相
当するアミン類、またはトルエン、キシレン等の不活性
溶媒を用いても良い。

第２の方法は入手容易なジヒドロカフェイン酸を無水酢
酸または塩化アセチルを用い通常の方法でジアセチル体
とした後、塩化チオニルで相当する酸塩化物とし、これ
と相当するアミン類を塩基の存在下で反応させる方法で
ある。この場合、塩基とは、ピリジン、トリエチルアミ
ン等の有機塩基、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等
の無機塩基、または過剰量の相当するアミン類である０
反応温度はＯ′Ｃ〜５０°Ｃの範囲が好ましく、溶媒と
しては上記有機塩基、水、クロロホルム、ＴＨＦ　、ベ
ンゼン等の有機溶媒が好ましい。

次に本発明化合物の中枢性神経退行性疾患の進行防止お
よび治療剤としての有効性は、以下の試験によって６育
認した。

すなわち、古川（Ｙ、Ｆｕｒｕｋａｗａ　ｅｔ　ａｌ：
Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、　」旦、６０３９（１９８６）により報告さ
れている、マウス線維芽細胞樹立株、し−門細胞（ＡＴ
ＣＣ，ＣＣＬＴ。

２）を用い、培地中に一般式（１）の化合物を共存させ
ることにより、産生・分泌されるＮＧＦ　４度を高感度
ＥＬＩＳＡ法によって測定する方法を用いた。

さらに、中枢組織での主要なＮＧＦ産生・分泌細胞と考
えられるアストロダリア細胞を用いた系においても、そ
のＮＧＦ　１度を測定した。これらの試験により一般式
（１）の化合物は非常に強いＮＧＦ産生・分泌促進能を
有することが見出された。よって本発明化合物が中枢性
神経退行性疾患、とりわけ５ＤＡＴに対し有効な進行防
止および治療剤と成り得る可能性を確認した。

°また、本発明の化合物を中枢性神経退行性疾患の進行
防止および治療剤として使用する場合、その投与量、剤
形は化合物の物性、投与対象の症状等により当然異なる
が、経口的に投与する場合、成人１日当たり５０〜５０
０■を１回または数回に分割し、錠剤、顆粒剤、散剤、
懸濁剤、カプセル剤等として、また非経口的に投与する
場合、１〜１００■を１回または数回に分割し、例えば
注射剤、座剤、輸液用等張液剤として投与できる。

例えば錠剤とする場合、吸着剤としては結晶性セルロー
ス、軽質無水ケイ酸等を用い、賦形剤としてはトウモロ
コシデンプン、乳糖、燐酸カルシウム、ステアリン酸マ
グネシウム等が用いられる。また注射剤とする場合、化
合物の水溶液または綿実油、トウモロコシ油、ラッカセ
イ油、オリーブ油等を用いた懸濁性水溶液、さらにはＨ
ＣＯ−６０等の界面活性化剤等を用いた乳濁液として使
用される。

〔実施例〕

以下、実施例により本発明を具体的に説明する、ただし
本発明はこれらの例に限定されるものではない。

実施例Ｉ Ｎ−（３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）プロピオ
ニル］ピペリジン（化合物ＮＯ，１）３．４−ジヒドロ
キシフェニルプロピオン酸エチルエステル４．２ｇとピ
ペリジン２．６　ｇ　トラｒＲ合し、オートクレーブ中
１５０°Ｃで４時間、加熱撹拌した。冷却後、濃縮し残
金をシリカゲルカラムクロマトにより精製する。

クロロホルム：メタノール−１０−１で流出し、相当す
る画分を濃縮し、残金をヘキサン−エーテルの混合溶媒
で結晶化させ濾取すると純粋なＮ−（３−（３，４−ジ
ヒドロキシフェニル）プロピオニルコピペリジンが無色
結晶として４，３ｇ得られた。

ｌｌ１ｐ　　１１４〜１１５°Ｃ ＮＭＲ６ｐｐ信（ＤＭＳＯ−ｄｉ）　：１．２〜１．６
（ｂｒ、６Ｈ）、２．３〜２．７　（ｍ、　４Ｈ）、３
．２〜３．５（ｍ、４Ｈ）、６．２５〜６．５５（ｍ、
３Ｂ）、８．５（ｂｒ、２Ｈ） 実施例２ Ｎ−（３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）プロピオ
ニル〕ピロリジン（化合物Ｎ０８２）３．４−ジヒドロ
キシフェニルプロピオン酸エチルエステルとピロリジン
を用いて実施例１と同様な処理を行う事により、Ｎ〜［
３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）プロピオニル〕
ピロリジンを得た。

ｍｐ、　１７２〜１７３°Ｃ ＮＭＲδｐｐｍ　（ＤＭＳＯ−ｄＪ： １．５（１〜２．００（ｍ、４Ｈ）、２．２０〜２．８
０（ｍ、４Ｈ）、３．１（１−３，４０（ｍ、４Ｈ）、
６．３０〜６．７０（ｍ、３Ｈ）、８、５０　（ｂｒ、
　ＩＨ） 実施例３ Ｎ−（３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）プロピオ
ニル３モルホリン（化合物Ｎｏ、　ｓ　）３．４−ジヒ
ドロキシフェニルプロピオン酸エチルエステルとモルホ
リンを用い、実施例１と同様な処理を行なう事によりＮ
−Ｃ３−（３，４ジヒドロキシフエニル）プロピオニル
３モルホリンを得た。

ｍｐ　　２１１〜２１３°Ｃ ＮＭＲδｐｐｍ　　（ＤＭＳＯ−ｄ、）：２．４〜２．
７（ｍ、４Ｈ）　　、３．２〜３．６（ｍ、８Ｈ）　　
、６．２５〜６．６０（ｍ、３Ｈ）、８．４０（ｓ、Ｌ
Ｈ）、８．４８（ｓ、ＩＨ） 実施例４ Ｎ−メチル−Ｎ’　−（３−（３，４−ジヒドロキシフ
ェニル）プロピオニルコピペラジン（化合物ＮＯ，４） ３．４−ジヒドロキシフェニルプロピオン酸エチルエス
テルとＮ−メチルビペラジンを用いて実施例１と同様な
処理を行なう事によりＮ−メチル−Ｎ’　−（３−（３
，４−ジヒドロキシフェニル）プロピオニルコピペラジ
ンを得た。

ｍｐ、　１９０〜１９３’Ｃ ＮＭＲδｐｐｍ　（ＤＭＳＯ−ｄＪ： ２．００〜２．４０（ｍ、　７Ｈ）、２．４０〜２．８
０（ｍ、３Ｈ）、３．２０〜３．６０（ｍ、５Ｈ）、６
．４０〜６．７０（ｍ、３Ｈ）、８．６０（ｂｒ、２Ｈ
） 実施例５ Ｎ−ベンジル−Ｎ　　−［３−（３，４−ジヒドロキシ
フェニル）プロピオニルコピペラジン（化合物Ｎ０．５
） ３．４−ジヒドロキシフェニルプロピオン酸エチルエス
テルとＮ−ベンジルピペラジンを用いて実施例１と同様
な処理を行なう事によりＮ−ベンジル−Ｎ’　−Ｃ３−
（３，４−ジヒドロキシフェニル）プロピオニルコピペ
ラジンを得た。

ｍｐ、　１７８〜１８０°Ｃ Ｎ？ＩＲδｐｐｍ　（ＤＭＳＯ−ｄ６）：２．２０〜２
．４０（ｍ、４Ｈ）、２．４０〜２．７０（＋ｎ、４Ｈ
）、３．２０−３．６０（ｍ、６Ｂ）、６．３０〜６．
８０（ＩＩ＋、３）１）、７．２０〜７．５６（ｍ、４
Ｈ）、８．５６（ｓ、２Ｈ）実施例６ Ｎ−ジフェニルメチル−Ｎ’　−（３−（３，４−ジヒ
ドロキシフェニル）プロピオニルコピペラジン（化合物
Ｎ０．６） ３．４−ジヒドロキシフェニルプロピオン酸エチルエス
テルとＮ−ジフェニルメチルピペラジンを用いて実施例
１と同様な処理を行なう事によりＮ−ジフェニルメチル
−Ｎ’　−［３−（３，４ジヒドロキジフエニル）プロ
ピオニルコピペラジンを得た。

ｍｐ、　１６３〜１６４°Ｃ ＮＭＩ？　δｐｐｍ　（ＣＤＣｌ２）：２、ＯＯ〜３．
ＯＯ（ｍ、８Ｂ）、３．１０〜３．７０（ｍ、４Ｈ）、
４．１２（ｓ、　ＩＨ）、６．００〜７．６０（ｍ、　
１３）１）実施例７ Ｎ−（３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）プロピオ
ニル）−Ｌ−プロリンメチルエステル（化合物ＮＯ，７
） １）３．４−ジアセチルフェニルプロピオン酸２ｇをク
ロロホルム１０Ｉｄに溶解し、塩化チオニル８．９ｇを
加えた。５０°Ｃで２時間加熱攪拌した後、減圧上溶媒
を留去すると、残金として粗３，４−ジアセチルフェニ
ルプロピオン酸クロライドが２．１ｇ得られた。これ以
上精製する事なく以下の反応に供した。

２）　Ｌ−プロリンメチルエステル塩酸塩１．４９ｇを
クロロホルム１５ｄに懸濁させ、トリエチルアミン３ｇ
を加えた。水冷下、１）で調整した酸クロライドの７ａ
ｆクロロホルム溶液を滴下した。室温で一夜放置した後
、５０”Ｃで１時間加熱攪拌した。冷却後反応液を氷水
１０ｄに注ぎ、クロロホルム層は１規定塩酸２５ｄで２
回、食塩水２５ｍ２で１回洗浄した、無水芒硝で乾燥し
た後、４縮し、残金をシリカゲルカラムクロマトで精製
した。クロロホルム：メタノール５０：１で流出させる
と、無色油状物としてＮ−（３−（３，４−ジヒドロキ
シフェニル）プロピオニル〕−Ｌ−プロリンメチルエス
テルが１．２５ｇ得られた。

ＮＭＲ６ｐＩ＋ｌ　（ＣＤＣＩ　ｘ）　：１．６０〜２
．４０（ｍ、４Ｈ）、２．１２（ｓ、３Ｈ）、２．３０
（ｓ、３Ｈ）、２．４０〜３．１０（ｍ、４Ｈ）、３．
７２（ｓ、３Ｈ）、３．２０〜３．９０（ｍ、２Ｈ）、
４．３２〜４．５０（ｍ、　ＩＨ）、６．６０〜７．２
０（ｍ、３Ｈ）３）Ｎ−Ｃ３−（３，４−ジアセトキシ
フェニル）プロピオニル）−Ｌ−プロリンメチルエステ
ル１．０ｇをメタノール５ｄに溶解させ、水冷下５％ア
ンモニア水１０Ｉｎｌを加え、１時間攪拌した。水冷下
６規定塩酸で反応液を弱酸性にし、た後、クロロホルム
で２回抽出した。無水芒硝で乾燥した後、溶媒を留去す
ると、無色油状物としてＮ−（３（３，４−ジアセトキ
シフェニル）プロピオニル）−Ｌ−プロリンメチルエス
テルが０．７ｇ得られた。

ＮＭＲ６ｐｐ謡　（ＣＤＣＬ、）： １．６０〜２．３０（ａ＋、４＋１）、２．３０〜３．
００（ｍ、４Ｈ）、３、ＯＯ〜３．６０（ｍ　２１１）
、３．６４（ｓ、３Ｂ）、４．４０〜４．６０（ｍ、　
ＬＨ）、６．４０〜６．８０（ｍ、３１１）、６．９０
（ｂｒ、ＩＨ）　、７．６０（ｂｒ、ＩＨ）実施例８ Ｎ−（３−（３，４−ジヒドロキジフェニル）プロピオ
ニル］−二ベコチン酸エチルエステル（化合物ＮＯ，８
） 実施例７におけるし一プロリンメチルエステル塩酸塩を
、ニベコチン酸エチルエステル塩酸塩に変えて、実施例
７と同様な処理を行う事により無色油状物としてＮ−［
３−（３，４−ジヒドロキンフェニル）プロピオニル〕
−ニペコチン酸エチルエステルを得た。

ＮＭＲδｐｐ準（ＣＤＣＩ　：ｌ）　：１．２０〜１．
４８（講、３Ｈ）、１．４６〜２．４０（＋ｏ、５Ｈ）
、２．４０〜３．５４（ｍ、６）１）、３．５４〜４．
６８（ｍ、４Ｈ）、６．５０−７．２０（ｍ、４ｆｌ）
、７．６６（ｂｒ、　１１（）実施例９ く急性毒性〉 ５週齢のｄｄＹ系の別姓マウス１群１匹使用し、試験化
合物（化合物ＮＯ，ｌ〜Ｆ３　）は０．５％Ｔｗｅｅｎ
８０に懸濁して実験に供した。試験化合物を腹膣内に投
与し、１日及び４日後の死亡数を測定し、ＬＤ、６（Ｉ
Ｉを算出した。

いずれの化合物もＬＤ、。値は１０００■／ｋｇ以上で
あり、急性毒性は非常に弱かった。

実施例１０ くマウスＬ−Ｍ細胞に対するＮＧＦ産生・分泌促進作用
〉 古川らの方法（Ｙ、Ｆｕｒｕｋａｗａ　ら：Ｊ、Ｂｉｏ
ｌ、Ｃｈｅ町ｌ■６０３９−６０４７．１９８６）に従
った。

すなわち、０．５％ベプト°ン添加１９９培地（Ｇｉｂ
ｃ。

社製）にてＬ−Ｍ細胞を前培養し、２４孔培ｌブレト（
Ｆａｌｃｏｎ社製、培養孔あたりの培養面積２．１１）
に約３ＸＩＯ’個／培養孔の細胞をまき、３日間３７°
Ｃにて培養して完全コンフルエント（約１０６細胞／培
養孔）とする。培地を０．５％生血清アルフミン（第五
両分、Ａｒｍｏｕｒ社製）添加１９９培地（０，５ｄ／
培養孔）に交換する。被検化合物は本培地中に所定の濃
度で含有させ、２４時間後の培養培地中のＮＧＦ濃度を
高感度ＥＬＩＳＡ法（Ｓ、Ｆｕｒｕｋａｗａ　ら：Ｊ。

Ｎｅｕｒｏｃｈｅｒｎ、４０．７３４−７４４．１９８
３）によって測定する。

結果は被検化合物を含まない培地にて培養した対象の培
養培地中の濃度に対する倍率として求めた０本ＥＬＩＳ
Ａ法の検出限界は０．２５ｐｇ＃ｔｌ！であり、対照の
ＮＧＩ’　ｉＪ度は、通常５０−５０−２００ｐ、５ｄ
／培養孔である。値は同一細胞標品を用いた４回の試行
の平均値として示しである。

結果を表１に示す。

実施例１１ くマウス脳アストロダリア細胞に対するＮＧＦ産生・分
泌促進作用〉 アストログリア細胞はマウス前脳から誘導し、培養系に
移した（Ｓ、Ｆｕｒｕｋａｗａ　ら：Ｂｉｏｃｈｅｍ、
Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｎ＋ｎｕｎ、　」甚、５
７−６３．１９８６）。

すなわち、生後８日目のマウス脳を細切し、カルシウム
、マグネシウム不合リン酸緩衝生理食塩水（以下ＰＢＳ
）で洗浄後、０．２５％トリプシン含有ＰＢＳ中で３７
°Ｃ１３０分間処理し、パスツール・ピペットで組織を
ほぐして懸濁液とする。２００Ｘｇで５分間遠心して細
胞および細胞凝集体を回収する。

これをｌＯ％牛脂児血清、５Ｘ１０−’ユニッ１４（７
）ペニシリン、５μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含
有するダルベツコ変性イーグル培地（以下ＤＭＥＭ培地
、Ｇ　ｉ　ｂｃｏ社製）に移し、３日毎に同培地を変換
しながら、１０〜１４日間初代培養する。コンフルエン
トに達したら、トリプシン処理して別の培養器に分配し
て植え継ぐ。さらに２回以上植え継いで形態的に均一な
細胞集団とする０本実験に用いるのは、抗ヒトダリア線
維タンパクｔ　（ＧＦＡＰ）ウサギ抗血清を用いたＰＡ
Ｐ染色法（パーオキシダーゼ抗パーオキシダーゼ染色法
）で、９７％以上が染色される細胞集団であり、これを
以下アストロダリア細胞と呼ぶ。

アストロダリア細胞を２４孔培養プレート（Ｆａｌｃｏ
ｎ社製、培養孔あたりの培養面積２．１ａａ　）に約３
×１０４個／培養孔まき、１０％牛脂児血清含有ＤＭＥ
Ｍ培地にて３日間培養し完全コンフルエント（約１０７
細胞／培養孔）とする、培地を０．５％牛血清アルブミ
ン（第五両分）含有ＤＭＥＭ培地に交換（０，５！ｎ１
／培養孔）して３日間培養する。さらに３日間毎培地交
換して細胞を培養静止期（ｑｕｉｓｃｅｎｔ　ｓｔａｇ
ｅ）に誘導する。被検化合物を所定の濃度で含む０．５
ｍｌ！の同培地に交換し、２４時間後の培養培地中のＮ
ＧＦ　ｉｌ１度を前述の高感度ＥＬＩＳＡ法によって測
定する。結果は被検化合物を含まない培地で培養した対
照の培養培地中の濃度に対する倍率として求めた６本Ｅ
ＬＩＳＡの検出限界は０．２５ｐｇ／ｒｄｌであり、対
照（７）ＮＧＦ　ｉ）１度ハ通＄　１〜１０ｐｇ１０．
５ｍｔ＠養孔テアった。値は同一細胞標品を用いた４回
の試行の平均値として示しである。

結果を表１に示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一般式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中、Ｒ＿１は水素原子またはアセチル基を、Ｘは無
   置換、メチレン基、酸素原子または窒素原子を、Ｒ＿２
   は水素原子、アルキル基、アリル基、置換アリル基、ま
   たはアルコキシカルボニル基を示す。）で表わされるジ
   ヒドロカフェイン酸アミド誘導体。 ２、一般式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中、Ｒ＿１、Ｒ＿２およびＸは前記した意味を有す
   る。）で表わされるジヒドロカフェイン酸アミド誘導体
   を有効成分として含有する中枢性神経退行性疾患の進行
   防止および治療剤。