JPH02501826A - リポソームでカプセル化したヘモグロビンの拡大規模製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 リポソームでカプセル化したヘモグロビンの拡大規模製造方法 発明の分野 本発明は血液代替物質及びその製造方法に関する。

より特別には本発明は、人の患者に輸液によって血液代替物として投与すること のできる新規な組成物に関する。

発明の背景 手術や他の緊急な医学的処置を受ける患者に投与するために血液供給に対する要 求が過去約３０年来極めて急速に増大していることはよく知られており、またよ く記載されている事実である。この要求はしばしば供血者から得られる供給を超 過する。もし容易に入手できれば更により多量の血液が使用されるであろう。選 択的手術はしばしば血液不足のために延期される。器官の移植のような複雑な医 学技術がますます成功するようになってきて、より一般的になってきたので必要 な血液の量はますます増大する。種々の体外的技術は多量の血液を必要とするが 、これは殆どの場合に一時的に使用するためである。従って入手できる血液供給 を拡大する必要がある。この必要は、進歩した医療技術が実施されている地域に おいてのみならず、血液銀行のための費用のかかる設備が入手できないような世 界中の未開発地域においても存在する。

輸液のために全血を使用することは幾つかの公知の欠点を示す。抗原反応を防ぐ ために、受血者の血液は正確に血液型判定しなければならず、そして供血者から の相容性ある血液に適合させる必要があり、そのために過剰の貯蔵ユニットを必 要とし、且つ緊急の場合における貴重な時間の損失を招く、これはその障害を生 じた地点における救急車輛よりはむしろ病院においてしか輸血することができな い。通常、全血は赤血球のかなりの部分が浸透圧的に砕は易くなって非成育的に なってしまうまでに３週間を超えない期間にわたってのみ４℃において貯蔵する ことができる。凍結血球はグリセロールを除去するために洗浄しなければならず 、これは高経費を要して時間がかかり、そしてこのような血球も若干浸透圧的に 砕は易くなっている。輸血による疾病の感染の危険は非常に高く、最も顕著には 非Ａ／非Ｂ型肝炎、寄生虫及びエイズである。

液体のみの置換を凌駕することのできる血液代替物は世界中の研究者によって約 １５年前から活発に追求されており、そして日本においてはこの目的で、パーフ ロオロ化炭化水素が通常的に使用されつつある。酸素はこれらの化合物に非常に よく溶解するけれども大気で、多くの緊急事態の場合、中でも戦場の救急におい て適さない酸素テントを必要とする。これも他の複雑さのためにこの国において 臨床試験には不適であると宣言された。これらの欠点を除くためにヘモグロビン が示唆され、そして血液代替物として用いられた。

ヘモグロビン溶液の使用は全血の使用に較べて血液型の判定を行う必要がないと いう利点がある。従ってそのような溶液は緊急の場合に血液型判定及び血液の合 致の交錯した調査のための時間を費すことなく患者に与えることができるであろ う、血液型は遺伝子的に決定され、そしてそれは赤血球（ＲＢＣ）の表面に存在 する特殊な抗原の結果である。血球内のヘモグロビンは細胞膜または間質から一 旦分離された後は血液型を示さない、その上にヘモグロビンは全血よりも極めて 容易に貯蔵できる物質であって且つ速やかには劣化しない、貯蔵血液は比較的短 期間の後に棄却しなければならない、ヘモグロビンは血液から分離して凍結させ ることができるのでこのものは極めて長期間にわたり貯蔵することができる。こ のように全血に代えてヘモグロビン溶液を使用することは重要な利点をもたらす と考えられ、そして全血供給量の不足の問題、特に特殊な血液型の血液の供給量 の不足の問題を緩和することになろう。

しかしながらヘモグロビンは腎臓によって速やかに尿の中に排出され、そして若 干のそれによる腎臓機能障害がすでに観測されている。この高い排出速度を補償 するために頻繁に大量のヘモグロビン溶液の輸液を用いた場合には患者に先在す る腎臓病の危険をもたらすであろうと考えられる。輸液によって溶液の形で投与 されたヘモグロビンの半分が消失するまでの時間として定義される循環半量時間 は猿において１時間から１．５時間程度でしかないということが報告されている 。

従ってこれまで、ヘモグロビンの適切な酸化を許容し、ヘモグロビンの腎臓排出 を防ぎ、そしてヘモグロビンの充分な循環半量時間を確実にするような、抗原を 有しないカプセル膜材の中に、間質を含まないヘモグロビンをカプセル化させる ための幾つかの努力がなされている。このような努力における従来の主な難点は 充分な酸素運搬能力を有する大規模動物実験のための充分な生成物を作ることが できないということであった。

現在の合成赤血球の概念は最初にＴ、Ｍ、Ｓ、Ｃｈａｎｇがヘモグロビンをナイ ロン膜またはコロジオンの中にカプセル化した時、すなわち１９６４年から実際 に現われた［Ｔ。

Ｍ、Ｓ、Ｃｈａｎｇ；５ｃｉｅｎｃｅ、Ｌ４ｉＬ５２４（１９６４）］。現在、 膜として用いられた架橋されたヘモグロビン［Ｔ、Ａ、Ｄａνｉｓ、Ｊ、Ｊ。

Ａｓｈｅｒ及びＨ，Ｗ、Ｗａｌｌａｃｅ；Ａｐｐｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｔ ｅｃｈ、、１１＋１２３（１９８４）、Ｍ、Ｃ，Ｌｅｖｙ、　Ｐ、Ｒａｍｂｏｕ ｒｇ、　Ｊ、Ｌｅｖｙ及びＧ。

Ｐｏｔｒｏｎ；Ｊ、Ｐｈａｒｓ＋ａｃｅｕｔ、Ｓｃｉ、＋　：ｌ１７５９（１９ ８２）］　及びその他の重合物膜［Ｍ、　Ａｒａｋａｗａ　、、Ａ、Ｋａｔｏ及 びＴ、Ｋｏｎｄｏ：ＡＰＩ）ＩｓＢｉｏｃｈｅｅｅ、Ｂｉｏｔｅｃｈ、、１」、 １４３（１９８４）、　Ｊ、Ａ、Ｈａｙｗａｒｄ　ｓ　Ｄ。

Ｍ、Ｌｅｖｉｎｅ、　Ｌ、Ｎｅｕｆｅｌｄ　、　Ｓ、Ｒ，Ｓｉｍｏｎ　、、Ｄ、 Ｓ、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ及びＢ、Ｃｈａｐｍａｎ；　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、 月３７２６１（１９８５）及びＨｌＮｄｏｎｇ−Ｈｋｏｕｓ＋ｅＳ　Ｐ、Ｌａｂ ｒｕｄｅ、Ｊ、Ｃ，Ｈｕａ＋ｂｅｒｔ、Ｂ、Ｔｅ１ｓｓｅｉｒｅ茗びＣ，Ｖｉｇ ｎｅｒｏｎ；　Ａｎｎａｌｅｓ　、Ｐｈａｒｓａｃｅｕｔ、Ｆｒａｎｃ＋　、Ｌ ！ｌＬ＋２４７（１９８１）］　も同様に検討が進められている。これまでヘモ グロビンの酸化はこれらの方法において、すべて見込みはあるものの複雑であっ た。もう一つの方法はその小胞の膜が内部の水性液よりもむしろ酸素運搬場所と しての役目をするような態様で、グロビン蛋白質の中ではなくてリポソームの膜 の中で鉄−ポルフィリン誘導体を用いることである［Ｅ、　Ｔｓｕｃｈｉｄａｓ 　Ｈ，Ｎ１５ｈｉｄｅ　。

Ｍ、Ｙｕａｓａ及び５ｅｋｉｎｅ；ｂｕｌｌ、ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、Ｊａｐａｎ 、５Ｃ７７６（１９８４）］。

本文において参照文献として採用されるＭｉｌｌｅｒ等に与えられた米国特許第 ４．１３３．８７４号公報は脂質の中にカプセル化されたヘモグロビン小胞を記 述している。

−具体例はレシチンｅｘ　ｏｖｏ、コレステロール及びホスファチジン酸をｉｓ ：ｉｏ：ｔのモル比で含んでいる。もう一つの具体例ではレシチンｅｘ　ｏｖｏ 、コレステロール及びホスファチジルセリンを９＝７＝１の比で含んでいる。こ のＭｉｌｌｅｒ等により記述された方法は規模拡大することができていない（雑 誌Ｂｕｓｉｎｅｓｓ　Ｗｅｅｋ、■１９８５年６月号）、その上にその得られた ヘモグロビン“小胞”の大きさは０．１μから１０μにわたっていて不均一であ り、従っ゛て正しい循環を著しく妨げる。加えてこのＭｉｌｌｅｒ等の方法によ り要求される激しい攪拌や超音波エネルギーはそのカプセル化されたヘモグロビ ンに若干の損傷を与える傾向を有する。更にまた旧１１ｅｒ等の“小胞”は明確 に定義された構造を持たず且つ多重層のものである。特許出願第５０８，６９２ 号においてＧａｂｅｒ等によりリポソームの中にカプセル化されたヘモグロビン について記述された方法は均一な小胞の粒度という利点を有するけれども、しか しながら膜状のフィルタを通して連続的に押し出すことにより依存するもので、 これはフィルタ１平方インチ当り約１ｄの最終生成物を与える。得られる最大の 押出し量はこの方法で１にのリポソームのバッチを作り出すのには不適当であり 、また同様に高いカプセル化効率をもたらすには不適当である。この方法も純度 について利点を有する合成燐脂質を用いたけれどもこれは過度に高価である。

米国特許第４．４２５．３３４号のＨａｎｔ等の方法はカプセル化だけに６段階 を含み、そして規模拡大が非常に困難であることを証明している［５ｃｉｅｎｃ ｅ、　２３０．１１６５（１９８５Ｎ。

上述した三つのすべての方法は異なった燐脂質を用いているけれども、マウスに ついて測定した循環半量時間はいずれの場合にも約４ないし５時間であり、血液 代替物として望ましいものよりも著しく小さい。

発明の目的 本発明の目的の一つは大または動物の患者に投与するための血液代替物または血 液増量剤を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、ヘモグロビンに基づく、酸素運搬体でもあるような 代替物を提供することである。

本発明の別な目的の一つは、受血者の循環系の中で多くの時間にわたり循環する ことが可能であり、且つ適当な酸化特性を有するような血液代替物又は血液増量 剤を提供することである。

本発明の更にもう一つの目的は、直径が平均０．２　ミクロンのほぼ均一な大き さで、一般に単純なリピド２重膜を有し且つ滅菌可能であるような、ヘモグロビ ン内包のリポソーム小胞よりなる血液代替物または血液増量剤を提供することで ある。

本発明のなお別なもう一つの目的は、もとのヘモグロビンを改質するために化学 反応させることなく血液代替物または血液増量剤を作るための方法を提供するこ とである。

本発明の別なもう一つの目的は、滅菌生成物を少なくとも１０　ｄｌ　／　ｔｓ 　ｉ　ｎ以上生ずることのできる無菌的方法によって血液代替物または血液増量 剤を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、マウスについて測定して少な（とも１５時間以上の 半量時間を有するような血液代替物または血液増量剤を提供することである。

本発明の更に別な目的は、容易に規模拡大することのできるような大型のバッチ 式または連続式のカプセル化システムよりなる血液代替物または血液増量剤の製 造方法を提供することである。

本発明のこれらの目的およびその他の諸口的はリポソームの狭い粒度分布を生じ 且つその大きいリポソームが約０．２５ミクロンであるような、無菌的ヘモグロ ビンを少な（とも７−／＋ｓｉｎ以上の速さでリポソームの中にカプセル化する 方法によって達成される。更に、そのリポソームにカプセル化されたヘモグロビ ンは少なくとも２０容積％の酸素運搬能（充填されたリポソームについて測定し て）または大まかに最高値の赤血球のそれの半分を有し、且つマウスについて測 定して１５−２０時間の半量時間を有するものである。

この方法は大または牛の赤血球から無菌のヘモグロビンを分離し、クロロホルム の中で水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣと略記する：その近似的組成 はジステアロイルホスファチジルコリン８５％、ジパルミトイルホスファチジル コリン１５％である）、コレステロール、負に帯電したシミリストイルホスファ チジルグリセロール（ＤＭＰＧと略記する）及びα−トコフェロールを混合して ５：４：１：０．２の比率の脂質の均一溶液を形成させ、クロロホルムを蒸発除 去して脂質の均一な膜を形成させ、上記無菌のヘモグロビンをこの脂質の均一膜 に加え、３５°Ｃにおいて４５分間温和に攪拌することによって上記脂質をヘモ グロビンの全体に分散させてヘモグロビンが内部にカプセル化された多重膜のリ ポソームを形成させ、この脂質とヘモグロビンとの温和な回転攪拌を４°Ｃにお いて１０ないし１６時間、（１夜）継続してカプセル化を増大させ、このリポソ ームとヘモグロビンとを２０００ないし３０００ｐｓｉ　の圧力において滅菌さ れたマイクロフルイダイザＴ−を強制的に通過させてキャビテーション及び高い 剪断力を作り出し、それによって上記多重膜のリポソームを破壊してヘモグロビ ンの効率的取り入れと共に単一膜の大型リポソームを作り出し、このリポソーム とヘモグロビンとを上記マイクロフルイダイザを通してリポソームの均一な粒度 分布が達成されるまで再循環し、濾過によってカプセル化されなかったヘモグロ ビンを除去し、添加された塩水液による過浸透圧的ショックによってそのリポソ ームを一時的に収縮させ、そしてそのリポソームの中にカプセル化されたヘモグ ロビンを０．２２ミクロンの滅菌フィルタを通して圧力濾過することにより滅菌 することよりなる。

図面の簡単な説明 本発明並びにそれに伴う多くの利点のより完全な評価は以下にあげる詳細な説明 を添付の図面の参照のもとによりよく理解した時に容易に得られるであろう。

第１図はＨ３ＰＣの主成分であるジステアロイルホスファチジルコリンの分子構 造の図式図である。

第２図はホスホリピドミセルの断面の図式図である。

第３図はホスホリピドの２重層の断面の図式図である。

第４図は小型球系リポソームの断面の図式図である。

第５図はその水性組成物が５０％以上であるような大型の単一膜小胞の断面の図 式図である。

第６図は多重膜小胞の断面の図式図である。

第７図はＬＥＨの半分が循環から消失するのに要する時間、ＴＩ／□のグラフで あり、ホスホリピドの依存性を示す。

第８図はリポソームの中にカプセル化されたヘモグロビンの有機燐酸エステルの 不存在のもとでの酸素化の測定のグラフである。

第９図はヘモグロビンの５０％酸素化に要する酸素分圧Ｐ、。（ヘモグロビンの 酸素親和性の標準指標）のホスフェート及び時間に対する依存性を示すグラフで ある。

ピリドキサルー５−ホスフェート（Ｐ５Ｐ）はヘモグロビンと一緒にリポソーム の中にカプセル化された時にそのＰ、。の値を維持するが、一方２，３−ジホス ホグリセレート（ＤＰＧ）　はこれを維持しない。

第１０図は赤血球及びヘモグロビンをカプセル化したリポソームのそれぞれの走 査電子顕微鏡写真である。

第１１図は充填された小胞の容積と内部のヘモグロビンの濃度との過浸透圧性塩 水の添加後の時間の関数としてのグラフである。リポソームは急速に収縮し、そ して再び膨張する前に圧力のもとに無菌的に濾過することができる。これらの最 終イオン濃度は血管内の注液に適している。

好ましい具体例の記述 種々の研究者によってヘモグロビンをカプセル化するために成功裏に用いられた 脂質の組成はすべて非常に類似しており、近似的に当量のコレステロール及びホ スファチジルコリンに例えばホスファチジン酸、ジセチルホスフエートまたはシ ミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）のような負に荷電したリ ピドの５ないし１０％を含む、以下に記述する理由によって、例えばジョーシア 州アトランタのＡａ＋ｅｒｉｃａｎ　ＬｅｃｉｔｈｉｎＣｏ、から得ることので きる水素化された大豆ホスファチジルコリン（）ＩＳＰＣ）と、コレステロール と、例えばアラバマ州バーミンガムのＡｖａｎｔｉ　Ｐｏ１ａｒ　Ｌｉｐｉｄｓ から入手できるＤＭＰＧと、及びα−トコフェロールとの５：４：１：０．２の モル比の混合物をこ−に記述する調合物において用いるが、しかしながらＨＳＰ Ｃに変えて合成したジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）を用いる ことも同様な結果を与える。

この脂質のクロロホルム中に溶液を乾燥させて均一なフィルムを形成させ、そし て緩衝したヘモグロビン溶液（ｐＨ＝　７．４）により水和させる。

このカプセル化の方法はＦ、０１ｓｏｎ　、　Ｃ，Ａ、Ｈｕｎｔ、　Ｆ、Ｃ。

Ａｃｔａ、　■Ｌ９（１９７９）の方法から導かれたもので、これ（１９８６） 印刷中］　の中に詳細に記述されている。ａ略を述べるならば、リピドの水和か ら生ずるリビド／水性多重膜小胞（ＭＬＶ）の分散液を次第に孔径の小さくなる 幾つかの微細孔（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ）を通して低圧で押し出す（５０−９０／ ｐｓｉ）　、これが上記ＭＬνの挾み込みと剪断とをもたらし、そして大型の単 −腹小胞（ＬＵＶ）を形成する。この非常に効果的な方法は界面活性剤も、溶剤 も、またはソニケーションも含まないが、これらはすべてヘモグロビンの変質を もたらす傾向をもたらす［Ｂ、Ｐ、Ｇａｂｅｒ。

Ｐ、Ｙａｇｅｒ　、　Ｊ、Ｐ、５ｈｅｒｉｄａｎ及びＥ、Ｌ、Ｃｈａｎｇ；ＦＥ ＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ。

■Ｌ２８５（１９８３，）］、　Ｌかしながらその表面積への依存性がそのバッ チの大きさを強く制限し、そしてフィルターを幾つも変えることがその無菌的製 造を不便なものにしている。この新しい方法は欠点を除けばちとの圧力押し出し 法と同じ利点を有している。マイクロフルイダイザがその分散液を２０００−４ ０００ｐｓ　ｉ　において相互反゛応室を通して押し出し、これがそれらＭＬＶ に高い剪断応力を与える。このものはＬＵＶの均一な粒度分布に達するまで再循 環される。平均粒度はリピドの組成。

押し出し圧力及びその他の変数に依存する［Ｅ、Ｍａｙｈｅｗ、Ｒ，Ｌａｚｏ％ Ｗ、Ｊ、Ｖａｉｌ、Ｊ、Ｋｉｎｇ及びＡ、Ｍ、ＧｒｅｅｎＨＢｉｏｈｅｍ、Ｂｉ ｏｐｈｙｓ。

Ａｃｔａ、　■Ｌ１６９（１９８４）参照１．マイクロフルイダイザを通して１ 時間以下の時間で処理することのできる分散液の２２が２５％の取入れ率で血液 の２単位にほぼ匹敵する最終的なリポソーム懸濁液を提供するのに充分である。

そのバッチの大きさは例えばＭ−５１０型マイクロフルイダイザのような工業的 大きさのシステムを用いることによって大きく増大させることができる。カプセ ル化されなかったヘモグロビンの大部分はリポソームから遠心分離によって分離 されそして再循環させることができる。残部はダイアフィルトレージョンにより ｐ）１７．４の冷たい３０ｄの燐酸塩緩衝液及び０．１　ミクロンのフィルタを 用いて切線方向流の濾過装置、例えばＰｅ１１ｉｃｏｒｅ（マサチューセッツ州 ベッドフォードのＭｉｌｌｉ−ｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ）または小型の実験室規模の Ｍｉｎｉｔａｎの中で除去される。大型バッチに対してはこの系において洗滌過 程の速度を改善するために数平方フィートのフィルタを使用することができる。

カプセル化されなかったヘモグロビンが２５ｇ％から約５■％に減少してしまっ た時に緩衝液をＰＨ７，４の３０ｄの燐酸ナトリウム、１１０ｄのＮａＣｉＬ及 び３１Ｒ１のＫｆｌに変えるか、または注液のために必要な時にはタレブス重炭 酸塩溶液［Ｐ、Ｊｙｎｇｅ、Ｄ、Ｊ、Ｈｅａｒｓｅ及びＭ、Ｖ、Ｂａｉｎｂｒｉ ｄｇｅ；Ｊ、Ｔｈｅｒａｃ、Ｃａｒｄｉｏｖａｓ。

Ｓｕｒｇ、、Ｊ７．６９８（１９７Ｂ））　を用いて血漿のイオン組成に合わせ る。

より特別には、リポソームの中にカプセル化されたヘモグロビンは先ず最初間質 を含まないヘモグロビンを分離することによって作られる。この得られたヘモグ ロビンは大起源のものであることができ　（この場合にはこれは日数を経た赤血 球からのものであろう）、または生起源であることができる　（この場合には新 鮮であろう）。更に、得られたヘモグロビンは無菌でなければならず、そしてリ ムルスの変形細胞溶解物試験によって近似的に発熱物質や内毒素がないものでな ければならない（発熱物質はラビットにおいて発熱を生じさせるすべてのものと 考えられる）。

こ−に記述する方法のもっとも良好なカプセル化効率を与えるようなヘモグロビ ンの初期濃度は２０−２５ｇｍ／％の間である。このヘモグロビンはｐＨ７，４ に燐酸塩で緩衝されるけれどもこの段階においては追加的な塩類は含まれない。

同様に最初に必要なものは脂質の均一膜であってこれにヘモグロビンが加えられ る。この脂質の均一膜は先ず最初ｎ５ｐｃ　：コレステロール：負に荷電したＧ ＭＰＧ　：α−トコフェロールのモル比でそれぞれ５：４：ｌ：０．２のクロロ ホルム溶液を調製することにより作られる。このＨＳＰＣ（大部分がＤＳＰＣ） 　は２重膜形成性の主成分であってこれはＤＭＰＧに比して循環におけるＴＩ／ □の上昇をもたらすものである。　ＨＳＰＣは全脂質の約５０％である。ＤＭＰ Ｇはカプセル化を改善するのに必要であって全脂質の約１０％である。全脂質の 約４０％を構成するコレステロールはリポソームを安定にする（漏出性がな（且 つ互いに融合し難いこと）のに必要である。このものはまたその膜の流動性をも 修飾し、「溶融された」ときはより流動度を低くするけれども「固体状」のとき により流動性を高くする（すなわち溶融転位温度Ｔｌ１Ｏ上と下とで）。α−ト コフェロールは全脂質の約２％を構成し、そしてこれは抗酸化剤である。もし例 えハ５００Ｉｎ１の丸底フラスコを混合に用いた場合にはクロロホルムは回転蒸 発機を用いて除去され、これによってこのフラスコの壁面に脂質の均一膜を残す 。残余のすべてのクロロホルムを除去するためにこのフラスコを次に一夜真空の もとに置＜。

この壁面上で脂質の均一層が乾燥してしまった容器に前記無菌のヘモグロビンを 加える。例えば脂質の均一膜ヲ含む５００　ｄ、の丸底フラスコに２００戚のヘ モグロビンをその脂質の分散液中濃度が１００ミリモルとなるように加えること ができる。このようにヘモグロビンを加えた容器を次に３０°Ｃと３７°Ｃとの 間（好ましくは３５゛Ｃ）においてその脂質のすべてが分散されるまで攪拌して インキュベーションする。その乾燥した脂質の層がヘモグロビン溶液によって水 和されるにつれて多重膜小胞（ＭＬＶ）が形成される　（第６図参照）。これは その個にの脂質が同一分子の上に親水性と疎水性との両方の部分が共存している ことを意味する両親和的性質によるものである。ジステアリルホスファチジルコ リンの上でそのホスファチジルコリンの頭部基は親水性であってその二つのステ アロイル鎖（炭素１８個の飽和脂肪酸）は疎水性である。ヘモグロビン溶液を脂 質の均一膜に加えた時に疎水性尾部すなわちステアロイル鎖が互いに結合し、そ して他の脂質のステアロイル鎖とペアを組んで水を排除する。ホスファチジルコ リンの頭部基は水の方へ向って配向し、ミセルを形成する（第２図）かまたは脂 質２重膜の小片（第３図）を形成する。この脂質２重膜はリポソームを形成しく 第４図）これは単一の２重膜（第５図）を有するかまたは外側に多数の２重膜ま たは積層膜を有して内側に取り込まれた水性空間を有する多重膜（第６図）を有 することができる。荷電した脂質すなわちシミリストイルホスファチジルグリセ ロール（ＤＭＰＧ）を用いることによってその採り入れられる水性液の容積の上 昇が強く助けられる。

第１ないし６図を以下において更に詳細に説明する。

加えられたヘモグロビンを含む容器が３０−３７°Ｃにおいて温和に攪拌された あとで温度を約４℃まで低下させる。水和過程は１０−１４時間（１夜）継続し てカプセル化を増進させる（引続くすべての段階は２℃と６℃との間、好ましく は４°Ｃの温度において行われることを注意すべきである）。

その得られた今やほとんどがＭＬＶよりなるリポソームでカプセル化されたヘモ グロビンと遊離の未だカプセル化されていないヘモグロビンとを含む混合物を次 にＭＬＶを破壊して大きな単一膜の小胞（ＬＵＶ）にし、同時にそれまでＭＬＶ の他の層であったものの中により多量のヘモグロビンをカプセル化させるために ２０００ｐｓ　ｉと３０００ｐｓ　ｉ　との間の圧力においてマイクロフルイダ イザを強制的に通過させる。リポソームの外側層はこのアイクロフルイダイザの 中で起る強力なエネルギーの作動によって取り除かれる。このマイクロフルイダ イザは５−７℃に維持された相互反応室を通して２０００−４０００ｐｓｉにお いてその分散液を強制的に通過させ、この過程は大きな圧力低下を包含し、そし て従って高い剪断的流れをもたらす。この液体は細い矩形に区画されたその相互 反応室のマイクロチャンネルの中で二つの高速度ジェットに分割される。この液 体の流れはそれぞれ互いに１８０”の角度で衝突するように指向され、それによ ってキャビテーションが形成され、そしてそのエネルギーはＭＬＶをＬＵＶに変 えるために変換される。

典型的なバッチのためには空気入口圧力８５ｐｓｉｇに相当して約５００ｄ／ｍ ｉｎの流量が用いられる。マイクロフルイダイザト１１０系の中の空気駆動ポン プは相互反応室のすぐ上流のところに約５０００ｐｓｉ　の圧力を作り出す。

このような条件において液体はそのマイクロチャンネルを通して呼称剪断率１０ ０．０００／ｓｅｃにおいて１０．０００ｃｍ／ｓｅｃのジェット速度で流れる 。上述のように操作することによってその得られる粒子の大きさは平均して０． ２　ミクロンである。このマイクロフルイダイザの作動の原理についてのより詳 細な情報はＣｏｏｋ等に与えられた米国特許第４，５３３，２５４号公報を参照 されたい。

この時点においてその混合物に残された問題はＬｔｌＶの外側と内側のヘモグロ ビンである。残余のカプセル化されていないヘモグロビンを除去するためにこの 混合物は例えばＰｅ１ｌｉｃｏｎ　Ｔｍ（Ｍｉｌｌｉｔｏｒｅ　Ｃｏｒｐ）型切 線方向流濾過装置を用いて０．１　ミクロンのフィルターを通過させる。　ＬＬ ＩＶの外側のヘモグロビンが除去されるときにその液体は定容積ダイアフィルト レージョンによってｐＨ７，０の燐酸塩緩衝液と置き換える。

この方法の全面を通じて無菌的技術が用いられ、そしてすべての材料は無菌のも のであるけれども、追加的安全性のために最終的な滅菌を次に実施してもよい。

これは過浸透圧的な緩衝された塩水溶液をリポソームでカプセル化されたヘモグ ロビンに添加した時に個々のリポソームに象、速な収縮が起ることによって行わ れる。次の２時間の間にそれらは例えばＰｅ１ｌｉｃｏｎ　Ｔ−装置を用いて０ ．２２ミクロンのフィルタを通過させることができるようになる　（第１１図） 、この最終的塩水溶液はイオン組成の生理学的相容性のために調節される。

第１ないし第６図を参照するならば第１図はジステアロイルホスファチジルコリ ンの化学式を示す、二つの炭化水素基すなわちアシル鎖が認められるがこれらが 疎水性尾部１２を構成し、そしてホスファチジルコリン基１６が親水性の基であ る。第２及び第３図は燐脂質ミセルの図式説明図であって燐脂質の２重膜が断面 で示されている。燐脂質分子は水の中で自然に上述したような構造を形成する。

第４図は大型の単一膜小胞（ＬｔｌＶ）の図式的な断面図であるが、これは実際 には０．５ミクロンから数１０ミクロンまでの範囲の大きさとなり得る。第５図 は小型の単一膜小胞（ＳｔｌＶ）を示すがこれは典型的には０．５　ミクロンよ りも小さい。第６図は多重膜の小胞（ＭＬν）を示すがこれは通常０．８　ミク ロンよりも大きい。脂質の幾つかの層２６がみられる。

規模拡大した方法を開発するだめの安価なホスファチジルコリンの供給源を探す 研究は卵及び大豆のレシチンの検討に導いた。卵レシチンはリポソームを形成す るための固体相から液体相への転移温度すなわち融点（Ｔｍ）の好都合な値を有 し、室温において非常に流動性が高いけれどもそのアシル鎖中の不飽和結合の酸 化と関連して比較的２、速なヘモグロビンの酸化をもたらす。強力な抗酸化剤で るα−トコフェロールの存在のもとにおいてさえゆっくりとではあるが一定の酸 化速度がみられる〔ニューヨークのＡｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、Ｉｎｃ、より１９ ８３年に出版されたＲ、Ｂ、Ｂｏｌｉｎ　、　Ｒ，Ｐ、Ｇｅｙｅｒ及びＧ、Ｊ。

Ｎｅｍｏ　＆Ｗ集のＣ，Ａ、Ｈｕｎｔ及びＲ，Ｒ，Ｂｕｒｎｅｔｔｅ著「血液代 替物質の研究における進歩」、及びＣ，Ａ、Ｈｕｎｔ、　Ｒ，Ｒ，Ｂｕｒｎｅｔ ｔｅ。

Ｒ，Ｂ、ＭａｃＧｒｅｇｏｒ　、　Ａ、Ｅ、５ｔｒｕｂｂｅ　、　Ｄ、Ｔ、Ｌａ ｕ　ＳＮ、Ｔａｙｌｏｒ及びＨｏＫａｗａｄａ；　５ｉｅｎｃｅ、　且、１１６ ５（１９８５）　参照］。

水素化された大豆レシチン（ＨＳＰＣ）の主要成分（８５％）であるジステアロ イルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）は高いＴｍ　（５５℃）を有し、従って −・モグロビンのような熱に不安定な蛋白質のカプセル化には使用できないと考 えられた。しかしながら燐脂質でのアシル鎖の長ざの関数としてのリポソーム循 環の半量時間についての古い研究においてＤＳＰＣ（炭素数１８）はコレステロ ール１：１の割合で混合した時にＤＮＰＣ（炭素数１４）よりも数倍大きな循環 半量時間を与えている［Ｊ、５ｅｎｉｏｒ及びＧ、ＧｒｅｇｏｒｉｏｄｉｓＨＬ ｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、、（１，２１２３（１９８２）］。この望ましい性 質は本発明者等にＤＳＰＣをその高いＴａ＋の値にも拘らず追跡することをもた らした。われわれはコレステロールをＤＳＰＣにドープすることがカロリメトリ ーによって測定したＴ＋ａの値を大きく広げることを見出した。　［１９８１年 アムステルダムのＩＥ１ｓｅｖｉｅｒ／北オランダより出版のＣ，Ｇ、に’ｎｉ ｇｈｔｌ集、Ｓ、　Ｍａｂｒｅｙ−Ｇａｕｄによる「リポソーム：物理的構造か ら治療学的応用まで」参照〕。好運にもＤＳＴＣ／コレステロール／Ｄ？ＩＰＧ ／α−トコフェロール（５：　４　：　１　：０．０２）の均質な脂質混合物を ヘモグロビンの濃厚溶液（２０ｇ　／％）により３５℃において水和することに よってヘモグロビンが効率的にカプセル化されることが証明された。ＨＳＰＣは カプセル化効率及び循環半量時間の両方共ＤＳＰＣと類似の結果を与工た。α− トコフェロールはコレステロールと類憤の性質を有するけれどもこのものは強力 な抗酸化剤であり、そしてヘモグロビンが貯蔵の間にメトヘモグロビンに酸化さ れるのを防ぐ役割をし、従ってこれは全脂質の２％の量で加えられる。

半量時間は投与量に依存するので、この半量時間の研究のためにマウスに血液容 積の２５％に等しい一定の投与量を注入した。マウスはこのマルチユニット輸液 に該当する処置のあとで何等の２、性毒性の徴候を示さず生き延びた。第７図は ＴｍＯの時に観測されたＬＥ）ｌの半分が循環系から消失するまでに要する時間 、すなわちその曲線からめられるＴＩ／２で示される時間を示す、上方のグラフ においては４つの時点に適合させた一本の指数関数曲線（点線）が測定の誤差範 囲内にある（誤差範囲を示す棒線は各点においてｎ＝１１匹の動物についての標 準偏差を示す）、下側のグラフについては適合はより貧弱である。誤差範囲を示 す棒線は３個の測定値の範囲を示す、　ＬＥＨの吸収は網膜内皮系によったがこ れは単一の動的吸収プロセスを反映する理由が存在しない多成分系の一つである 。それにも拘らずこの）ＩｓＰｃに基＜　ＬＥ）ｌについて少なくともその指数 曲線の適合から、１５時間、そしてより該当すると思われる値として２０時間の 最低ＬｚｚＯ値を評価することが可能である。この値はＤＭＰＣに基づ＜　ＬＥ Ｈでみられる４時間の最低時間あるいはＣ，Ａ、Ｈｕｎｔ、　Ｒ，Ｒ，Ｂｕｒｎ ｅｔｔｅ、　Ｒ，Ｄ。

ＭａｃＧｒｅｇｏｒ　、　Ａ、Ｅ＋５ｔｒｕｂｂｅ　、　Ｄ、Ｔ、Ｌａｕ　、　 Ｎ、Ｔａｙｌｏｒ及びＨ，Ｋａｗａｄａ；５ｃｉｅｎｃｅ、　ＲＩＱ、１１６７ ５（１９８５）によって報告された卵ＰＣに基づくリポソームで見出された５、 ５時間の値に対して劇的な改善を示す。第８図はよく現われるＳ字型の、ヘモグ ロビンによる酸素結合曲線を示すが、これはそのヘモグロビンの高い協同性がカ プセル化の後にもそのまへに残っていることを示している。その中に挿入して載 せであるグラフは所謂Ｈｉｌ　の曲線を示し、この曲線の傾斜ｎは協同的酸素結 合の一つの尺度であってこ〜で示されているＬＨ）Ｉについての２．８の（直は 全血についてのそれと同じである。ヘモグロビンが５０％飽和された時のＰ、。

で表わされるＯ２の分圧は例えば２．３−ジホスフオグリセレート（ＤＰＧ）あ る０はピリドキサルー５−ホスフェート（ｐ−５−ｐ）のような種々の有機燐酸 エステルを一緒にカプセル化することによって上昇させることができ、それによ って酸素親和性を新鮮なＲＢＣのそれよりも低下させる。第９図からみられるよ うにＰ−５−Ｐは貯蔵されたＬＢＨの高いＰ、。の値を実際に何週間にもわたっ て維持し、これは貯蔵されたＲＢＣで到達し得るものよりも相当に長く、ＲＢＣ の場合には細胞内ＤＰＧはこれがリポソームの中に一緒にカプセル化された時に 存在すると思われるものよりも大きく次第に分解して行くことが知られている。

ｐ−５−ｐの濃度の上昇はｐｓｏＯ値を更にシフトさせることができ、その結果 重大により多量の０□の供給がもたらされる。このようなＰ、。のシフトはＮ１ ｃｏｌａｕ等によって貧血動物の心拍出量を低下させるのに効果的であることが 示されている［Ｃ，Ｎ１ｃｏｌａｕ、　Ｂ、Ｐ、Ｔｅ１ｓｓｅｉｒｅ、Ｃ，Ｒｏ ｐａｓｓ、　Ｍ、０．Ｖａｌｌｅｇ及びＲ，Ａ、Ｈｅｒｉｇａｕｌｔ：Ｂｉｂｌ ｔｈｃａＨａｅｍａｔ、４１．９２（１９８５）］　。

ＬＥ）ｌへの０２の結合の機構はこれがヘモグロビン溶液におけるよりも遅いけ れども赤血球のそれよりも相当に早いことが示されている。この速度は実際にリ ポソームの大きさに比例し、そして水性の内部層を通る拡散距離の関数である［ Ｋ、Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆ及びＪ、０１ｓｏｎ；Ｊ、Ｂｉｏｌ。

ｃｈｅ＋ｓ、　、■Ｌ１２６１９　（１９８４）　ｌ　、第１０図に走査電子顕 微鏡写真でＲＢＣとＬＨ）Ｉ　との寸法の違いを示す。小円板状のＲＢＣの平均 大きさは８×２ミクロンであるのに対して球状ＬＥＨのそれの平均値は０．２　 ミクロンである。

以上の結果は本発明に従う技術手段が三つの大きな問題、すなわちＤＭＰＣ及び 卵ｐｃに比してより長い半量時間、卵ｐｃに比してより長期間の棚ざらし寿命及 び大きく低下した費用の三つが解決されることを示している。

ＨＳＰＣは合成したＤ？ＩＰＣまたはＤＳＴＣよりもオーダーで約３はども安価 である。更に、マイクロフルイダイザは０．２ミクロンのリポソームの安定な懸 濁液を作り出し、これはその充填されたＬＨＨに対して少なくとも２ｏ容積％以 上の最終酸素運搬能を有するヘモグロビンをカプセル化しているが、これはもと の押出し法のものと類似の値である。カプセル化されたヘモグロビンの濃度は脂 質：ヘモグロビンの比に依存し、そしてこれはいずれの方法を用いてもその前駆 溶液中の最初のヘモグロビン濃度の７０％を超えない。しかしながらマイクロフ ルイダイザＴｍを用いれば前駆溶液の４０容積％程度をカプセル化することがで き、これに対してもとの方法ではこれは１０％である。

この０．２　ミクロンのリポソームによってもたらされる利点はそれらが滅菌用 の０．２２ミクロンのフィルタを通過させることができるということである。上 に述べたようにこれは先ず最初そのリポソームを過浸透圧的ショックに曝すこと によって達成される。例えばある容積の燐酸塩で緩衝された塩水をその洗滌した ＬＨ）Ｉに加えて３０ミリモルの燐酸ナトリウム、１１０　ミリモルのＭａＣｌ 及びｐＨ７，４の最終濃度に達するようにする。これらのリポソームは水に対し て容易に透過性であって浸透圧的な収縮を受け、その際それらリポソームの容積 を著しく減少させる。これらリポソームの外部的に加えられたイオンに対する透 過性は極めて低く、そして所謂Ｄｏｎｎａｎの平衡が再び確立されるまでに多数 の時間を要する（Ｄｏｎｎａｎ平衡とはリポソーム内部の大型の不透過性アニオ ンと、ヘモグロビンと及び有機燐酸エステルとが拡散可能な小型イオンの、電荷 のバランスのための不均等な分布を生じさせることを言う）、イオンが拡散進入 する時に水がそれに続く。平衡状態において浸透圧勾配とイオン性勾配との間に バランスが生じて膨張が停止する。ＬＨＨの懸濁液の充填容積で測定した収縮と 再膨張との時間的経過を第１１図に示す。過浸透圧的ショックに続く２時間の間 は希薄なリポソーム懸濁液は０．２２ミクロンのフィルターを通して加圧７遇す ることができる。第１１図は充填された”セル”容積と内部のヘモグロビンの濃 度との変化を過浸透圧的ショックの後の時間の関数としてプロットして示す。

リポソームが水の拡散浸出につれて約２５％まで急速に収縮し、そしてそれに従 ってヘモグロビンの濃度が上昇するのをみることができる。各イオンの再分布は 比較的遅い。濾過滅菌はこの収縮直後の期間の間において最も効果的である。

本発明の多数の追加的な変法及びイ―飾が以上の説明から可能であることは明ら かである。従って添付の特許請求の範囲の記述の範囲内で本発明は特に説明した 以外の態様で実施するであろうことが理解されるべきである。

Ｆ／６．３　２５・・ ＦＩ６．５ Ｆ／θ、６ ＦＩｏ、　７ カプセル化した後の日数（４°Ｃにて保存）ＦＩ６．９ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成１年２月２８日 １、国際出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８７１０２１５２ ２　発明の名称 リポソームでカプセル化したヘモグロビンの拡大規模製造方法３、特許出願人 ４、代理人　〒１０７ ５、補正書の提出年月日 １９８８年９月９日 ６、添付書類の目録 （１）補正書の翻訳文　１通 浄書（内容に変更なし） 請求の範囲 １、　カプセル化されたヘモグロビンがマウスの生体における半量時間少なくと も１５時間以上を有するようなを少なくとも１０ｍ／＋ｍｉｎの速度で製造する 方法において、下記 イ）１４を超える炭素数のアシル鎖を有する飽和したホスファチジルコリン、 口）コレステロール、 ハ）負に荷電した脂質、及び 二）α−トコフェロール を組合わせたものからリポソームを形成し、上記リポソームを間質の含まれない 無菌のヘモグロビンと組合わせてヘモグロビン／リポソームの混合物を形成し、 上記混合物を第１室中で加圧し、この混合物を上記第１室よりも低い圧力を有す る第２室中に互いに衝突するような流れを形成する少なくとも２つ以上のオリフ ィスを通して投射し、その際この衝突する各法れは上記第２室の中に含まれる混 合物中にキャビテーション及び攪拌を生じ、この混合物を平均粒度が約０．２０ ミクロンになるまで再循環し、そして このカプセル化されたヘモグロビンを濾過してそのカプセル化されなかったヘモ グロビンを含む不純物を除去することにより無菌の生成物を作り出すことの各段 階よりなる、上記方法。

２、　上記各オリフィスが互いに１８０°の角度で配置されていてそれにより上 記液体が互いに直接衝突する、請求項１記載の方法。

３、　各オリフィスが矩形に画定されたマイクロチャンネルである、請求項２記 載の方法。

４、　上記混合物が第１室において２０００ｐｓｉ　と５０００ｐｓ　ｉとの間 の圧力に加圧される、請求項１記載の方法。

５、　リポソームの組成が５：４：１：０，２のモル比である、請求項１記載の 方法。

６、　上記リポソームが本質的に下記 イ）水素化された大豆ホスファチジルコリンとジステアロイルホスファチジルコ リンとからなる群より選ばれる化合物と、 口）コレステロールと、 ハ）シミリストイルホスファチジルグリセロールと、二）α−トコフェロールと からなる組合わせ物より形成される、請求項１記載の方法。

７、　狭い粒度分布を有し、そして最大リポソームが直径０．２５ミクロンであ るようなリポソーム中、にカプセル化された無菌のヘモグロビンを少なくともＩ ｏ１ｄ／ｗｉｎの速度で製造する方法であって、その際上記リポソーム％以上の 酸素運搬能力、及びマウスで測定して少なく無菌のヘモグロビンを分離し、 クロロホルム中で、負に荷電した水素化大豆ホスファチジルコリンと、コレステ ロールと、シミリストイルホスファチジルグリセロールと、及びα−トコフェロ ールとを混合して脂質を形成し、 クロロホルムを除去し、 脂質の均一な膜を形成し、 上記無菌ヘモグロビンを上記脂質の均一膜に加え、２０−４０度の間においてそ のヘモグロビンの全体に上記脂質を分散させてリポソーム中にカプセル化された ヘモグロビンを形成し、 上記ヘモグロビンをリポソームと共に２−６度において１０−１４時間回転し、 インキュベーションしてカプセル化を増進させ、 このリポソームとヘモグロビンとを２０００−３０００ｐｓｉの圧力においてマ イクロフルイダイザに強制的に通し、このヘモグロビンと脂質とを上記マイクロ フルイダイザを通して、単一膜のリポソーム中にカプセル化されたヘモグロビン の均一粒度分布に達するまで再循環させ、 カプセル化されなかった全てのヘモグロビンを、０．１ミクロンのフィルタを有 するペリコンｍ接線方向流濾過装置を用いて除去し、且つ同時にその除去された ヘモグロビンヲ定容積ダイアフィルトレージョンによりｐＨ７，４の３０ミリモ ル濃度の燐酸塩緩衝液と置き換え、燐酸塩で緩衝された塩溶液を加えて各塩イオ ンを血清との相容性のために均等化し且つ過浸透圧的ショックを作り出してリポ ソームを収縮させ、そしてこの浸透圧ショックをかけたリポソームを０．２２ミ クロンのフィルタに通してそのリポソームでカプセル化されたヘモグロビン生成 物を滅菌することの各段階よりなる、上記方法。

径０．２５ミクロンであるよううなりポソーム中にカプセル化された無菌のヘモ グロビンを少なくとも７ａｉｇ／ｓｉｎの速度で作る方法であって、その際上記 リポソームにカプセル化されたヘモグロビンが少なくとも３ｏ容積％以上の酸素 運搬能力、及びマウスで測定して少なくとも１５時間以上の半量時間を有する方 法において、間質を含まないヘモグロビンを分離して濃縮し、この間質を含まな いヘモグロビンを０．２２ミクロンの滅菌用フィルタを通過させ、 クロロホルムの中で、水素化大豆ホスファチジルコリンと、コレステロールと、 負に荷電したシミリストイルホスファチジルグリセロールと、水素化された大豆 ホスファチジルコリンと、シミリストイルホスファジルグリセロールと、及びα −トコフェロールとを混合して脂質の溶液を形成し、 クロロホルムを除去し、 脂質の均一な膜を形成し、 上記無菌ヘモグロビンを上記均一乾燥脂質に加え、２０−４０度の間において上 記脂質を上記ヘモグロビン溶液で水和させてヘモグロビンを含む多重膜リポソー ムの分散液を形成し、 上記ヘモグロビンをリポソームと共に２−６度において１０−１４時間インキュ ベーションのもとに温和に攪拌してカプセル化の効率を上昇させ、 このリポソームとヘモグロビンとを１０００　３０００ｐｓｉの圧力においてマ イクロフルイダイザｍに強制的に通し、 このヘモグロビンと脂質とを上記マイクロフルイダイザを通して、単一膜のリポ ソーム中にカプセル化されたヘモグロビンの、平均０．２　ミクロンの均一な粒 度分布に達するまで再循環させ、 カプセル化されなかった全てのヘモグロビンを、０．１ミクロンのフィルタを有 するペリコンｍ接線方向流濾過装置を用いて除去し、且つ同時にその除去された ヘモグロビンを定容積ダイアフィルトレージョンによりｐＨ７，４の３０ミリモ ル濃度の燐酸塩緩衝液と置き換え、燐酸塩で緩衝された塩溶液を加えて各塩イオ ンを血清との相容性のだ、めに均等化し且つ過浸透圧的ショックを作りだしてリ ポソームを一時的に収縮させ、そして この浸透圧ショックをかけたリポソームを直ちに０．２２ミクロンのフィルタに 通してそのリポソームでカプセル化されたヘモグロビン生成物を滅菌することの 各段階よりなる、上記方法。

９、　マウスで測定して少なくとも１５時間のＴ＋／ｚ値を有する血液代替物に おいて、これが液状媒質と、輪郭の明確な球状構造及び０．１５−０．４　ミク ロンの間の直径を有する小胞とからなり、その際上記小胞はヘモグロビンとこの ヘモグロビンをカプセル化する脂質膜とからなり、またその際上記膜は本質的に コレステロール約３０−５０モル％、１４よりモ大きい炭素数のアシル鎖を有す る飽和ホスファチジルコリン約４０−６０モル％及び負に荷電した脂質膜２ない し１０モル％ の少なくとも一つ以上の脂質二重膜よりなる、上記血液代替物。

１０．０ないし１０モル％の、脂質可溶性抗酸化剤を含有する請求項９記載の血 液代替物。

１１、上記脂質可溶性抗酸化剤として０ないし１０％のα−トコフェロールを特 徴する請求項１０記載の血液代替物。

１２、４０−１００モル％の重合可能なジアセチレン性ホスファチジルコリンを 特徴する請求項１１記載の血液代替物。

１３、ホスファチジルコリンのシアル酸誘導体を含む、請求項１２記載の血液代 替物。

１４．ホスファチジルコリンが水素化された大豆ホスファチジルコリン又はジア セチレン性重合可能ホスファチジルコリン或はホスファチジルコリンのシアル酸 誘導体であり、そして負に荷電した脂質がホスファチジン酸、ジセチルホスフェ ート又はシミリストイル−。

ジパルミトイル−及びジステアロイルホスファチジルグリセロールの群から選ば れる、請求項１０記載の血液代替物。

１５、負に荷電した脂質がシミリストイルホスファチジルグリセロールである、 請求項１０記載の血液代替物。

′１６．液状媒質と、輪郭の明確な球状構造及び０．１５−０．４ミクロンの間 の直径の小胞とからなり、その際上記小胞は間質を含まないヘモグロビンとこの ヘモグロビンをカプセル化する脂質二重膜とからなり、またその際上記二重膜は 本質的に モル比で５：４：１：０．２の、水素化された大豆ホスファチジルコリンと、コ レステロールと、シミリストイルホスファチジルグリセロールと、及びα−トコ フェロールと よりなる、上記血液代替物。

手　続　主甫　正　書　（自発） １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８７１０２１５２ ２　発明の名称 リポソームでカプセル化したヘモグロビンの拡大規模製造方法３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　−′−゛・“１ ・参−＋−＋Ｌ− ４、代理人　〒１０７ ５、補正の対象 特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の出願人鼻■妻寺の欄および添付 書類の目録の欄 手続補正書（自制 御、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８７１０２１５２ 補正の内容 （１）補正書の翻訳文提出書の差出書をこの手続補正書に添付のものと差し替え る。

（２）補正書の翻訳文第１頁第１行のｒ　（ＰＣＴ　１９条補正の翻訳文）」を 削除する。

（３）補正書の翻訳文の全文をこの手続補正書に添付する補正書の翻訳文の浄書 と差し替える。（内容に変更なし、）国際調査報告

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．狭い粒度分布を有して最大リポソームが直径０．２５ミクロンであるような リポソームの中に無菌のヘモグロビンを少なくとも１０ｍｌ／ｍｉｎの速度で無 菌的にカプセル化する方法であって、その際上記リポソームにカプセル化された ヘモグロビンが少なくとも２０容積％以上の酸素運搬能力、及びマウスで測定し て少なくとも１５−２０時間以上の半量時間を有する方法において、赤血球から 膜間質の夾雑小片を含まない無菌のヘモグロビンを分離し、 クロロホルムと、負に荷電したＨＳＰＣと、コレステロールと、ＤＭＰＧと、及 びα−トコフェロールとを混合して均一な脂質の溶液を形成し、 真空のもとにクロロホルムを除去し、 脂質の均一な膜を形成し、 無菌の濃厚なヘモグロビンを上記脂質の均一膜に加え、 温和な回転的撹拌によって約３２℃と３８℃との間において０．５時間と２時間 との間の時間にわたりそのヘモグロビン溶液の全体に上記脂質を分散させてリポ ソームを形成し、 上記ヘモグロビンをリポソームと共に２℃と６℃との間の温度において１０−１ ６時間回転してインキュベーションしてカプセル化を増進させ、 ヘモグロビンをリポソームとともに少なくとも２つの部分に分け、 それらの各部分を充分なエネルギーとともに強制してキャビテーションを作り出 し、 上記分割段階と強制段階とを単一膜リポソーム中にカプセル化されたヘモグロビ ンの均一な粒度分布が達成されるまで継続し、 カプセル化されなかった全てのヘモグロビンを除去し、そして このリポソームにカプセル化されたヘモグロビンを滅菌すること の各段階よりなる、上記方法。
2. ２．狭い粒度分布を有して最大リポソームが直径０．２５ミクロンであるような リポソーム中にカプセル化された無菌のヘモグロビンを少なくとも７ｍｌ／ｍｉ ｎの速度で作る方法であって、その際上記リポソームにカプセル化されたヘモグ ロビンが少なくとも２０容積％以上の酸素運搬能力、及びマウスで測定して少な くとも２０時間以上の半量時間を有する方法において、無菌のヘモグロビンを分 離し、 クロロホルム中で、負に荷電したＨＳＰＣと、コレステロールと、ＤＭＰＧと、 及びα−トコフェロールとを混合して脂質を形成し、 クロロホルムを除去し、 脂質の均一な膜を形成し、 上記無菌ヘモグロビンを上記脂質の均一膜に加え、２０−４０℃の間においてそ のヘモグロビン溶液の全体に上記脂質を分散させてリポソーム中にカプセル化さ れたヘモグロビンを形成し、 上記ヘモグロビンをリポソームと共に２−６℃において１０−１４時間回転し、 インキュベーションしてカプセル化を増進させ、 このリポソームとヘモグロビンとを２０００−３０００ｐｓｉの圧力においてマ イクロフルイダイザに強制的に通し、このヘモグロビンと脂質とを上記マイクロ フルイダイザを通して、単一膜のリポソーム中にカプセル化されたへモグロビン の均一粒度分布に達するまで再循環させ、 カプセル化されなかった全てのヘモグロビンを、０．１ミクロンのフィルタを有 するペリコン式接線方向流ろ過装置を用いて除去し、且つ同時にその除去された ヘモグロビンを定容積ダイアフィルトレーションによりｐＨ７．４の３０ミリモ ル濃度の燐酸塩緩衝液と置き換え、燐酸塩で緩衝された塩溶液を加えて各塩イオ ンを血清との相容性のために均等化し且つ過浸透圧的ショックを作り出してリポ ソームを収縮させ、そしてこの浸透圧ショックをかけたリポソームを０．２２ミ クロンのフィルタに通してそのリポソームでカプセル化されたヘモグロビン生成 物を滅菌することの各段階よりなる、上記方法。
3. ３．マウスで測定して少なくとも１５時間以上のＴ１／２値を有する血液代替物 において、これが液状媒質と、輪郭の明確な球状構造及び０．１５−０．４ミク ロンの間の直径を有する小胞とからなり、その際上記小胞はヘモグロビンとこの ヘモグロビンをカプセル化する脂質膜とからなり、またその際上記膜は本質的に コレステロール約３０−５０モル％、１４よりも大きい炭素数のアシル鎖を有す るホスファチジルコリン約４０−６０モル％及び負に荷電した脂質約２ないし１ ０モル％の少なくとも一つ以上の脂質二重膜よりなる、上記血液代替物。
4. ４．０ないし１０モル％の、脂質可溶性抗酸化剤を含有する請求項３記載の血液 代替物。
5. ５．上記脂質可溶性抗酸化剤として０ないし１０％のα−トコフェロールを含有 する、請求項４記載の血液代替物。
6. ６．４０−１００モル％の重合可能なジアセチレン性ホスファチジルコリンを含 有する、請求項５記載の血液代替物。
7. ７．ホスファチジルコリンのシアル酸誘導体を含む、請求項６記載の血液代替物 。
8. ８．ホスファチジルコリンが水素化された大豆ホスファチジルコリン又はジアセ チレン性重合可能ホスファチジルコリン或いはホスファチジルコリンのシアル酸 誘導体であり、そして負に荷電した脂質がホスファチジン酸，ジセチルホスフェ ート又はジミリストイル−，ジバルミトイル−又はジステアロイルホスファチジ ルグリセロールの群から選ばれる、請求項４記載の血液代替物。
9. ９．負に荷電した脂質がジミリストイルホスファチジルグリセロールである、請 求項４記載の血液代替物。
10. １０．液状媒質と、輪郭の明確な球状構造及び０．１５−０．４ミクロンの間の 直径の小胞とからなり、その際上記小胞は間質を含まないヘモグロビンとこのヘ モグロビンをカプセル化する脂質二重膜とからなり、またその際上記二重膜は本 質的に モル比で５：４：１：０．２の、水素化された大豆ホスファチジルコリンと、コ レステロールと、ジミリストイルホスファチジルグリセロールと、及びα−トコ フェロールと よりなる、上記血液代替物。
11. １１．狭い粒度分布を有して直径が０．１と１．０ミクロンとの間であるような リポソームの中に無菌のヘモグロビンを少なくとも１０ｍｌ／ｍｉｎの速度で無 菌的にカプセル化する方法であって、その際上記リポソームにカプセル化された ヘモグロビンが少なくとも２０容積％以上の酸素運搬能力、及びマウスで測定し て少なくとも１５時間以上の半量時間を有する方法において、赤血球から膜間質 の夾雑小片を含まない無菌のヘモグロビンを分離し、 １４個よりも多い炭素原子のアシル鎖を有するホスファチジルコリンと、コレス テロールと、負に荷電した脂質と、及び脂質に可溶性の抗酸化剤とを非極性有機 溶剤の中で混合して均一な脂質の溶液を形成し、真空でその溶剤を除去し、 脂質の均一な乾燥混合物を形成し、 無菌の濃厚なヘモグロビンを上記脂質の均一な乾燥浪合物腰に加え、 温和な回転的撹拌によって約２０℃と３８℃との間において０．５時間と２時間 との間の時間にわたりそのヘモグロビン溶液の全体に上記脂質を分散させてリポ ソームを形成し、 上記ヘモグロビンをリポソームと共に２℃と６℃との間の温度において１０−１ ６時間撹拌し、インキュベーションしてカプセル化を増進させ、 このリポソームとヘモグロビンの分散液とを１０００ないし８０００ｐｓｉの高 い圧力において、２つ以上の液体流が互いに衝突してその流れの範囲内にキャビ テーションを作り出すように段階された装置を通して送液し、カプセル化されな かった全てのヘモグロビンを除去し、そして このリポソームにカプセル化されたヘモグロビンを滅菌すること の各段階よりなる、上記方法。
12. １２．狭い粒度分布を有して最大リポソームが直径０．２５ミクロンであるよう なリポソーム中にカプセル化された無菌のヘモグロビンを少なくとも７ｍｌ／ｍ ｉｎの速度で作る方法であって、その際上記リポソームにカプセル化されたヘモ グロビンが少なくとも３０容積％以上の酸素運搬能力、及びマウスで測定して少 なくとも１５時間以上の半量時間を有する方法において、間質を含まないヘモグ ロビンを分離して濃縮し、この間質を含まないヘモグロビンを０．２２ミクロン の滅菌用フィルタを通過させ、 クロロホルムの中で、ＨＳＰＣと、コレステロールと、負に荷電したジミリスト イルホスファチジルグリセロールと、水素化された大豆ホスファチジルコリンと 、ＤＭＰＧと、及びα−トコフェロールとを混合して脂質の溶液を形成し、 クロロホルムを除去し、 脂質の均一な膜を形成し、 上記無菌ヘモグロビンを上記均一乾燥脂質に加え、２０−４０℃の間において上 記脂質を上記ヘモグロビン溶液で水和させてヘモグロビンを含む多重膜リポソー ムの分散液を形成し、 上記ヘモグロビンをリポソームと共に２−６℃において１０−１４時間回転し、 インキュベーションしてカプセル化の効率を上昇させ、 このリポソームとヘモグロビンとを１０００−３０００ｐｓｉの圧力においてマ イクロフルイダイザＴｍに強制的に通し、 このヘモグロビンと脂質とを上記マイクロフルイダイザを通して、単一膜のリポ ソーム中にカプセル化されたヘモグロビンの、平均０．２ミクロンの均一な粒度 分布に達するまで再循環させ、 カプセル化されなかった全てのヘモグロビンを、０．１ミクロンのフィルタを有 するペリコンＴｍ式接線方向流ろ過装置を用いて除去し、且つ同時にその除去さ れたヘモグロビンを定容積ダイアフィルトレーションによりｐＨ７．４の３０ミ リモル濃度の燐酸塩緩衝液と置き換え、燐酸塩で緩衝された塩溶液を加えて各塩 イオンを血清との相容性のために均等化し且つ過浸透圧的ショックを作り出して リポソームを一時的に収縮させ、そして この浸透圧ショックをかけたリポソームを０．２２ミクロンのフィルタに通して そのリポソームでカプセル化されたヘモグロビン生成物を滅菌することの各段階 よりなる、上記方法。