JPH02500749A - アンスラサイクリン坑生物質アミン誘導体およびその抗体複合体 - Google Patents
アンスラサイクリン坑生物質アミン誘導体およびその抗体複合体Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
アンスラサイクリン抗生物質アミン誘導体およびその抗体複合体
1、技術分野
本発明は、新規なアンスラサイクリン(anthracycline)抗生物質
アミン誘導体に関する。更に詳しくは、本発明は、アンスラサイクリン誘導体の
反応性アミン基を介して抗体または抗体フラグメントに共有結合的に付着可能で
抗腫瘍活性を有するアンスラサイクリン抗生物質のアミン含有誘導体を含む。抗
体複合体の使用方法とともに新規アンスラサイクリン誘導体および抗体複合体の
調製方法について記アンスラサイクリン抗生物質、特にダウノルビシンおよびド
キソルビシンは、急性白血病および多くの固形腫瘍を含む種々の新生物に対して
顕著な治療効果を有する。最も有効な抗腫瘍化学療法剤として、アンスラサイク
リン抗生物質は、骨髄陥凹、口内炎、脱毛症、胃腸障害を含む多くの毒性症状発
現、および特に皮膚症状発現を示す。加えて心臓有害性は、アンスラサイクリン
抗生物質の唯一の不利な特性である。二形態の心臓有害性が観察されている。す
なわち(1)ST−T変質および不整脈を含む異常なECG変化により特徴づけ
られる急性形態、および(2)ジギタリスに非応答性なうっ血性心不全によって
特徴づけられる慢性、蓄積性、投与量関連毒性である。要するに心臓有害性は、
頻脈、不整脈、呼吸困難、低圧面およびジギタリ投与量決定的心臓有害性は、ア
ンスラサイクリン抗生物質の治療用途への主要な障害となっている。
このように、新生物に対して治療効果を有するが、心臓有害性を減少または除去
したアンスラサイクリン抗生物質の類縁体および/または誘導体に対する要求が
長い間あった。心臓有害性を低下させる目的で開発されたアンスラサイクリン抗
生物質誘導体の一般的な報告に対しては、ヴエイス等(Weiss et al
、、 198B、 Cancer Chemother、 Pharmaeol
18: 185−97)およびここに引用されている文献を参照のこと。
固形腫瘍部位においてしばしば高レベルで見い出されるエンザイムプラスミンに
対して選択性物質であるプロドラッグとして役立つアンスラサイクリン誘導体を
調製する試みにおいて、チャクラパーティ−等[Chakravarty et
at。
、 (1983,J、 Med、 Chem、 28:638−44) ]はド
キソルビシンの3′ペプチジル誘導体を合成した。例えば、3’ −(D−va
l−L−Leu−L−1ys)−ドキソルビシンは、イソブチル クロロホムメ
ート中の保護FMOC−ペプチドの混合無水物を使用し、その後無水アンモニア
を用いてFMOC基を除いて得られた。
他の研究者達は、アンスラサイクリン抗生物質のC−13ビス−ヒドラゾン誘導
体を合成している。例えば、米国特許第4,112.2x7号[ヘンリー等(H
enry et al、)]には、過剰モル量のドキソルビシンまたはダウノル
ビシンと酸ヒドラジドとの反応により形成されたドキソルビシンまたはダウノル
ビシンのC−13ビス−ヒドラゾン誘導体が記載されている。ごく最近、ブラウ
ンラー等[Broνn1er et al、 (198B、 J、 Chew、
Soc、 Cheap、 Comll1.1986:659−61)]は、ダ
ウノルビシン塩化水素と式%式%
(ただし、nは2である)
で表わされるジヒドラジドとの反応により形成された遊離ヒドラジド成分を有す
るダウノルビシンのモノヒドラゾンまた、心臓有害性を減少させる試みにおいて
、ダウノルビシンまたはドキソルビシン等のアンスラサイクリン抗生物質は、薬
剤のグルタルアルデヒド、カルボジイミドおよび過ヨウ酸酸化のような非特異部
位またはランダムカップリング方法によって抗体、Fabダイマーまたはレクチ
ンに共有結合的に連鎖させられている[モンシグニー等(Monsigny e
t al、、 1980. PEB5 Lett、 l旦:181−11116
)および本書に引用されている文献を参照のこと]。
ヒニルビッツ等[Hurwitz et al、、 (1980,J、 App
、 Bi。
chem、 麩25−35)]は、二段法′−より調製された抗体ダウノルビシ
ン複合体について記載する。最初、にヤギ血清免疫グロブリンFc領域の炭水化
物成分を過ヨウ素酸で酸化し、生成したアルデヒド基をポリグルタミルヒドラジ
ドと反応させて水溶性抗体ポリグルタミルヒドラジド巨大分子を形成する。場合
によっては、巨大分子は、ナトリウムシアノボロハイドライドを用いて還元し、
ヒドラゾン結合を安定なヒドラジド基に変更させられる。第2に、抗体ポリグル
タミルヒドラジド巨大分子は、その後ダウノルビシンと反応させて抗体ダウノル
ビシン複合体を形成させる。余りにも水溶性が高いためにインビボ投与に好適で
あり、かつ有効に使用されることによって特徴づけられる本発明の抗体アンスラ
サイクリン複合体と正反対に、ヒニルビッッ等の複合体は、すべての場合におい
て不溶性であり、かつ、インビボ投与には全く適していなかった。
3、要 約
本発明は、アミン成分がヒドラジン、ヒドラジド、フェニルヒドラジン、フェニ
ルヒドラジド、アルコキシアミン、フェノキシアミン、セミカルバジドおよびチ
オセミカルバジドから成る群より選ばれた反応性アミンからなるダウノルビシン
、ドキソルビシン、エビルビシン、エソルビシン、イダルビシン(idarub
icin)、カルミノシン(carminocyin) 、4−デメトキシ−4
′−〇−メチルドキソルビシン、4’ −〇−テトラヒドロピラニルドキソルビ
シン、3′ −デアミノ−3’ (3’−シアノ−41−モルホリニル)ドキソ
ルビシン等の誘導体の如き新規アンスラサイクリン抗生物質抗腫瘍性アミン含有
誘導体を含む。該誘導体は、細胞障害処置用の水溶性治療抗体複合体の調製に特
に有効である。
治療用のアミン含有アンスラサイクリン抗生物質誘導体は、抗体または抗体フラ
グメントに共有結合的に付着する。
共存結合的付着は、生成抗泳複合体がインビボ投与されると抗原と、結合し、か
つ治療上の効果を示す能力を有するように行なわれる。特に、共有結合的付着は
、抗体または抗体フラグメントの被酸化炭水化物成分と含まれるアミンがヒドラ
ジン、ヒドラジド、フェニルヒドラジン、フェニルヒドラジド、アルコキシアミ
ン、フェノキシアミン、セミカルバジドおよびチオセミカルバジドから成る群よ
り選ばれたアミンであるアンスラサイクリン抗生物質誘導体上の該反応性アミン
間に共有結合を形成することによって、達成される。このように、本発明は、共
有結合を介して抗体または抗体フラグメントの被酸化炭水化物成分に付着したア
ミン含有アンスラサイクリン抗生物質誘導体から成る抗体−アンスラサイクリン
複合体を含む。ここで該複合体は、(1)水溶性が高いので該複合体はインビボ
投与に適しており、かつ(2)実質的に非結合化抗体または抗体フラグメントと
同じ免疫特異性であり、そして、該共有結合がヒドラゾン、フェニルヒドラゾン
、アシル ヒドラゾン、オキシム、セミカルバゾン、チオセミカルバゾンおよび
それらの誘導体から選ばれたもめであることによって特徴づけられる。
さらに、本発明は、部位選択的治療用抗体複合体の調製方法を含む。該方法は、
(a)抗体または抗体フラグメントと酸化剤とを反応させて該抗体または抗体フ
ラグメントの炭水化物成分にアルデヒド基を形成し、そして、
(b)該抗体または抗体フラグメントの被酸化炭水化物のアルデヒド基と、反応
性アミンがヒドラジン、ヒドラジド基フェニルヒドラジン、フェニルヒドラジド
、アルコキシアミン、フェノキシアミン、セミカルバジドおよびチオセミカルバ
ジドから成る群より選ばれるアミン含有アンスラサイクリン抗生物質の該反応性
アミン基とを反応させて、(1)水溶性が高いので複合体はインビボ投与に適し
ており、かつ(2)実質的に非複合化抗体また抗体フラグメントと同じ免疫特異
性で特徴づけられる複合体を形成するこrご
とからなる。
加えて、本発明は、部位選択性治療抗体複合体の調製方法を含む。該方法は、抗
体または抗体フラグメントの被酸化炭水化物のアルデヒド基と、反応性アミンが
ヒドラジン、ヒドラジド、フェニルヒドラジン、フェニルヒドラジド、アルコキ
シアミン、フェノキシアミン、セミカルバジドおよびチオセミカルバジドから成
る群より選ばれるアミン含有アンスラサイクリ〉抗生物質の該反応性アミン基と
を反応させて、(1)水溶性が高いので該複合体はインビボ投与に適しており、
かつ(2)実質的に非複合化抗体また抗体フラグメントと同じ免疫特異性で特徴
づけられる複合体を形成することからなる。
本発明の水溶性抗体複合体は、特にアンスラサイクリン抗生物質を所定標的部位
に運んで細胞性障害インビボ治療することに適している。このように、本発明は
、さらに細胞障害を処置する方法を含む。該方法は、動物またはヒトに治療上有
効量の水溶性アンスラサイクリン抗生物質−抗体複合体を投与することからなり
、該複合体は細胞障害と関連した標的の抗原性決定基に免疫特異性であり、がっ
非標的部位に非免疫特異的であり、そして該抗原決定基は非標的部位において実
質的な量で見い出されないのである。
標的部位には、特異細胞、組織、器官またはアンスラサイクリン抗生物質または
その誘導体処置になじみやすい細胞障害とインビボで関連したその他の部位が含
まれる。処置し得る細胞障害には、次のものが含まれるがそれらに限定されるこ
とはない。すなわち、急性リンパ性白血病、急性顆粒球白血病、急性モノリンパ
芽球白血病、非ホッジキンス(Hodgki n ’ s)白血病を含むがそれ
に限定されることはない悪性白血病、胸部カルシノーマ、少[オート(oat)
] −細細胞カルシノーマ膀胱カルシノーマ、気管支原性カルシノーマ、転移性
甲状カルシノーマおよび子宮内膜、精巣、前立腺、頚、頭、首のカルシノーマを
含むが、これらに限定されることのないカルシノーマ(carcinoma)、
前原性サルコーマ、エビングス(Ewing’s)サルコーマおよび軟組織サル
コーマを含むがそれらに限定されることのないサルコーマ、胸部転移性腺癌、お
よび血漿細胞骨髄腫である。
における実施例および添付図面を参照してより十分に理解されるだろう。
第1図(A−F)は、ヒト アデノカルシノーマ異種移植片に対する部位選択性
アドリアマイシン−アジビックジヒドラジド(ADH−ADH)腫瘍特異抗体複
合体の治療効能を示す図である。(A)腫瘍特異抗体単独、(B)非特異的また
は関連のない抗体単独、(C)腫瘍特異ADR−ADH−抗体複合体、(D)非
特異的ADR−ADH抗体複合体、(E)ADR−ADH単独および(F)腫瘍
特異抗体とADHの混合物。非処置対照動物およびほぼ最高耐性投与量(mtd
)のADRで処置した動物の腫瘍生長は、比較のために含まれている(A−F)
。
第2図(A−H)は、ヒト アデノカルシノーマ異種移植片に対する部位選択性
ADH−ADH−腫瘍特異抗体複合体および部位選択性アドリアマイシン−(グ
ルタミル−ガンマ−ヒドラジド)(ADR−E−ガンマ−Hy)腫瘍特異抗体複
合体の治療効能を示す図である。(A)腫瘍特異抗体単独、(B)ADH単独、
低投与量、(C)腫瘍特異抵抗とADR(m t d)の混合物、(D)腫瘍特
異抗体とADH(低投与量)の混合物、(E)腫瘍特異ADH−ADH−抗体複
合体、(F)腫瘍特異ADH−E−Hy抗体複合体、(G)非特異的ADH−A
DH抗体複合体および(H)非特異的ADR−E−Hy−抗体複合体。非処置対
照動物およびほぼ最高耐性投与量(mtd)のADHで処置した動物の腫瘍生長
は比較のために含む(A−H)。
第3図(A−B)は、リンパ腫異種移植片に対する部位選択性ADR−ADH腫
瘍抗体複合体の治療効能を示す図である。(A)腫瘍特異抗体−ADR−ADH
−複合体。
非選択性ADR−ADH−抗体複合体、非処置。
(B)腫瘍特異抗体単独、ADR−ADH単独および腫瘍特異抗体およびADH
の混合物。
第4図は、マウス4群の血液、肺、牌臓(spl) 、肝臓(liv)、右およ
び左の腎臓(KID−RとKID−L)、筋肉および腫瘍へのヒト アデノカル
シノーマ異種移植片に対する[3HE−Me2ADR−ADH腫瘍特異抗体複合
体のバイオ分布を示す図である。群1(−)および2(区部)は、インビボでヒ
ト アデノカルシノーマ異種移植片で処置され、−刃群3と4は非処置である。
群1(■)と3(r:22)は、
[3HコーM e 2 A D R−A D H腫瘍特異抗体複合体で処置され
た。群2(m)と4(剛)は、[3H] −Me2 ADR−ADH単独で処置
された。
5、定 義
本願明細書を通じて使用されている“アンスラサイクリン抗生物質”は、抗腫瘍
試薬を含むがそれらに限定されることのないテトラサイクリンキノイド環構造を
有するいかなる抗腫瘍試薬を含むことを意図し、ここで該環構造は、ダウノサミ
ン(daunosamine)およびその誘導体の如き糖にグルコシド結合を介
してカップルしている。このように“アンスラサイクリン抗生物質”は、ダウノ
ルビシン、ドキソルビシン、エビルビシン、エソルビシン、イダルビシン、カル
ミノシン、4−デメトキシ−4′ −〇−メチルドキソルビシン、4′ −〇−
テトラヒドロピラニルードキソルビシン、3′ −デアミノ−3’ −(3’
−ジアノ−45−モルホリニル)ドキソルビシン、アクラシノマイシンおよびそ
れらのいかなる抗腫瘍性類縁物を含む。
“アンスラサイクリン抗生物質のアミン誘導体”は、反応性アミンを含みまたは
含むように変性されるいかなる抗腫瘍性アンスラサイクリン抗生物質を含むこと
を意図する。
“反応性アミン”は、単純な化学縮合反応によって窒素原子を介してアルデヒド
機能基に共有結合的に付着または結合し得るいかなる窒素含有機能基をも含むこ
とを意図する。かかる反応性アミン類には、ヒドラジン、ヒドラジド、フェニル
ヒドラジン、フェニルヒドラジド、アルコキシアミン、フェノキシアミン、セミ
カルバジドおよびチオセミカルバジドを挙げることができるがこれらに限定され
るこ本発明は、抗体および抗体フラグメントの被酸化炭水化物成分に部位選択的
、共有結合的に付着して水溶性治療抗体複合体を形成可能な反応性アミンを存す
るアンスラサイクリン抗生物質の抗腫瘍誘導体に関する。
本発明のある実施態様において、反応性アミン基は、リンク成分を介して、次の
ものを含むがこれらに限定されることはないが、アミノ酸、ペプチド、式−Co
(CH2)−OCH3−1−NH−CH2−1−NHCOCH2CH2CH(N
H2)−または−NHCOCH(NH2)CH2CH2−であり、Xはアミノ酸
またはペプチドである。]の有機成分、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダ
ウルビシン、エビルビシン、エソルビシン、カルミノシン、4−デメトキシ−4
′−〇−メチルドキソルビシン、4′−〇−テトラヒドロピラニル ドキソルビ
シンまたは3′−デアミノ−3’ −(3’−シアノ−4“−モルフオリニル)
ドキソルビシンの糖成分の3′アミノ基の如き糖成分上の第1級または第2級ア
ミノ基に付着する。
他の実施態様において、反応性アミン基は、リンク成分を介して、次のものを含
むがそれらに限定されることはないが、アミノ酸、ペプチド、または式H2N−
NHCO−[R] −CO−(ただし、Rはアルキレン鎖中に0〜20の炭素原
子を有する該アルキレン鎖である。)のヒドラジド成分である反応性アミン、単
純化学縮合反応を介してダウノルビシン、ドキソルビシン、エビルビシン、イダ
ルビシン、エソルビシン、カルミノシン、4−デメトキシ−4′−〇−メチルド
キソルビシン、4′ −〇−テトラヒドロピラニル ドキソルビシンまたは3′
−デアミノ−3′ −(3′−シアノ−4′−モルフオリニル)ドキソルビシン
およびその類縁体のC−13ケト基に付着する。また他の実施態様において、反
応性アミン基は、チオエーテルまたはターシャリ−アミンリンケージを介してダ
ウノルビシン、イダルビシンまたはカルミノシンおよび好適なメチレン基を有す
る他の抗腫瘍アンスラサイクリン抗生物質類縁体のC−14メチレン基に付着す
る。
6.1:アミン誘導体
本発明に従って有効なアンスラサイクリン抗生物質アミン誘導体は、反応性アミ
ン成分を含むかまたは含むように変性される天然および合成抗腫瘍性アンスラサ
イクリン抗生物質誘導体を含む。第1表は、抗腫瘍性アンスラサイクリン抗生物
質の例の完全でないリストを示す。
第1表
アンスラサイクリン抗生物質
ダウノルビシン(DNR)
4−デメトキシ−4′−〇−メチルドキソルビシン4’ −0−テトラヒドロピ
ラニル ドキソルビシン3′ −デアミノ−3’ −(3’−シアノ−4′−モ
ルホリニル)ドキソルビシン
“反応性アミン”成分は、単純な縮合反応によって窒素原子を介してアルデヒド
官能基に共有結合的に付着または結合し得る窒素含有官能基を含むことを意図す
る。このように、本発明に従って有効なアンスラサイクリン抗生物質アミン誘導
体は、次のもの含むがそれらに限定されることはない。
すなわち、グルタミル−(ガンマ−ヒドラジド)−アルファーアドリアマイシン
(ADR−E−ガンマHy)、グルタミル−(アルファーヒドラジド)−ガンマ
−アドリアマイシン、ヒドラジド−スクシニル−アドリアマイシン、ヒドラジノ
アセチル−アドリアマイシン、アミノキシアセチル−アドリアマイシン、ヒドラ
ジノベンゾイル−アドリアマイシン、ヒドラジノアセチルーチロシニルーアラニ
ルーアラニルーアラニルーアドリアマイシン、アドリアマイシン−アジピック
ジヒドラジド(ADR−ADH) 、ジメチルアドリアマイシン−アジピック
ジヒドラジド、イダルビシンーアジピック ジヒドラジド、アドリアマイシン−
ペンタグルタミルヒドラジド、ダウノルビシン−アジピック ジヒドラジド、ダ
ウノルビシン−14−8−(3−プロピオニル ヒドラジド)、ダウノルビシン
−14−N−メチル−(アセチルヒドラジド)等である。
第1a式(以下に示される)を使用して、本発明に従って有効な反応性アミン含
有アンスラサイクリン抗生物質誘導体を産するようにさらに誘導し得るアンスラ
サイクリン抗生物質アシル誘導体には、次のものが含まれるがそれらに限定され
ることはない。すなわち、グリシル−アドリアマイシン、アラニル−アドリアマ
イシン、D−アラニル−アドリアマイシン、イソロイシニルーアドリアマイシン
、バリル−アドリアマイシン、チロシニルーアドリアマイシン、アルギニル−ア
ドリアマイシン、アラニル−アラニル−アドリアマイシン、アラニル−アラニル
−アラニル−アドリアマイシン、D−アラニル−アラニル−アラニル−アドリア
マイシン、チロシニルーグリシルーグリシルーアドリアマイシン、チロシニルー
グリシルーグリシルーアルギニルーアドリアマイシン、チロシニルーアラニルー
アラニルーアラニルーアドリアマイシン、チロシニルーバリルーロイシル−リシ
ル−アドリアマイシン、バリル−ロイシル−リシル−アラニル−アドリアマイシ
ン、バリル−ロイシル−リシル−バリル−アドリアマイシン等である。これらの
アシル誘導体も研究目的有効である。
8.2.アンスラサイクリル抗生物質
アミン誘導体の合成方法
本発明に従って有効なアンスラサイクリン抗生物質のアミン誘導体は、多くの方
法によって合成し得る。
ある方法に従って、反応性アミン含有アンスラサイクリン抗生物質アシル誘導体
は、下記反応式(第1式)(ただし、RはN−ヒドロキシスクシンイミドまたは
N−ヒドロキシベンゾトリアゾールから誘導された活性エステル成分、イソブチ
ルクロロホルメートから誘導された混合カルボニック−カルボキシ無水物または
塩素原子である)に従って合成される。都合によって第1式は、アンスラサイク
リン抗生物質アドリアマイシン(A D R)を使用して表わされアミンを有す
るADHと同様に、ダウノルビシン(DNR)、イダルビシン、エビルビシン、
エソルビシン、カルミノシン、4−デメトキシ−4′ 0−メチルドキソルビシ
ン、4′−〇−テトラヒドロピラニルドキソルビシン等を含む糖成分上の第1級
または第2級アミン基を有するアンスラサイクリン抗生物質のアシル誘導体を調
製するために使用し得る。
第1式
%式%)
(この方法を使用するアンスラサイクリン抗生物質誘導体の実験的説明は、後述
の7.1.17.7. 1. 18.7、1.20.7.1.21.7. 1.
22および7.1゜23節参照のこと)。
また、反応性アミン含有アンスラサイクリン抗生物質アシル誘導体は、下記の式
(第1a式)に従って、最初に糖成分上に第1級または第2級アミン基を有する
アンスラサイクリン抗生物質とフルオレニルメチロキシカルボニル(FMOC)
−保護アミノ酸またはペプチド[ここでは、一般1.m ”FMOC−NH−ヘ
プチドーCo−R” (ただし式中、R′はN−ヒドロキシスクシンイミドまた
はN−ヒドロキシベンゾトリアゾールから誘導された活性エステル成分、イソブ
チルクロロホルムメートから誘導された混合カルボニック−カルボキシル無水物
または塩素原子である)称する。]の活性エステル、混合無水物または活性塩素
原子と反応させ、そしてFMOC保護基を除いてアシルアンスラサイクリン抗生
物質誘導体を形成して合成される(この方法を用いて合成される3′アミジルま
たは3′ペプチジル アンスラサイクリン誘導体の実験的説明は、下記第7.1
.1−7.1.16節を参照のこと)。
その後、アミジルまたはペプチジル誘導体を前に規定するFMOC−NH−G−
COR成分と反応させて反応性アミン含有FMOC−アシルアンスラサイクリン
抗生物質誘導体を形成する。FMOC保護基は、厳密に無水の塩基性条件下で除
去されてアシルアンスラサイクリン抗生物質誘導体を生ずる。
都合により第1および18式において、FMOC保護基は、ジメチルフォルムア
ミド中において無水条件下でジエチルアミン(Et2NH)を用いて除かれる。
ジアルキルアミン、ピペリジン、モルホリンまたはアンモニア等の他の試薬は、
第1または18式において使用してもよい。
第1a式は、ADRを用いて表わされているが、ADR。
DNR,イダルビシン、エビルビシン、エソルビシン、カルミノマイシン、4−
デメトキシ−4′−〇−メチルドキソルビシン、4′−〇−テトラヒドロビラニ
ルドキシソルビシン等を含む糖成分上にアミン基を有するアンスラサイクリン抗
生物質のアシル誘導体を調製するために使用し得る。
N HCOCH2CH2CH(N H−F M OC)−1まNHCOCH(N
H2)CH2CH2−である。]他の方法に従って反応性アミン含有アンスラサ
イクリン抗生物質のアシル誘導体は、下記に示される反応式(第2式)に従って
合成される。第2式において、ADRは説明〉含有誘導体は、それぞれ−ヒドラ
ジドースクニシルおよび−ヒドラジドーグルタリックーアンスラサイクリン誘導
体(nは2または3である)である。
(この方法を用いて調製されたアンスラサイクリン抗生物質誘導体の実験的説明
は、下記7.1,19節参照のこと。
他の方法に従って、C−13ケト基を有するアンスラサイクリン抗生物質のC−
13ヒドラゾン誘導体は、アンスラサイクリン抗生物質のC−13ケト基と酸ヒ
ドラジドとの縮合反応によって合成される。
好適な方法に従って酸ヒドラジドを、ビスアンスラサイクリン生成物をほとんど
または全く形成しないような適当量の過剰モルのヒドラジド中でアンスラサイク
リン抗生物質と反応させる。もしビス生成物が得られるならば、かかる生成物は
、該生成物を、本発明の抗体複合体を形成するように、抗体または抗体フラグメ
にトの被酸化炭水化物成算的ではない。この一般的な方法は、例示目的のために
ADHを用いて、下記第3式に示される。この方法は、ダウノルビシン、ドキソ
ルビシン、エビルビシン、エソルビシン、イダルビシン、カルミノシン、4−デ
メトキシ−4′−〇−メチルドキンルビシン、4’ −0−テトラヒドロピラニ
ル ドキソルビシン、3′−デアミノ−3’ −(3’−シアノー4′−モルホ
リニル)ドキソルビシン等を含むがこれらに限定されることのないC−13ケト
基を有するいかなるアンスラサイクリン抗生物質のアンスラサイクリン抗生物質
反応性アミン含有誘導体の調製に有効である。
第3式
(但し、式中、Rは鎖中に0〜20個の炭素を有するアルキレン鎖である。)(
この方法を用いたアンスラサイクリン誘導体合成の実験的説明は、下記7.2.
1および7゜2.3節参照のこと。)
加えて、第3式に示される方法が本発明に従って水溶性部位選択性抗体複合体の
調製に有効であるアクラシノマイシンの如きアンスラマイシン抗生物質のアミン
誘導体含有ヒドラゾンの調製に使用し得ることは考察される。この場合、アクラ
シノマイシンのトリサツカリド成分上のケトン基を酸ヒドラジドと反応させて反
応性アミン含有アンスラサイクリン抗生物質誘導体を形成する。
第3式に示される変性方法に従って、アンスラサイクリン抗生物質の反応性アミ
ン含有誘導体は、C−13ケトン基を有するアンスラサイクリン抗生物質とXグ
ルタミル残基およびX+1ヒドラジド基を有するオリゴグルタミルヒドラジドと
を適当量のモル比で反応させて合成されるので、Xアンスラサイクリン成分は共
有結合的オリゴグルタミルヒドラジドポリマーに付着する(ただし、又は1〜5
0゜好ましくは1〜10の整数である)。(この方法で調製されるアンスラサイ
クリン誘導体の合成に関する実験的説明は、下記7. 2. 2節参照のこと)
。
性アミン含有誘導体は、下記箱4,4aおよび5式に示されるいずれかの反応式
に従って、C−14メチレンチオエーテルまたC−14シャリ−アミンリンケー
ジを形成することによって合成される↓
(この方法を用いるアンスラサイクリン誘導体の合成の実験的説明は、下記7.
3節参照のこと。)第4式に示されるように、この方法を使用して、反応性アミ
ンを有する所定のS−アルキレーション生成物および反応性アミンを有しないN
−アルキレーション生成物の両者が形成される。形成された生成物の混合物は、
S−アルキレーション生成物のみが抗体または抗体フラグメントの被酸化炭水化
物成分のアルデヒド成分と反応して本発明のアンスラサイクリン抗生物質抗体複
合体を産するので、問題とならない。
第4a式
N−アルキレーション生成物の生成を避けるために、アンスラサイクリン抗生物
質のC−14チオ工−テル誘導体は、上記第4a式に示されるように調製される
。例示実施例の如く、第4a式に示される方法を使用すると、DNR−14−3
−プロピオニルヒドラジドは、14−ブロモーDNRとN−FMOC−3−メル
カプト−プロピオニルヒドラジドと反応させ、その後無水、塩基性条件下でFM
OC保護成分を除いて調製される。
第5式に示されるように、C−14ターシャリ−アミン成分は、14−ブロモ−
DNRと反応させて、本発明に従って、治療上の抗体複合体の調製に有効なアミ
ン含有誘導体を形成できる。
第5式
抗体がグリコタンパク質であるので、化合物は、分子のペプチド鎖に共有結合的
に付着した炭水化物成分に付着できるだろう。炭水化物成分のなかには免疫グロ
ブリンのFc領域に位置し、補体系の成分が結合することが望まれる。
免疫グロブリンのFc領域の炭水化物成分は、ここに記載の式において利用され
る。また、炭水化物成分を含有する免疫グロブリンのFabまたはFab’フラ
グメントは、ここに記載の反応式において利用されるだろう。かかる免疫グロブ
リンの一例としては、ブットナム等により配列化下記に詳細に示されるように、
抗体または抗体フラグメントの炭水化物側鎖は、選択的酸化を受けてアルデヒド
をば、アルコキシアミン、ヒドラジン、ヒドラジド、フェニルヒドラジン、フェ
ニルヒドラジド、セミカルバジド、またはチオセミカルバジドの如きアンモニア
誘導体)と反応させてオキシム、ヒドラゾン、フェニルヒドラゾン、セミカルバ
ゾンまたはチオセミカルバゾンを形成する。
また、抗体の炭水化物成分は、アミン基に付着または反応可能なように酵素技術
によって変性させられる。例えば、イノラミニダーゼにガラクトースオキシダー
ゼを加えたものが、アルデヒド成分を形成するために使用されるだろう。
8.3.1.酸化の化学的方法
抗体分子の炭水化物部分または成分を酸化すると、アルデビト基を形成する。過
ヨウ素酸、バラ過ヨウ素酸、メタ過ヨウ素酸ナトリウムおよびメタ過ヨウ素酸カ
リウムの如き酸化剤が使用される。これらのなかで、副次または好ましくない副
反応がほとんど生じないので、酸素酸およびその塩が好ましい。一般的な説明用
として次の文献を参照のberg、 ed、、 Academic Press
、 New York、 p、367] 。
酸化剤による抗体の酸化は、既知の方法で行なわれる。
酸化反応において、抗体は、一般に水溶液形態で使用され、その濃度は、一般に
100 mg/ m1以下、好ましくは1〜2る場合には、一般に水溶液形態で
あり、その濃度は一般に0.001〜10mM、好ましくは1.0〜10mMで
ある。酸素酸またはその塩の量は、抗体の種類に依存するが、一般に過剰、例え
は酸化可能な炭水化物量の10〜100倍、で使用される。しかしながら、最適
量は定型実験により決定される。
酸素酸またはその塩による抗体の酸化工程において、任意範囲は、pHが約4〜
8、i度が0°〜37℃、反応時間が約15分〜12時間である。
酸素酸またはその塩による糖タンパク質の酸化中に、光は糖タンパク質の酸化防
止のために除くことが好ましい。
8.3.2.酸化の酵素的方法
抗体分子の炭化水素成分の酸化は、ノイラミニダーゼと伴にまたは酵素ガラクト
ースオキシダーゼ単独でも達成さコ。抗体は、水溶液で使用され、その濃度は、
一般に0゜5〜20trrg/mlである。酵素は、一般にpH約5.5〜約8
.0で使用される。酵素反応に関するpH1基質基質式抗体が1g0分子である
場合に、かかる酵素酸化は多分有効ではないだろう。
6.3.3.被酸化抗体およびアンスラサイクリ、ン抗生物質抗腫瘍アミ
ン誘導体のカップリング
本発明の抗体複合体は、被酸化抗体と、ヒドラジン、ヒドラジド、フェニルヒド
ラジン、フェニルヒドラジド、アルコキシアミン、フェノキシアミン、セミカル
バジドおよびチオセミカルバジド基からなる群より選ばれた有効なアミン基を有
するアンスラサイクリン抗生物質とを反応させて得られる。高マンノース含有抗
体は、アンスラサイクリン抗生物質との複合体を形成するために使用し得る(こ
こに引例として組み込まれている1988年8月2日に出願された特許出願シリ
ーズ第153,175号に詳細に説明されている)。ただちに生ずる生成物は、
最初の付加生成物から水分子を除いて生ずる炭素−窒素二重結合を含んでいる。
すなわち、
?
抗体−C=○+NH2−R→抗体−CH=N−R十H20and 5truct
ure、 MeGraw Hill Co、、 New Youk、 pp82
4−825゜コ 。
約0.5〜20mg/mlの被酸化抗体溶液とアンスラサイクリン抗生物質のア
ミン誘導体を混合しく反応性アミン基と抗体アルデヒドとのモル比は約1〜約1
0,0OC)である)、その溶液を約1〜18時間、好ましくは暗所でインキュ
ベートする。好適な温度は、o″〜37℃、pHは約6〜8である。
6.3.4.細胞塊および非共有結合
アンスラサイクリン抗生物質の除去
得られた抗体複合体は、アミノ酸の第1級アミンと抗体分子のアルデヒド成分間
の分子内シッフ塩基形成によって生成した細胞塊を含んでいるだろう。加えて、
アンスラサイクリン抗生物質アミン誘導体は、被修飾抗体に対する適度な結合と
同様に被酸化炭水化物成分を含む抗体に強く非共存結合していることを示す。
このように、これらの例において、形成された細胞塊および非共有結合的アンス
ラサイクリン抗生物質は、所定抗体複合体から高速ゲルパージニージョン液体ク
ロマトグラフィを含むがこれらに限定されない好適なゲル濾過方法によって任意
に除去される。
好ましくない細胞塊の除去C1、抗体複合体がインビボで付着アンスラサイクリ
ン抗生物質を所定の標的部位に運搬するために使用されるので、特に重要である
。かかる抗体塊は、除去用細網内皮細胞系によって吸収され、標的部位または特
異組織からのかかる移動は、分布度および非標的部位における潜在的な有害効果
と同様に投与複合体の治療効果も減少させるだろう。
6.4.アンスラサイクリン抗生物質および抗体複合体の使用法
本発明のアンスラサイクリン抗生物質アミン誘導体は、治療力のある抗体複合体
の調製用に特に適している。このように、これらの誘導体は、治療力のある抗体
−アンスラサイクリン抗生物質複合体調製時の中間体である。アンスラサイクリ
ン抗生物質アミン誘導体の反応性アミン基を介する抗体または抗体フラグメント
の被酸化炭水化物成分への選択的付着は、抗体免疫特異性を保有し、治療上荷動
な水溶性複合体を生ずる。
かかる抗体複合体は、優先的に標的部位に運ばれ、かつアンスラサイクリン抗生
物質の用途に関し主に限定する問題である心臓有害性を避は得るために、インビ
ボ治療に特に有益である。
本発明に使用される抗体は、従来の抗体またはモノクローナル抗体であってもよ
い。モノクローナル抗体の使用法は、各モノクローナル抗体が抗原決定基に特異
的であり、かつ大量に、容易に既知の技術を用いて生産し得るので、種々の利益
を提供する。
本発明に有効な抗体は、抗腫瘍性アンスラサイクリン抗生物質で処理し得る細胞
障害と関連する標的に向けられる。
この出願の全体を通じて使用される“細胞障害”なる語は、新生物および抗腫瘍
アンスラサイクリン抗生物質を使用して処置し易い他の増殖性状態を含むことを
意図する。かかる細胞障害は、次のものを含むがそれらに限定されることはない
。すなわち、急性リンパ性白血病、急性顆粒球白血病、非ホッジキンス(non
−Hodgki n ’ s)リンパ腫を含むがそれらに限定されることのない
゛リンパ腫、胸部、小−オート(Oat)細胞カルシノーマ、膀胱、気管支原性
カルシノーマ、子宮内膜、精巣、前立腺、頚、頭および首のカルシノーマを含む
がそれらに転移されることのないカルシノーマ、前原性肉腫、エビングス(Eν
ing’s)肉腫、軟組織肉腫を含むがそれらに限定さ・れることのない肉腫、
胸部転移性腺癌、転移性チーズ様癌腫および血清細胞骨髄腫である。
加えて、“細胞障害”なる語は、さらに、次のインビボ試験によって測定される
ように、アンスラサイクリン抗生物質アミン誘導体の抗体複合体を使用して治療
処置のし易い新生腫瘍生長物を含むことを意図する。
処置されるべき小サイプルの@瘍は、従来の方法によって得られ、種々のアリコ
ートに分けられる。特殊な腫瘍に免疫特異性を有する免疫反応性抗体、なすわち
モノクローナルかまたはポリクローナルは、従来のまたは/’lイブリドーマ技
術を用いて同定および/または調製される。抗体−アンスラサイクリン抗生物質
複合体は、本発明に従って調製される(前記6.3節参照のこと)。1アリコー
トの腫常かまたはヌードマウスは、便利な実験動物モードを与える。腫瘍フラグ
メントを、その部位で視覚上のマイクロメーターで測定し、抗体−アンスラサイ
クリン/抗生物質複合体を数日間静脈内投与した。類似移植した網膜下のカプセ
ル腫瘍フラグメント、しかしこれは非処置である、を有する動物は、陰性対照と
して役立つ。測定は、周期的に一群の動物を使用して移植腫瘍組織かまたは所定
時における情報システムの処置後の器官について行なわれ、腫瘍生長明の抗体−
アンスラサイクリン抗生物質複合体に対するインビボ感度のためスクリーンし得
る。
本発明の抗体複合体を使用して有効に処置し得る細胞障害と関連する標的例は、
次のものを挙げることができるがそれらに限定されることはない。すなわち、腫
瘍抗原、組織適合性、分化よおび他の細胞膜抗原、酵素、ホルモンレセプター、
オンコジーン生成物等である。加えて、異種抗原決定基に反応的である抗体の組
み合わせが、使用できる。キャリアー(担体)として使用される免疫グロブリン
は、IgA、IgD、IgE、IgMの如きあるクラスの抗体、あるクラスのI
gG、 または免疫グロブリンのあるフラグメント、即ち半抗体分子(または単
−H鎖、L鎖対)、Fab、(Fab’ )2フラグメントのFab’を含む。
複合体から放出されることのない治療上の活性、酵素的に触媒化された離型およ
びインビボで標的において化学的に誘導された離型を含む他の可能性は、インビ
ボで本発明のアンスラサイクリン抗生物質抗体複合体の治療上の有効性を説明す
るために提供される。しかしながら、本発明は、かかる治療効果に対するいかな
る特別な理論または機構に限定されるものではない。
本発明の抗体複合体は、原則的には、細胞障害のインビボ治療処置方法の利用に
適する。かかる方法は、本発明の量を投与することからなり、ここで該複合体は
、細胞障害と関連した標的部位に免疫反応性で、かつ免疫特異性であり、そして
細胞障害と関連しない組織に非免疫反応性、かつ非免疫特異性である。本発明の
複合体は、該複合体が誘導されるアンスラサイクリン抗生物質前駆体で処置がし
易い細胞障害の処置に、治療上有効である。
加えて、抗体−アンスラサイクリン抗生物質複合体は、アミン誘導体が誘導され
る遊離アンスラサイクリン抗生物質前駆体に耐性を有する腫瘍の処置に有効だろ
うということが考察される。特殊な腫瘍が、特異抗体−アンスラサイクリン抗生
物質複合体を用いて、インビボで治療的処置されるか否か決定するために、上記
インビボ試験が利用される。
インビボ投与は、ヒト血清アルブミンの如き他のタンパク質と伴にまたはなしで
、血清または生理学的食塩水を含む好適な担体中で抗体−アンスラサイクリン抗
生物質複合体薬理組成物を使用することを含むだろう。複合体の投与量は、当業
者によって容易に決定され、そして細胞障害特性および使用された特殊アンスラ
サイクリン抗生物質によって変わるだろう。投与の好適なモードは、筋肉内、静
脈内、動脈内、箱内、腹腔内およびリンパ管経由の一般的に非経口である。
次の一連の実施例は、説明用であり、本発明の範囲を何7、ドキソルビシンまた
はアドリアマイシン次実施例において、FMOC−保護3′アシル−ADH誘導
体は、6.2節に記載したように調製された。もし薄層クロマトグラフィー[ク
ロロホルム/メタノール8:2(シリカ)、アセトニトリル10.1%トリフル
オロ酢酸(TFA)1 : 1 (逆相)]が得られた生成物が純水でないこと
を示したならば、その生成物は、例えば、クロロホルム/メタノールを使用する
シリカゲル(230−400メツシニ)のフラッシュ り6マトグラフイーで精
製された。
7.1.1.グリシル−ADH(1)
FMOC−gly (1,0当量)を窒素雰囲気中で乾燥、窒素バブル化ジメチ
ルホルムアミド(DMF)に溶解し、0℃に冷却した。N−メチルモルホリン(
1,0当量)を加え、その混合物を約5分間インキュベートし、撹拌しながらイ
ソブチルクロロホルメート(1,0当量)を加えた。
更に3〜5分間インキニベーションした後、アドリアマイシン−塩化水素(AD
H−CI)(0,9〜1.0当量)をDMF中に懸濁させた等量のN−メチルモ
ルホリンとともに加えた。反応混合物を0℃で1〜2時間その後撹拌しながら約
4℃で12〜16時間インキュベートした。溶媒物を酢酸エチルに吸収させ、飽
和炭酸水素ナトリウム水溶液、5%クエン酸または酢酸水および水で連続的に洗
浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、ロータリー蒸発で濃縮し、メタノ
ール/エーテルから再結晶かまたはエーテルで沈降させた。FMOC−g 1
y収率75%、融点154−157℃、Rf;o、92[クロロホルム/メタノ
ール8:2(シリカ)]、Rf、0.42 Cアセトニトリル10.1%水性T
FAI : 1 (逆相)]。C44H42N20.4・2.5H20元素分析
、計算値:C,60,89;H。
5.46;実測値;C,60,96;H,5,48゜ gl y−ADRを形成
するために、FMOC−g 1 y−ADRを新たな窒素バブル化DMF (約
10tng/ml)に溶解し、0℃に冷却した。蒸留ジエチルアミンを窒素雰囲
気下、乾燥ガラス注射器を介して最終濃度的10%で加えた。15〜30分間の
インキュベーション後、激しい窒素気流中でアミンを蒸発させた。溶媒を35℃
においてロータリー蒸発で除去した。残留物をエーテル中で0℃において一夜保
存した。エーテルを、例えはデカンテーションで除いた後、残留物を5%酢酸に
溶解し、を機相にもはや赤色が現われなくなるまでエーテル抽出した。水性層を
凍結乾燥した。
g 1 y−ADH(1)、HOACの収ffi53mg(72%)。(1)の
融点209°C(分解)、Rf;0.05 [クロロホルム/メタノール8:2
(シリカ)]、R’f;0.35 [アセトニトリル10.1%水性TFAI
: 1 (逆相)コ。
C31H36N2014・0.5H20の元素分析、計算値:C955、60、
H,5,57、N、 4.20 ;実測値;C955,78,H,5,52,N
、4.63゜7.1.2.アラニル−ADR(2)
アラニル−ADR(2)(a l a−ADR)を、FMOC−alaを出発原
料として使用した以外は、gly−ADHに対して前記したように調製した。F
MOC−ala−ADR(7)i[97%、融点118〜120’C1Rf:Q
。
94 [クロロホルム/メタノール8:2(シリカ)]、Rf;0.79[アセ
トニトリ°I/10.1%水性TFA1:1(逆相)]。FMOC−a 1 a
ADRC45H44N2014 ・I20ノ元素分析、計算値:C,63,2
2,H,5゜42;N、3.27;実測値;c、63. 18;H,5゜39;
N、3.25゜
(2)、HOAcの収Ji560mg(79%)、(2)の融点170℃(分解
)Rf:Q、24 [クロロホルム/メタノール8:2(シリカ)]、Rf;o
、21 [アセトニトリル10.1%水性TFAI:1(逆相)]。C32H3
8N2014・2.0H20の元素分析、計算値:C,4,08;H,5,96
、N、3.94 ;実測値;c、53.95;H,5,89、N、3.95゜
7.1.3.D−ALA−ADR(3)D−アラニル−ADR(3)(D−a
1 a−ADH)を、FMOC−D−alaを出発原料として使用した以外は、
g 1 y−ADHに対して前記したよ・)に調製した。FMOC−D−a 1
a−ADRの収量172mg(64%)、融点170”C(分解) 、Rf
: 0.36 Cシ’)力、クロロホルム/メタノール/酢酸、90 : 5
: 5] 、Ca5HaaN20、a・4.5H20(7)元素分析、計算値:
C,58,88;H,5,82,N、3.07;実測値;c、59.02;H,
5,46、N、2.81゜
(3) 、HOAcの収量73mg(72%)、(3)の融点204℃(分解)
、Rf:0.56 [シリカ、クロロホルム/メタノール/H20,20: 1
0 : 1] 、C32H3gC52H3・1.5H20の元素分析、計算値:
C,54,78;H,5,89,N、4.01 、実測値;c、54.96、H
,5,83;N、4.49゜
7.1.4.イソロイシニルーADR(4)FMOC−i 1 e (1,0当
量)とN−ヒドロキシスクシンイミド(1,1当量)とを窒素雰囲気下でD M
F / CH2CfI2に溶解し、−5℃に冷却した。ジシクロへキシルカルボ
ジイミド(DCC)(塩化メチレン中で0.5M。
1、0−1. 1当りを加え、該混合物を0℃で1時間、その後室温で18時間
撹拌した。自沈を濾別し、その後、溶媒をロータリー蒸発で除去し、酢酸エチル
に再溶解して10%酢酸、水、飽和炭酸水素ナトリウム溶液および水で順次抽出
される粗生成物を残した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、ロータリー蒸発
で濃縮してメタノール/エーテルから結晶化かまたはエーテルで沈降させた。生
成物を真空で乾燥した。FMOC−i 1 e−ADRの収量33%、融点14
7℃(分解)、Rf:0.45 [クロロホルム/メタノール/酢酸90:5:
5(シリカ)コ、Rf;0.25[クロロホルム/メタノール95:5(シリカ
)コo C48H5ON2014 ・I20の元素分析、計算値:C163、9
8,H,5,81;N、3. 11゜g 1 y−ADH(1)に記載したよう
に、FMOC成分をFMOC−i 1 e−ADRから除去してi 1 e −
ADH(4)生産した。
(4)、HOAc(7)収量48%、(4)の融点192℃(分解)。C35H
45N2014・I20の元素分析、計算値:C,57,14,H,6,44,
N、3.81 、実測値;C,57,47;H,6,12,N、3.84゜7.
1.5.バリル−ADH(5)
バリル−ADH(5)を、FMOC−vatを出発原料として使用した以外は、
1le−ADHに対して前記したように調製した。FMOC−va 1−ADR
の収量35%、融点154℃(分解)、Rf二0.46 [クロロホルム/メタ
ノール/酢酸95:5二5コ、Rf ;o、71 [クロロホルム/メタノール
/91シリカ]。C47HasN2014・2.5I20元素分析、計算値:
C,62,04; H。
5.87;N、3.08;実測値;C,61,99;H。
5.70:N、3.12゜
(5)、HOAcの収量90%、(5)の融点197℃(分解)。C34H4□
N2014の元素分析、計算値:C158,11,H,6,02,N、3.99
;実測値;C158,10,H,6,07,N、4.04゜7.1.8.チロシ
ニルーADH(6)チロシニルーADR(t y r−ADR)(6)を、FM
QC−tyrを出発原料として使用した以外は、gIY−ADRに対して前記し
たように調製した。FMOC−チロシニルーADHの収量82%、融点180〜
182°C(分解)、Rf:0.91 [クロ凸ホルム/メタノール8:2(シ
リカ)コ、F M OCA D RC5、H4g N 2 0 、s・1゜5H
20の元素分析、計算値:(:、64.08;H,5゜38;N、2.94;実
測値;c、64.17;H,5゜56、N、3.47゜
(6)、HOAcの収ffi140mg(86%)、(6)の融点200℃(分
解)Rf:0.58[クロロホルム/メタノール8:2(シリカ)]、Rf;0
.53 [アセトニトリル10.1%水性TFAI:1(逆相)コ。C311H
42N2Chs・0.5H20元素分析、計算値:C,58,83;H,5,5
9,N、3.63;実測値;c、58.67;H,5,82,N、4.29゜
7.1.7.アルギニル−ADR(7)アルギニル−ADH(7)(a rg−
ADH)を、次側(a)(b)を除いてg 1 y−ADR用に記載したように
調製した。
(a)FMOC−a rgが最初の出発見料であり、(b)反応が完結すると直
ちに、粗生成物混合物をロータリー蒸発で濃縮し、グラジェント溶離(溶媒A:
0.1%水性TFA:溶媒Bニアセトニトリル)を15m1/分で使用するライ
エンC−18ダイナマツクスカラム(Rainin C−18Dynamaxカ
ラム 21.4mm X 25cm)の調製用HPLCで精製した。非直線38
分間グラジェントを展開した。検出器を300nmに設定し、生成物ピーhを集
め、プールした。得られたFMOC−a r g−ADRをロータリー蒸発で濃
縮し、凍結乾燥した。FMOC−a rg−ADRの収ff180%、融点15
0℃、Rf : 0.40 [n−ブタノール/酢酸/水3:1:1 (シリカ
)コ、Rf;o、23cアセトニトリル10.1%水性TFAI:1(逆相)コ
。C49H51N5016・2H20の元素分析、計算値:C,55,57,H
。
5、 2B 、N、6. 64 、実測値;c、55.64;H。
5.24 、N、6.73゜
上記のようにFMOC−保護基を、FMOC−arg−ADHから除去した。(
6)、2HOAcの収量173 mg(70%)、(7)の融点214℃(分解
)、Rf:0゜06 [クロロホルム/メタノール8:2(シリカ)]、Rf、
o、15[アセトニトリル10.1%水性TFAI:1(逆相)コ。
7.1.8.アラニル−アラニル−ADR(8)アラニル−アラニル−ADR(
8)を、F’MOC−ala−alaを出発原料として使用した以外は、1le
−ADHに対して前記したように調製した。FMOC−ala−ala−ADR
の収量203mg(57%)、融点165〜169℃(分解)、Rf:0.43
[シリカ、クロロホルム/メタノール9:11、o、23 [シリカ、クロホル
ム/メタノール/酢酸90:5:5)コ。C48H49N3015・0,5H2
0の元素分析、計算値: C,62,87;H。
5.50;N、4.60;実測値;c、62.94.H。
6、 06;N、4. 56゜
(8)、HOAcの収量100mg(84%)、(8)の融点197℃(分解)
、Rf:0.30[シリカ、クロロホルム/メタノール/酢酸20:10:1]
。C35H43N30□5・の元素分析、計算値:C,56,37;H,5,8
1;N、5.66;実測値、C,56,21;H,5,84;N、5.50゜
7.1.9.アラニル−アラニル−アラニル−ADR(9)アラニル−アラニル
−アラニル−ADR(9)を、FMQC−a 1 a−a 1 a−a 1 a
を出発原料として使用した以外は、i 1 e−ADHに対して前記したように
調製した。
FMOC−a 1 a−a 1 a−a 1 a−ADHの収量158mg(3
7%)、融点178〜182℃、Rf:0.65[シリカ、クロロホルム/メタ
ノール9:1]、0.18 [シリカ、クロホルム/メタノール/酢酸90:5
:5)1゜C51H54N40□6・0.5H20の元素分析、計算値:C26
1,99,H,5,61;N、5.70;実測値;C261,73,H,5,9
7;N、5.66゜(9)、HOAcの収量80mg(89%)、(9)の融点
223℃(分解)、Rf:0.27[シリカ、クロロホルム/メタノール/酢酸
20:10:1コ。C38H48N4016・1.5H20の元素分析、計算値
:C,54,08;H,6,09;N、 6.67;実測値;c、54.09゜
H,5,97;N、6.54゜
7.1.10. D−アラニル−アラニル−アラニル−ADH(10)
D−アラニル−アラニル−アラニル−ADR(10)を、FMOC−D−a 1
a−a 1 a−a 1 a−a 1 aを出発原料として使用した以外は、
i 1 e−ADHに対して前記したように調製した。・FMOC−D−a 1
a−a 1 a−a 1a −A D Rの収ffi196mg(61%)、
融点195〜199℃、Rf:0.32[シリカ、クロロホルム/メタノール/
酢酸85:10:5]。C51H54N40工、・1.5H20の元素分析、計
算値:C,60,88;H,5,71;N、5.59;実測値;c、60.96
;H,5,92;融点201〜203℃(分解)、Rf:0.24 [シリカ、
クロロホルム/メタノール/酢酸20;10;11、C1gH48N401b・
1.0H20元素分析、計算値:C,54゜66;H,6,04,N、6.74
;実測値;c、54゜44 、H,5,99、N、 6.84゜最初にFMOC
−Ty r−G 1 y−G 1 yを次のように調製した。
Tyr−gly−gly (5,0gm、16.9mモル)と炭酸水素ナトリウ
ム(1,42gm、16.9mモル)を水20m1に懸濁させ、ここヘジオキサ
ン30m1に溶解したつ一フルオレニルメチル スクシンイミジルカーボネート
(6,27gm、1.86mモル)を加えた。反応混合物を1.5時間撹拌し、
2%炭酸水素ナトリウム1gに加え、エーテル(2X250ml)で抽出した。
水相を濃縮H(Jエタノールから2度再結晶化品は、純粋なFMOCtyr−g
ly−glVを生じた。収量:4.70gm(53゜8%):融点、215〜2
16℃、Rf:0.33[クロロホルム/酢酸/メタノール 85:5:10(
シリカ)コ、028H27N307の元素分析;計算値:C164,98;H,
5,26;N、 8. 12 ;実測値C,64,76;H。
5.32;N、s、07゜
7、 1. 1.節g 1 y−ADHに示したようにFMOC−Tyr−gl
y glyをADRにカップルさせた。FMOC−t y r−g 1 y−g
1 y−ADRの収量は95%、融点150〜153℃;Rf ;o、63
[クロロホルム/メタノール8:2(シリカ)] 、Rf ;o、68 [アセ
トニトリル10.1%水性TFAI : 1 (逆相)コ。C5,H、、N40
1.・H20の元素分析;計算値:C,62,25;H,5,32;N、513
0;実測値;c、62.17゜H,5,92;N、 5.09゜7.1.1.節
guy−ADHで記載されているように生成物から保護FMOC成分を除いた。
生成物t y r−g 1 y−g 1 y−ADR,HOAc収量68mg(
80%);融点165℃(分解);Rf:0.10[クロロホルム/メタノール
8:2(シリカ)Rf、o、53[アセトニトリル0.1%水性TFAI :
1(逆相)コ。C42H48N4017・2H20の元素分析;計算値:C,5
5,01,H,5,72,実測値;C,55゜15;H,5,54゜
7.1.12. T Y R−G L Y −G L Y −ARG−ADH(
12)
FMOC−Ty r −G 1 y−G I V (26mg、 0.050m
モル)を7L 1. 1.節、FMOC−glyで記載の如く活性化した。その
後、FMOC−t y r−g l y−glyをarg−ADRにカップルし
た。慣習上、7.1゜4節に記載の如(調製されたarg−ADR・2HOAc
(41mg、0.050mモル)とN−メチルモルホリンとをDMF中の活性化
FMOC−t y r−g I Y−g I Yと反応させた。18反応時間後
、溶媒をロータリー蒸発で除き、粗FMOC−t y r−g 1 y−g 1
y−a rg−ADRをエーテルを用いて粉砕して単離した。固形物を濾別し
、空気乾燥して58mg(92%);Rf ;0,36[n−ブタノール/酢酸
/水4:1:1 (シリカ)〕を得た。
FMOC−t y r−g 1 y−g 1 y−a r g−ADRのFMO
C成分を除去しt y r−g 1 y−g 1 y−a r g −DR(1
2)を与えた。(12)、2HOAcの収量は36mg(84%);融点204
℃(分解) Rf ;o、 06[クロロホルム/メタノール8:2((シシリ
カ):Rf:0.15[アセトニトリル0.1%水性TFAI:1 (逆相)]
。
C47H61N8018・2.5H20の元素分析:計算値;C252,11,
H,6,07:実測値;c、51.72.H。
、5.64゜
7.1.13. T Y R−A L A −A L A −ALA−ADH(
13)
CBZ−Ala−Ala−Ala−t−ブチルエステルCBZ−a l a−a
1 a (10,0gm、34.0gモル)を窒素雰囲気下で0℃においてテ
トラヒドロフラン(THF)150mlに溶解させた。N−メチルモルホリン(
4゜18m1,38mモル)を加え、5分後、イソブチルクロロホルメー) (
4,94m1,38mモル)を続けた。さらに5分後、THF中に予め調製され
たala−o−t−ブチル−HC,Q (6,76gr、38mモル)とN−メ
チルモルホリン(4,18m1,38mモル)の混合物を加えた。反応混合物を
4℃で3日間、撹拌しながらインキュベートした。その後、反応混合物を濾別し
た。濾液をロータリー蒸発によって固形に濃縮した。固形物を酢酸エチルに吸収
し、5%クエン酸(3X)、水(2X)、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(3X
)および水(2X)で抽出した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、その後固
形物までロータリー蒸発で濃縮し、真空乾燥してCBZ−a 1 a−a 1
a −ala−o−t−ブチルエステルを得た。収量:10.3gm(78%)
、Rf ;o、94 [クロロホルム/酢酸/メタノール85:5:10(シリ
カ)コ。
Ala−Ala−Ala−t−ブチルエステルCBZ−a 1 a−a 1 a
−a 1 a−o−t−ブチル(10,0gm、25mモル)を、5%酢酸と5
%P d / c触媒700mgの存在下で1.5時間メタノール30’Oml
中で47psiにおいて水素した。触媒を濾別し、濾液をロータリー蒸発でオイ
ル状に濃縮した。エーテルとともに粉砕して、濾過、真空乾燥してa 1 a−
a 1 a−a 1 a−o−を−ブチル、HOAcを生ずる固形物を形成した
。収量 7゜2gm(88%)、Rf、0.10 [クロロホルム/酢酸/メタ
ノール85:5:10(シリカ)]。
FMOC−(0−t−ブチル)Tyr−Al a−Al a−At a−t−ブ
チルエステルFMOC−(0−t−ブチル) t y r (1,53gm、
3゜3mモル)を窒素雰囲気下0℃においてTHF25mlに溶解させた。N−
メチルモルホリン(363uj7.3.3mモル)を撹拌しながら加え、5分後
イソブチルクロロホルメート(429ujl)、3.3mモル)を続けた。精製
される自沈を5分後濾別し、濾液を0℃においてT HF 3 Q ml中のa
1a−a 1a−a 1a−o−t−ブチル(1,0gm、3.0mモル)と
N−メチルモルホリン(330ug。
3.0mモル)の溶液に直接加えた。反応混合物を4℃で蒸発で除去した。残留
物を酢酸エチルに溶解させ、10%酢酸水(LX)、水(2X)、飽和炭酸水素
ナトリウム(3X) 、水(2X) 、5%炭酸水素ナトリウム(3X)および
水(2X)で抽出した。有機層を濃縮乾燥し、メタノールエーテルから結晶化し
た。生成物を60℃においてP2O5上真空で乾燥した。収量:5.97m(5
5%)、融点189〜190℃(主要物);191〜192℃(母液からの副次
物);Rf:0.81[クロロホルム/メタノール9:1(シリカ)]。C41
Hs 2 N 408の元素分析;計算値、C,67,54,H,7,19:実
測値;C967,45;u、7.2B。
FMOC−Ty r −A 1 a−A 1 a−A 1 aFMOC−(Oj
−t−ブチル) t y r−ala−a 1 a−ala−0−t−ブチル(
957mg、1.32mモル)をT F A 120 mlに溶解させ、室温で
90分間撹拌した。
TFAをロータリー蒸発で除去し、残留物を石油エーテルで処理した。生成白固
形物を、濾別し、石油エーテルで洗浄し、真空中で乾燥した。収量ニア76mg
(95%);融点、196℃(分解) 、Rf ;o、53 [塩化メチレン/
メタノール9:1 (シリカ)コ。C33H36N4 o、・0゜5H20の元
素分析;計算値C,63,33,H,5,96;実測値C,67,07,H,5
,95゜FMOC−Ty r−a 1 a−a 1 a−a 1 aを、前記7
゜1.1節、FMOC−g ly−、、ADRに記載した如<ADy r−a
1 a−a 1 a=a 1 a−ADHの収量は47%、融点210〜212
℃、Rf;o、79[クロロホルム/メタノール8:2(シリカ)]、]FMO
C−tyr−ala−ala ala ADRC60H63N5 01g・1.
0H20の元素分析−計算値;c、 62. 11 ;H,5,65;N、6.
06;実測値;c、 62. 15.H,5,81;N、6. 17゜
FMOC成分を、前記の如く、除去してtyr−ala−a 1 a−a 1
a−ADR(13) ・HOAcを得た。最終脱保護生成物収量:65mg(7
6%);融点、168〜170℃;Rf:0.43 [クロロホルム/メタノー
ル8:5H20の元素分析;計算値;c、53. 20;、 6. 27;N、
6.63;実測値C,53,01、H,5,98;N、6.91゜
7.1.14.TYR−VAL−LEU−LMS−ADH(14)
FMOC−(0−t−ブチル)Tyr−Val−ベンジル エステル
FMOC−(0−t−ブチル)Ty r (8,0gm、17゜4mモル)を窒
素雰囲気下、−110℃においてTHF 100m1に溶解させた。N−メチル
モルホリン(1,9ml、17.4mモル)を加え、5分後イソブチルクロロホ
ルメート(2,25m1,17.4mモル)を続けた。15分後、val−ベン
ジルエステル−pトシレート(6,6gm、17.4mモル)とN−メチルモル
ホリン(1,9ml、17゜4mモル)をTHF50mlに加えた。反応混合物
を一10℃において1時間撹拌しながらインキュベートし、さらに室温で18時
間続けた。溶媒をロータリー蒸発で除去して油状とし、該油状物を酢酸エチルに
溶解させ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(2X) 、5%クエン酸(3X)お
よび水(2X)で抽出した。存機相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、ロータリー蒸
発で濃縮した。その後、残留油状物をクロロホルムに溶解させシリカゲルを2度
通して未反応Fメタノール量が増加した(20%まで)。生成物含有フラクショ
ンは、まだ出発原料で汚染されているので、第2溶離は、クロロホルムのみを使
って2X3.5インチブフナーロート中のシリカゲルを介して行った。
生成物含有フラクションををプールし、ロータリー蒸発で濃縮して固形状とした
。エタノールからの再結晶化では、濾別化され、かつ真空で乾燥される白い固形
物を生じた。
収量: 9.38gm (83%)、融点、130〜131゜5℃、Rf :Q
、 89 [クロロホルム メタノール9:1(シリカ)、] 、Rf、0.9
3 [クロロホルム/酢酸/メタノール90:5:5(シリカ)コo Ca o
Ha a N 206の元素分析。計算値、C,74,05;H,6,84;
実測値;c、73.90.H,6,90゜FMOC−(0−t−ブチル)−Ty
r−ValFMOC−(0−t−ブチル)tyr−val−ベンジルエステル(
3,69gm、5.70mモル)酢酸1ml含有塩化メチレン25m1に溶解さ
せた。この混合物に活性炭上の5%Pd触媒1grAを加えた。この系は、90
分間窒素でバブルされ、その後酢酸1ml含存触媒5omgを加えた。バブリン
グを30分間続けた。セライト(Celite)を用いて触媒を濾別し、濾液を
ロータリー蒸発によって濃縮して固形状にした。この固形物をメタノールに溶解
し、水で沈降せ、石油エーテルで沈降させた。濾別および真空中での乾燥は、純
粋な生成物を与えた;収量3.19gm(100%);融点109〜110℃、
Rf ;o、69 [クロロホルム/酢酸/メタノール90:5:5(シリカ)
1.0.49[塩化メチレン/メタノール9:1(シリカ)]。C35H38N
2 oa ノ元素分析;計算値C,70,95;H,6゜85;実測値C,70
,77、H,6,90゜FOMC−(0−t−ブチル)Tyr−Valヒドロキ
シスクシンイミドエステル
FMOC−(0−t−ブチル)tyr−val (1,0gm、1.8mモル)
とN−ヒドロキシスクシンイミド(210mg、1.8mモル)を窒素雰囲気下
、0℃においてTHF40mlに溶解させた。ジシクロへキシルカルボジイミド
(D CC)を塩化メチレン溶液(0,5M、3.6ml。
1.8mモル)に加え、反応混合物を2時間撹拌しながらインキュベートして4
℃で一夜貯蔵した。TLCは、不完全反応を示したので、さらにDCC(0,4
5mモル)を加え、反応混合物を1日間室温でインキュベートした。生成ジシク
ロへキシルウレア(D CU)を濾別し、濾液を濃縮して固形物とし、該固形物
を4%炭酸水素ナトリウムとともに破砕した。この固形物を濾別し、水洗し、乾
燥し、その後クロロホルム/石油エーテルから結晶化した。白い固形物が濾別で
得られ、空気乾燥した。収量ニア61ng(65%);Rf:0.75 [クロ
ロホルム/メタノール9:1(シリカ)] o’C37H41N30B ・0.
5H20(1’)元素分析:計算値:C,66,85,H,6,37;実測値:
C,67、04;H,6,85゜
Leu−(FMOC)Lys
BOC−Leu−N−スクシンイミド(BOC−Leu−O5u)を、アンダー
ソン等の方法に従って調製した収it : 4.89gm(50%):融点、1
11〜112°C(少量116℃):Rf ;o、83[クロロホルム/酢酸/
メタノール85:5:10(シリカ)]。
BOC−Leu−O3u (1,64gm15.0mモル)と、ニブシロン−F
MOC−1y s (1,84gm、 5− 0mモル)をTHFに溶解させ、
3日間撹拌しながらインキュベートした。TLCは、leu成分の消費を示した
が、未反応1ys成分が残っていた。BOC−1eu−O3u(0,828m、
2.5mモル)をさらに加えた。1日間撹拌後、lys成分の全てが反応した。
溶媒をロータリー蒸発で除去し、希釈HCΩ (pH2)とともに粉砕される油
状物を残し、冷却した。生成固形物を濾別し、真空中で乾燥した。
得られた粗BOC−1eu−(FMOC)1 ysをTFA25mlに溶解し、
1時間撹拌した。TFAをロータリー蒸発で除去し、冷エーテルで一夜処理され
る油状物を残した。生成固形物を濾別し、空気乾燥した。収ffi:1.73g
m (BOC−Leu−O3uから全体で58%)、;Rf:0.781:n−
ブタノール/酢酸/4:1:1(シリカ)コ;Rf:0.28[クロロホルム/
酢酸/メタノール85:5:10(シリカ)コ。多少の不純物が存在した。その
後、この物質をアンバーライトCG−400(CΩ)−形)上でメタノール/水
1:1で溶離させ、不純物の部分除去を行った。溶媒をロータリー蒸発で除去し
、凍結乾燥した。
FMOC−(0−t−ブチル)Tyr−Val −Leu −(FMOC)Ly
s
L e u −(FMOC) 1 y sの遊離塩基は、粗1eu−(FMOC
)1ysHC1塩(545mg、1.0mモル)ジイソプロピルエチルアミン(
174u 1,1.0℃モ)とをTHF60ml中で10分間撹拌しながら反応
させて、遊離させられた。生成沈降物を濾別し、THF中のFMOC−(0−t
−ブチル)tyr−val−O3u (604111g、0. 91mモル)を
加えた。次の5日間にわたって、TLCが1 e u −(FMOC) 1 y
s成分消費を示すので、付加的なアリコートの1 e u −(FMOC)
1 y s (遊離塩基)を加えた(添加1 e u −(FMOC) 1 y
s HCΩ全量: 210mg、0.4mモル)。溶媒をロータリー蒸発で2
0m1に濃縮し、その後、反応混合物を冷10%酢酸に注いだ。自沈が生成し、
該自沈を濾別し、水洗、イソプロパツールから結晶化および真空で乾燥した。収
量=50011g(48%);融点218℃(分解)、Rf ;o、83[クロ
ロホルム/酢酸/メタノール90:5:5(シリカ)コ。
C60H71N501o・0.5H20の元素分析;計算値;C169,88;
H,7,04,実測値、C,69,83;H。
7.21゜
FMOC−Ty r−Va 1−L e u (FMOC) Ly sFMOC
−(0−t−ブチル)Tyr−Val−Leu−(FMOC)Lys (400
mg、0.39mモル)をアニソール2.2mlを有するTFA50+r+1に
溶解させ、30分間撹拌した。溶媒をロータリー蒸発して除去し、エーテルでも
って粉砕した後、固形物を得た。このものを濾別し、エーテル洗浄し、真空中で
乾燥した。収量:375mg(99%);融点、200℃(分解);Rf ;o
、42[クロロホルム/酢酸/メタノール90:5:5(シリカ)]。
C56H63N5010”H20の元素分析;計算値;C,68゜34、H,6
,65:実測値;c、 68. 60;H,6゜55゜
FMOC−Tyr−Va 1−Leu−(FMOC)Lys−ADH
FMOC−Ty r−Va 1−Leu−(FMOC)Lys (96mg、0
.10mモル)とN−ヒドロキシスクシンイミド(13+ng、O,l1mモル
)をDMF20mlに溶解し、窒素雰囲気中で0℃に冷却した。1−エチル−3
−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDCI)(21mg、O
,l1mモル)を加え、反応混合物を2時間撹拌した。その後、ADR−HCρ
(59+ng、 0. 10mモル)とN−メチルモルホリン(12ul、0
.11mモル)を反応混合物に加え、室温で4日間撹拌した。溶媒をロータリー
蒸発で除去し、水洗後2×10インチ シリカゲル フラッシュ クロマトグラ
フィーカラムに適用する、赤色固形物を残した。溶離は、クロロホルム/メタノ
ール95:5で行った。生成物フラクションをプールし、蒸発し、真空中で乾燥
した。収H: 55mg (36%):Rf、0L33[クロロホルム/酢酸/
メタノール90:5:5(シリカ)] ;Rf ;o、20 [クロロホルム/
メタノ実測値、C65,37;H,6,18゜FMOC成分を、ジエチルアミン
への暴露時間を1.25時間とした(HPLC観察した場合に完全反応を達成す
るためである)以外は、6.1.1節のFMOC−g I Y−ADR(14)
の記載の如く、FMOC−Tyr−Val−Leu−(FMOC)Lys−AD
Rから除去し、Tyr−Val−Leu−Lys−ADR(14)を得た。
7.1.15.バリル−ロイシル−リシル−バリル−ヒドロキシスクシンイミド
(525mg、4.56mモル)を窒素雰囲気下、DMF/CH2CΩ2に溶解
させ、−5℃に冷却した。ジシクロへキシルカルボジイミド(DCC)(8,8
5m1.塩化メチレン中で0.5M、4.42mモル)を加え、その混合物を0
℃で1時間、その後室温で1時間攪拌した。沈降物を濾別し、その濾液に、DM
Fの1eu−t−ブチルエステルHCN (990mg、4.42mモル)とN
−メチルモルホリン(0,5ml、4.45mモル)の混合物を加えた。攪拌は
、室温で14日維持し、その間に1.0当量のN−メチルモルホリンを加えた。
その後、溶媒をロータリー蒸発で除去し、そして酢酸エチルに再溶解し、10%
酢酸、水、飽和炭酸水素ナトリウム溶液および水で連続抽出される粗油状物を残
した。有機相をロータリー蒸発で濃縮し、更にフラッシュ クロマトグラフィー
(2×6インチ シリカゲル カラム、石油エーテル/酢酸エチル9:1)で精
製した。適切なフラクションを混合し、濃縮して乾燥した。収ftニア1311
I1g(32%)。
C30Ha o N 205の元素分析;:計算値、C,70,84;H,7,
93;N、5.51:実測値、C,70,72;H,7,98:N、5.43゜
FMOC−Va 1−L e u
FMOC−v a 1−1 e u −t−ブチルエステル(4゜00g、7.
86mモル)をN2雰囲気下、CN209215m1に溶解させ、トリフルオロ
酢酸15m1とアニソール0.5mlを用いて2時間処理した。溶媒を繰り返し
ロータリー蒸発でエーテル懸濁液から除去した。粗生成物を0℃でエーテルを用
いて粉砕し、濾別し、真空中で乾燥した。
収量: 3.04g (86%)、融点156〜159℃。Rf:o、13(シ
リカ、クロロホルム/酢酸エチル3:1)、C26H3□N2O5の元素骨°析
:計算値、C,69,01。
H,7,12,N、6. 19;実測値、 C,68,75;H,7,22;N
、6.10゜
FMOC−Va 1−Leu−(FMOC)LysFMOC−va 1−1 e
u (391mg、0.86mモル)とN−ヒドロキシスクシンイミド(108
mg、0.94mモル)を 窒素雰囲気下、D M F / CN2 CΩ2に
溶解させ、−5℃に冷却した。ジシクロへキシルカルボジイミド(DCC)(1
73m1.塩化メチレン中で0. 5M、0゜87mモル)を加え、その混合物
を0℃で1時間、その後室温で24時間攪拌した。沈降物を濾別し、その濾液に
、DMF15mlのニブシロン−FMOC−1ys (318■。
0.86mモル)を加えた。攪拌は、7日維持した。その後、溶媒をロータリー
蒸発で除去し、フラッシュ クロマトグラフィー(2×フインチ シリカゲル
カラム、クロロホルム/メタノール/酢酸ステップグラジェント97:3:0.
1〜95:5:0.1)で精製した。適切なプラクジョンを混合し、濃縮して乾
燥した。収量:410mg(60%)、融点195〜196℃、C47H54N
80B ・0.25H20の元素分析;:計算値、 C,69,91。
H,6,80、N、 6. 94 :実測値、C,69,90;H,7,01、
N、6.95゜
FMOC−Va 1−Leu−(FMOC)Lys−Va 1−ADR
FMOC−va 1−1 eu−(FMOC)1 ys (100mg、O,l
1mモル)、N−ヒドロキシベンゾトリアゾール(19mg、0.14mモル)
とN−メチルモルホリン(15uΩ、0.13mモル)を0℃において乾燥、ア
ミンを含まないDMFに溶解させた。10分間攪拌後、ビス(2−オキソ−3−
オキサゾリジニル)−ホスフィニック酸(BOP−CΩ、33mg、0.13m
モル)を加え、15分間攪拌した。その後、DMFのv a 1−ADR(5)
(71+ng、0.10mモル)とN−メチルモルホリン(25uΩ、0.23
rnモル)の懸濁液を加えた。0℃において1時間攪拌した。活性化ペプチドの
インクレメント(0゜07mモル)を同様に調製し、0℃において反応混合物に
加えた。1時間後、反応混合物を徐々に室温に加温し、さらに15時間攪拌した
。ロータリ蒸発後、粗生成物をフラッシュ クロマトグラフィーで2度(1×6
インチ シリカゲル カラム、CHCΩ3/メタノール100 : 0〜97:
3)精製した。適当なフラクションを集め、ロータリー蒸発で乾燥した。収量ニ
ア2mg(55%)oRf:0゜61(シリカ、クロロホルム/メタノール9:
1)、C79H87N601.・2.5H20の元素分析二計算値、c、64.
57;H,6,31;N、5.72;実測値、c、64.45.H,6,59,
N、5.75゜Va 1−Leu−Lys−Va 1−ADRg 1 y−AD
H(1)に記載したように、F M OC成分をFMOC−val−1eu−(
FMOC)1ys−val−ADRから除き、val−1eu−1ys−val
−ADH(15)を得た。(15)、HOAcの収量=2511+g(40%
) 、C53H69N601s・3.0HOAc、5H20(7)元素分析二計
算値、C,54,49;H,7,05゜N、6.46;実測値、C,54,54
;H,7,08;N、6.76゜
7.1.1B、バリル−ロイシル−リシル−アラニル−ADR(16)
FMOC−Va 1−Leu−(FMOC)Ly s−A 1−ADR
FMOC−Val−Leu−(FMOC)lysを、FMOC−va 1−1
eu−(FMOC)1 ys−va 1−ADR合成に使用した方法と類似方法
によって、ala−ADRにカップリングした。使用試薬量は、次のようであっ
た: FMOC−va 1−1eu (FMOC)1 ys (133mg、0
.15mモル)。N−ヒドロキシベンゾトリアゾール(28+ng、0.21m
モル)、N−メチルモルホリン(17uΩ、0.15mモル) 、BOP−CΩ
(38mg。
0.15mモル)、およびDMF懸濁液としてala−ADH,HOAc (2
)(97mg、0.14mモル)とN−メチルモルホリン(33u、Q、0.3
0mモル)。フラッシュ り07トグラフイー後、FMOC−v a 1−1
e u−(FMOC)、1 ys=a 1 a−ADH78mg (39%)が
得られた。Rf二0.27(シリカ、クロロホルム/メタノール94 : 6)
。この物質は、さらに特性化することなく、脱保護化された。
Va 1−Leu−Lys−Al a−ADRg 1 y−ADH(1)に記載
の如く、FMOC成分をFMOC−va 1−1 eu −(FMOC) 1
y s−a 1 a −ADRから除き、va 1−1 eu−1ys−a 1
a−ADH(16)を得た。(16)、HOAcの収量:22mg(38%)
、C47H66N601s” 2HOAc ・5.5H20の元素分析、計算
値;c、52.16;H,7,30;N、7.16;実測値:C,52,09;
H,7,07゜N、7. 56゜
7.1.17.グルタミル−(ガンマ−ヒドラジド)−グルタミン酸−α−t−
ブチルエステル(5,90gm。
29.0mモル)を室温で水/アセトン(1:1) 120m1の炭酸水素ナト
リウム(2,42gm、29.0mモル)溶液に攪拌しながら加えた。モの後、
9−フルオレニルメチルスンイミジルカーボネート(9,77gm、29.0m
モル)を均質溶液に加え、4時間攪拌した。揮発性有機物をロータリー蒸発で除
去した。生成水性懸濁液をエーテルで十分に抽出した。合わせたエーテル抽出物
を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濁るまでロータリー蒸発で濃縮した。
結晶を生長させ、さらに冷却した。これらを濾別し、空気乾燥した。収量: 1
0.6gm (86,5%);融点、106〜108℃;Rf:0.84[クロ
ロホルム/酢酸/メタノール90:5:5(シリカ)]。C24H27NO6:
計算値:C,67,75,H,6,40,実測値:C,57゜59、H,6,4
5゜
FMOC−G 1 u−a −t−ブチル−エステル−γ−(N’−FMOC−
ヒドラジド)゛FMOC−グルタミン酸−α−t−ブチルエステル(2゜00g
m、4.7mモル)と2.4−ジニトロフェノール(0,95gm、 5. 1
mモル)を窒素雰囲気下、酢酸エチル50m1に溶解させた。0℃に冷却後、D
CC(0,5M。
9.5ml、4.75mモル)を加えた。反応混合物を0℃において1時間攪拌
しながらインキュベートした。その後、反応混合物を徐々に室温に温め、24時
間撹拌しながらインキュベートした。活性エステル生成は、TLCで確認された
[Rf : 0. 92 [クロロホルム/酢酸エチル3:1(シリカ)];0
.95 [クロロホルム/メタノール95:5(シリカ)]。生成りCU沈降物
を濾別し、その濾液を9−フルオレニルメチル力ルバゼート(1,208m、4
.72mモル)に直接加えた。24時間攪拌後、9−フルオレニルメチル力ルバ
ゼート(0,120gm、0.47mモル)を加えた。反応混合物をさらに24
時間攪拌しながらインキュベートし、その後、溶媒をロータリー蒸発で除いた。
生成油状物を酢酸エチルに溶解させ、5%炭酸水素ナトリウム水(水性相にさら
に色が現われなくなるまで)と水で2度抽出した。粗生成物は、硫酸ナトリウム
上で予め吸着され、1×9インチ シリカゲル(230〜400メツシユ)フラ
ッシュ クロマトグラフィーカラムに適用される。
溶離は次の段階で行なわれた。すなわち、(1)石油エーテル/酢酸エチル2:
1;(2)石油エーテル/酢酸エチした生成物を洗浄した。適切なフラクション
を集め、蒸発し、固形物とし、酢酸エチルに再溶解させ、石油エーテルで沈降さ
せた。固形物を濾別し、真空中で乾燥した。収量=2、 ’43gm (80%
);融点、144.5〜147℃;Rf:o、26[クロロホルム/酢酸エチル
3:1(シリカ)コ。C,、H3,H3os (7)元素分析;計算値;c、7
0. 78、H,5,94=実測値:C,70,71、H,5,9FMOC−g
1 u−r−(N’ −FMOC−ヒドラジド)FMOC−グルタミン酸−α
−t−ブチルエステル−γ−(N’ −FMOC−ヒドラジド) (2,00g
m、3.0mモル)をTFA50mlとアニソール2mlに溶解させ、室温で7
5分間攪拌し7た。溶媒をロータリー蒸発で除去し、油状物を残し、そこへエー
テルを加えた。微量TFAをロータリー蒸発でさらに除き乾燥した。エーテルを
得られた固形物に加え、2時間冷却後、固形物を濾別し、エーテル洗浄し、空気
乾燥した。収量: 1.65gm(91,0%):融点、160〜163℃;R
f:0. 52 Cクロロホルム/酢酸/メタノール90:5:5(シリカ)]
。Cs5H31H307・0.5H20の元素分析;計算値:C,68,39;
H,5,24;実測値:C,68,90,H,5,35゜
FMOC−G1 u−r−(N’ −FMOC−ヒドラジド)−α−3’ −、
A、DRFMOC−g 1 u’−7−(N’ −FMOC−ヒドラジド)(2
00mg、0.33mモル)を新たな窒素バブル化DMF5mlに溶解させ、窒
素雰囲気下、0℃に冷却した。N−メチルモルホリン(36uff、0.33m
モル)を加え、その反応混合物を5分間インキュベートした。その後、イソブチ
ルクロロホルメート(42ujL 0.33mモル)を加えた。DMF中のAD
H−H(J! (230mg、0.40mモル)とN−メチルモルホリン(44
u、Q、0.40mモル)の懸濁液を、活性化時間後部下した。混合物を0℃に
おいて1時間攪拌し、4℃において一夜攪拌しながらインキュベートした。溶媒
をロータリー蒸発した。油状残留物をクロロホルム/メタノール(95:5)に
溶解させ、2×10インチシリカゲル(230−400メツシユ)フラッシュク
ロマトグラフィーカラムに適用し、同一溶媒系で溶離した。適切なフラクション
を集め、ロータリー蒸発し固形残留物とした。残留物をエーテルに懸濁させ、濾
別し、五酸化リン(P205 )上で30℃において真空乾燥した。収量:24
5mg(77%):融点180〜193℃(分解);Rf:0.35 [クロロ
ホルム/酢酸/メタノール90:5:5: (シリカ)コニRf:0.31 [
:クロロホルム/メタノール95:5:5(シリカ)コ。C62H58N40、
フ・lH2Oの元素分析;計算値:(:、64.79゜H,5,26;N、4.
90:実測値: C,64,70。
QC−glu−(γ−ヒドラジド)−α−ADHから除去し、glu−(7−ヒ
ドラジド)−a−ADH(17) ・2HOAcを得た。(17)の収ffi:
16mg(89%)、融点188℃(分解)。C36H46N4017・2.
OH20の元素分析;計算値;c、51.29;H,5,98,N。
6.68;実測値:C,50,89:H,5,46;N。
6.42゜
FMOC−G 1 u−7−t−ブチルエステル−α−この化合物は、出発物質
として商業上有効なFMOC−グルタミン酸−γ−t−ブチルエステルを使用し
て、FMQC−g 1 u−a−t−ブチルエステル−7−(N’ −FMOC
−ヒドラジド)調製法に使用された方法と同一の方法で調製された。収量: 2
.46gm(79,0%);融点、141−144℃:Rf ;o、56 [ク
ロロホルム/酢酸エチル3:1(シリカ)]。C3sH3、N307 ・0.5
H20の元素分析:計算値: C,68,91、H,5,24:実測値:C,6
8,71、H,5,39゜FMOC−G 1 u−a−(N’ −FMOC−ヒ
ドラジド)この化合物は、出発物質としてFMOC−glu−γ−t−ブチルー
′エステルーα−(N’ −FMOC−ヒドラジド)を使用して、F M OC
−−グルタミン酸−γ−(N′ −FMOC−ヒドラジド)調製法に使用された
方法と同一方法で調製された。収量: 1.19gm(66,0%);融点。
174〜177℃、Rf ;o、13 [クロロホルム/酢酸エチル3:1(シ
リカ)] ;Rf:0.84 [クロロホルム/酢酸/メタノール90:5:5
(シリカ)]。C39H39N307 ・0,5H20の元素分析:計算値:C
,68゜39;H,5,24;実測値:C,68,71;H,5゜3つ。
FMOC−G 1 u−a−(N’ −FMOC−ヒドラジド)ラジド)(22
2mg、0.361mモル)を新たな窒素バブル化DMF10mlに溶解させ、
窒素雰囲気下で0℃に冷却した。N−メチルモルホリン(40uΩ、0.36m
モル)を加え、その反応混合物を5分間インキュベートした。
イソブチルクロロホルメート(47ug、0.36mモル)をその後加えた。4
分間の活性時間後DMF中のADR−H(lll (188mg、0.324m
モル)とN−メチルモルホリン(38uiJ、0.35mモル)の懸濁液を加え
た。
混合物を0℃において2時間攪拌した。この時点において反応はほぼ50%であ
った。それ故、グルタミル成分の第2活性化は、上記と同様に次の量を使用して
行なわれた。
FMOC−グルタミン酸−α−(N’ −FMOC−ヒドラジド)(100mg
、0.’ 163mモル)、N−メチルモルホリン(18+、l’、’ 0.1
63rnモル)、イソブチルクooホルメー’p (21ui)、0.163m
モル)。2時間後、反応はほぼ70%であり、グルタミル成分の次の活性化は、
第2活性化において使用された量と同一量を使用して実施された。2時間後、反
応が80%と推定され、溶媒をロータリー蒸発で除いた。油状残留物をクロロホ
ルム/メタノール(95:5)に溶解させ、1×10インチシリカゲル(230
〜400メツシニ)フラッシュクロマトグラフィーカラムに適用し、同一溶媒で
溶離させた。適切なフラクションを集め、ロータリー蒸発して固形残留物とした
。残留物をエーテルに懸濁させ、濾別し、30°Cにおいて五酸化リン上、真空
で乾燥した。収量:271mg(74%) :Rf :0.38 [クロロホル
ム/酢酸/メタノール90:5:5(シリカ)コ、Rf:0.27 mクロロホ
ルム/メタノール95:5(シリカ)コ。C62H5BN4017・3H20の
元素分析:計算値;c、62.83;、5.44;実測値:C,62,91、H
,5,41゜FMOC−g 1 u−a−(N’ −FMOC−ヒドラジド)−
γ−ADHのFMOC成分を、6. 1. 1節の記載の如く除き、glu−(
α−ヒドラジド)−7−−ADR(18)・2HOAcを得た。(18)の収量
:55mg(72%)。
C36H46N401□の元素分析;計算値:C,53,59;H,5,75;
実測値;c、53.47.H,5,84゜7.1.19.ヒドラジド スクシニ
ル−アドリアマイシン(19)
アドリアマイシン(58mg、0.10mモル)をTHF/DMF (20ml
/ 10m1)に懸濁させ、これにTHF(0,1M)に溶解したトリエチルア
ミン(0,10mモル)を加えた。その後、無水コハク酸(14mg、 0.
14mモル)を加え、その混合物を65時間攪拌しながらインキュベートした。
反応段階は、全アドリアマイシン全量がン肖費されるまで、TLC(Rfニスク
シニル−アドリアマイシン生成物:0.78;アドリアマイシン:0.46[n
−ブタノール/酢酸/水4:1:1 (シリカ))で追跡した。
スクシニル−アドリアマイシン(30mg、0.05mモル)を、次のように、
無水ヒドラジンにカップリングさせた:スクニシルーADHを乾燥窒素バブル化
DMFに窒素雰囲気下で溶解させ、0℃に冷却した。N−メチルモルホリン(1
,0当量)を加え、その混合物を約5分間イキンユベートした。イソブチルクロ
ロホルメート(1,0当量)を加え、その混合物を3〜5分間インキュベートし
た。無水ヒドラジン(1,0当量)をDMFに加えた。反応混合物を0℃におい
て1〜2時間、そして4℃において12〜16時間インキュベートした。溶媒を
35℃においてロータリー蒸発で除去した。精製は、調製用C−18逆相フラツ
シユクロマトグラフイーカラムを用いて溶離させ、すなわち、最初に水で未反応
ヒドラジンを除き、その後、メタノールで生成物を除いて、行った。ロータリー
蒸発で溶媒を除去し、凍結乾燥すると赤色固形物を生じた。収量二31mg(9
4%);融点165°C分解、Rf : 0.85 [n−ブタノール/酢酸/
水4:l:l: (シリカ)]:Rf:0.71[アセトニトリル10.1%T
FAI:1(逆相)]。
7.1.20. ヒドラジノアセチル−ADR(20)エチルヒドラジノ−アセ
テートHCΩ (5gm、32mモル)とNaOH(2,8gm、71mモル)
をエタノール/水(1: 1)200mlに溶解させ、室温で約2時間攪拌しな
がらインキュベートした。pHを濃縮HCffを用いてpH7,0に調節し、溶
媒をロータリー蒸発で除去し、油状物とした。TLC−均質生成物、ヒドラジノ
酢酸、が得られた。Rf : 0.15 [n−ブタノール/酢酸/水4:に1
(シリカ)コ。
ヒドラジノ−酢酸(4,1gm、32mモル)と炭酸水素ナトリウム(9,4g
m、112mモル)とを0℃においてTHF/水(1: 1)に溶解させた。T
HF中の9−フルオレニルメチルータロロホルメート(20,7gm、 80m
モル)を30〜60分間で滴下した。反応混合物を徐々に室温まで暖め、その温
度で15時間攪拌しながらインキュベートした。反応混合物をロータリー蒸発さ
せて揮発成分を除き、その後エーテル抽出してFMOC−CΩを除いた。
水性相を6MHCρを用いてpH3に調節した。この沈降した白い固形物を、濾
別し、白油エーテルで洗浄し、40℃においてP2O5上で乾燥した。収量:
15gm (88%):融点、108〜109℃(分解);Rf:0.7B [
クロロホルム/酢酸/メタノール90:5:5(シリカ)]。
C32H26N20S ” 1.5H20(7)元素分析: 計算値: C。
68.43;H,5,22,N、5.01;実測値:C168、71;H,5,
17;N、5.77゜6、 1. 1.節に記載の如く、ビス(FMOC)−ヒ
ドラジノ酢酸をADHにカップリングさせて、ビス(FMOC)−ヒドラジノア
セチル−ADRを得た。ビス(FMOC)−ヒドラジノアセチル−ADRの収量
=89%;融点159℃(分解) :Rf :0. 58 [クロロホルム/酢
酸/メタノール90:5:5(シリカ)]。CseH53N30.6の元素分析
;計算値: C,66、84、H,5,04:N、3. 98:実測値:C,6
6,94,H,5,53;N、3.89゜
上記の如く、FMOC成分を除きヒドラジノアセチル−ADR(20)を与えた
。脱保護最終生成物収量:13mg(75%)、融点206°C(分解):Rf
:0.13 [クロロホルム/酢酸/メタノール90:5:5(シリカ)]:R
f : 0.80 Cn−ブタノール/酢酸/水4:1:1カルボキシメトキシ
アミン へミハイドロクロライド(106mg、0.485mモル)とN−メチ
ルモルホリン(53uN、0.485mモル)とを0℃において窒素雰囲気下、
クロロホルム/メタノール(1: 1) 200m1t::加えた。クロロホル
ム中の9−フルオレニルメチル スクシンイミジルカーボネート溶液(325m
g、0.97rnモル)を30分間で滴下した。反応混合物を室温に暖め、15
〜20時間攪拌しながらインキュベートした。その後、反応混合物を55℃に加
温し、゛3時間インキュベートした。
溶媒をロータリー蒸発で除き、固形残留物を酢酸アセテートに溶解させ、O,I
MHCfI (5X)と水(4X)で捕物した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾
燥し、ロータリー蒸発で固形残留物とし、該残留物をエーテル洗浄し、40℃に
おいてP2O5上で真空乾燥した。収量:274mg(90%);融点190℃
(分解):Rf:0.58 [クロロホルム/酢酸/メタノール90:5:5(
シリカ)]。
6、 1. 1.節の如<FMOC−アミノキシ酢酸をADRにカップリングさ
せ、FMOC−アミノアセチル−ADRを生成させた。収量:42%:融点16
8〜170.5’C,Rf : 0. 38 [クロロホルム/酢酸/メタノー
ル90 : 5 : 5 (シ!J力)](JlC44H42N2015” I
H20’)元素分析値;計算値:C,61,68,H,54,18;N、3.2
8;実測値;c、61.92.H,5,56゜N、3.11゜
上記の如く、FMOC成分を除き、アミノキシアセチル−ADR(21) ・H
OAcを得た。収量:6mg(25%);融点192℃(分解);Rf:0.1
2 [クロロホルム/酢酸/メタノール90:5:5(シリカ)]:Rf:0゜
82[n−ブタノール/酢酸/水4:1:1 (シリカ)]。
C31H36N20 zs ’ 0. 5 H20(D元素分析: 計W値:
C。
54.30.H,5,50,N、4.10;実測値1cI54.07.)1.
5.65.N、4.77゜ビス(FMOC)−ヒドラジノ安息香酸ヒドラジノ安
息香酸(50mg、0.33mモル)と炭酸水素ナトリウム(983mg、0.
99mモル)とを0℃においてTHF/水(1: 1)に溶解させた。THF中
の983mモル)を30〜60分間で滴下した。反応混合物を徐々に室温に加温
し、その温度で15時間攪拌しながらインキュベートした。反応混合物からロー
タリー蒸発で揮発成分を除き、エーテル抽出し、9−フルオレニルメチルクロロ
ホルメートを除いた。水性相を6MHCρを用いてpH3に調節した。この沈降
した白い固形物を、濾別し、石油エーテル洗浄し、40℃においてP2O5上で
乾燥した。
収量:114IIIg(58%);融点146〜148°C(分解):Rf:0
.71 [酢酸エチル/石油エーテル1:1(シリカ)]。C37H28N20
6の元素分析、C,74,47;H,4,73、N、 4. 72 、実測値;
c、74.60゜H,4,77、N、4.66゜
7、 1. 1.節に記載の如(、ビス(FMOC)−ヒドラジノ安息香酸をA
DHにカップリングさせた。ビス(FMOC)−ヒドラジノベンゾイル−ADH
収世86%;融点174〜176℃;Rf:0.65[クロロホルム/酢酸/メ
タノール90:5:5(シリカ)]。C64H55N30.6・lH2Oの元素
分析:計算値;c、 67、42.H5、04、N、 3. 70 、実測値;
c、 67、65;H。
5.63 ;N、3.68゜
ジエチルアミンへの暴露時間を1.5時間とした以外は、上記の如(、FMOC
成分を除いてヒドラジノベンゾイル−ADR(22) φ2HOAcを得た。若
干のアグリコン生成物が観察されたが、上記の、抽出は生成アグリコン除去に有
効であった。(22)の収量:13mg(36%)。
7.1.12節に記載の如くビス(FMOC)−ヒドラジノ酢酸を調製し、7.
1. 1.節のg 1 y−ADHに記載の如(tyr−ala−ala−a
la−ADR(13)にカップリングさせた。収量58%;融点188℃(分解
)、Rf :0.10 [クロロホルム/酢酸/メタノール90:5:5 (シ
IJ力)] :Rf :0.86 [n−ブタノール/酢酸/水4:1:1 (
シリカ)コ。C77H77N7021・2゜5H2oの元素分析;計算値: C
,63,14、H,4゜47;N、6.72.実測値;c、 63. 26;H
,5゜89 ;N、6.46゜
上記の如く、FMOC成分を除去し、ヒドラジノアセチル−tyr−a 1 a
−a 1 a−aa 1−ADR(23) 。
2HOACを得た。15の収量:12mg(80%)、融点200℃(分解)
;Rf :0. 50 [n−ブタノール/酢酸/水3:1:1(シリカ)]
、Rf :0.44 [塩化メチレン/メタノール/水100:20:1(シリ
カ)]。
7.2.A D RとDNR13−ヒドラゾン誘導体ADRとDNRのC−13
ヒドラゾンは、酸ヒドラジドをADRまたはDNRのC−13ケトン成分と縮合
して合成される。
7.2.1−アドリアマイシン−アジピックジヒドラジド(24)
アドリアマイシン−アジピック ジヒドラジド(ADR−ADH)は、つぎのよ
うに合成された;ADR−H(Jl (145mg、0.25mモル)とアジピ
ック ジヒドラジド(4,358m、25mモル)とを水/メタノール(75m
l/ 25m1)混合物に溶解させた。混合物を光から保護し、室温で13日間
放置した。反応段階をTLC(Rf、生成物:O,,29,アドリアマイシン;
0゜48[アセトニトリル10.5%酢酸1:1(逆相プレート)]とHPLC
(C−18逆相);イソクラティック(1socratie)メタノール/3%
炭酸アンモニウム65:35)で追跡した。HPLC(<10%アドリアマイシ
ン)で判定の結果、反応が平衡である場合に、溶媒をロータリー蒸発、凍結乾燥
で除去した。残留物を水に再溶解させ、水で平衡にされた1×15インチC−1
8結合化シリカカラムに適用した。カラムを水2gで洗浄し、未反応アジピック
ジヒドラシトを除去した。その後、粗生成物メタノール洗浄で溶離させた。溶媒
をロータリー蒸発、最終凍結乾燥で除いた。未反応アジピックジヒドラジドを含
まないがHPLC分析でアドリアマイシン(く5%)を含むフルラフイーな赤色
固形物を得た(130mg、70%収量)。収量:130mg(70%)。
7.2.2.A D R−ペンタグルタミルヒドラジド(25)ADR−ペンタ
グルタミルヒドラジドを次のように合成した;
BOC−グルタミン酸−(γ−ベンジルエステル)4−樹脂
BOC−グルタミン酸−(γ−ベンジルエステル)−メリーフィールド樹脂(2
0,0gm、0.43m当fl/gm。
8.6mモル)から出発し、その後、グルタミル残基は、標準的なペプチド固相
合成技術を使用して、BOC−ブタミン酸−(γ−ベンジルエステル)の対称無
水物を用いる3連続反応によって加えられた。対称無水物は、次のように合成さ
れた:Boc−グルタミン酸−γ−ベンジルエステル(8,7gm、26mモル
)を0℃、窒素雰囲気下において塩化メチレンに溶解させた。ここへDCC(2
,7g。
13mモル)を加え、その溶液を2時間攪拌した。DCU沈降物を濾別、硫酸マ
グネシウム上での乾燥後、溶液をロータリー蒸発で油状に濃縮し、DMFに溶解
させ、脱保護樹脂に加えた。
フタロイル−(グルタミル−γ−エチルエステル)−(グルタミル−γ−ベンジ
ルエステル)4−樹脂フタロイル−グルタミン酸−(γ−エチルエステル)の対
称無水物(4,6rnモル)を上記の如く形成し、脱保護テトラグルタミル樹脂
(8,55gm、2.87mモル)に加えた。
ペンタグルタミル−ヘキサヒドラジド
ペンタグルタミル樹脂(4,,34gm、1.44mモル)、前記ステップで形
成されたものであるが、無水ヒドラジン9.6mlを含有するDMF22mlに
懸濁させ、室温で2日間攪拌した。その後、樹脂を濾別し、DMF、メタノール
。
塩化メチレン、メタノール、塩化メチレン、DMFおよび連続的に洗浄した。洗
浄物を集め、ロータリー蒸発して油状とした。メタノール処理すると固形物を生
じ、該固形物を濾別し、真空中で乾燥し、粗ペプチドーヒドラジドを得た。収量
: 1.50gm(100%):融点200℃(分解):ヒドラジドに対する陽
性アーリッヒ(Erhlich)テスト。
ADR−ペンタグルタミルヒドラジド
ペンタグルタミル−ヘキサヒドラジド(28,6mg、0゜038mモル)とA
DR−HC4) (110+ng、0. 19mモル)を水10m1に懸濁させ
、光から保護し、2日間穏やかに攪拌した。反応混合物をさらに4週間放置させ
た。セファデックスLH−20カラムを通して、水で溶離、適切なフラクション
をプールして部分精製を行った。プールしたフラクションを凍結乾燥してペンタ
グルタミルヒドラジド−ADR生成物を得た。
より短い反応時間(4日)が完全反応に十分であることを除いては、この合成法
は、(24)のものと同一であった。
を除いては、この合成法は、ADH−ADH(24)のものと同一であった。(
27)の収量54%。
7.2.5. [3HE −ジメチルアドリアマイシン−ADH(28)
ジメチルアドリアマイシン−A D H(M e 2 A D R−ADH)の
2ステツプが含まれていた。第1ステツプは、アミノ−糖側鎖に位置するアミノ
基におけるメチル化である。
Me2ADRのC−13ヒドラゾン誘導体は、第2ステツプにおいて調製される
。
[’ HE −3’−N、N−ジメチルアドリアマイシンH20中の[3H1−
CH20(50mCi、60mC1/ mモル、0.833mモル、2. 5m
1)溶液を有するCH3CN/H20(1: 1)2mlのADRHCΩ (4
8mg、0.083mモル)溶液を暗所で攪拌し、この混合物をCH3CN1m
1中のNaBH3CN (l1mg、0.167mモル)溶液に直ちに滴下した
。添加時間は、10分間であった。その後、更に20分間攪拌を続けた。生成物
をCH2C12(4X 1m1)で抽出した。プールした有機抽出物を、N2気
流中で蒸発してフィルム状とした。フィルムをMeOH2mlに再溶解させ、4
つの調製用TLCプレートに適用した(アナルテックユニプレート、テーパープ
レート、シリカゲルGF)。適切なバンド[RfO,31〜0.38.CHC,
Q 3/MeOH/H20(40: 10 : 1) ]を各プレートからこす
りおとし、プールし、CHCρ3/M e OH(8: 2)で洗浄した。洗浄
物を4滴の氷0fiAcで処理し、N2気流中でフィルム状に蒸発させた。TL
C(アナルテック シリカゲルGHLF、CHCf13/MeOH/H20[4
0: 10 : 1] 、Rf、0゜34)とHPLC(ライニンミクロソーブ
C18;MeoH/H2065: 35.3%NH40Ac含有)分析は、均質
生成物を示した。収量ニアmg(13,5%)。
[’ Hll −3’−N、N−ジメチルアドリアマイシン−アジピックジヒド
ラジド
ステップ1からのフィルム状残留物を3適の氷酢酸とともにM e OH1ml
に溶解させ、その後、全量が溶解するまでH220ml中のアジピックジヒドラ
ジド(195mg、1゜12mモル)懸濁液とともに攪拌した。反応物を9日間
暗所に放置し、その間に溶媒をN2気流を使用して除去した。
残留物をH2O10m1に再溶解させ、小C−18逆相HPLCカラムに適用し
た。H2O1m1に再溶解させ、小C−18逆相HPLCカラムに適用した。N
20約5,00m1で洗浄後、部分精製生成物をメタノールで溶離させた。溶媒
をN2で蒸発させた。この物質のHPLC分析は、ADR−ADHの前調製物に
類似することを示した。すなわち、5〜10%の未反応親アンスラサイクリンと
ADH−アンスラサイリンダイマーを含有している。この第2ステツプにおける
全単離収量は、5+ng(56%)、生成物は、58゜3mC1/mモルの特異
活性において367uCiを含有7.3.1.DNR−14−8−(3−プロピ
オニルヒドラジド)(290)
14−ブロモ−DNR(50%g)を、0℃において窒素雰囲気下、乾燥メタノ
ール10m1中で、N2 CO3(12mg)と混合した。メタノール5mlに
溶解した2−メルカプトプロピオニルヒドラジド(14mg)’G加え、反応混
合物を0℃において40分間攪拌しながらインキュベートした。
溶媒を窒素気流中で除き、TLCを用いてS−アルキレーションとN−アルキレ
ーション生成物であると推定される2成分混合物であるこが示される不純物固形
物を残した。
好ましくないN−置換を避けるため、N−FMOC−3−メルカプト−プロピオ
ニルヒドラジドが合成できた。脱保護後、チオ−エーテルのみを生産すべきであ
る。
8、抗体複合体の調製
一連の実験において、ADR−ADH−抗体複合体は、次に示されるように、本
発明に従って調製された。
セルチック(Cal 1tech)から得られたヒトアデノカルシノーマ抗原に
特異的であるR72.3と指定されたマウスモノクローナル抗体(Coache
r et al、、 1981. Proc、 Nat’IAcad、 Sci
、υSA 78:3199−03)が、使用された。
R72,3抗体のオリゴ糖成分を、氷上で1時間、リン酸緩衝溶液(PBS;0
15M NaCΩ、O,01MPO4−2,pH6,0)中で暗所においてNa
IO410mMでインキュベーションすることによって酸化する。過剰NaI○
4を、PBSに対する透析によって被酸化抗体から除いた。その後、PBS中の
修飾抗体(1,2mg/ml)を37°Cにおいて3時間30倍過剰でADR−
ADHとインキュベートした。未反応ADR−ADHを、pH7,5においてP
BSを有するダウエックス50Wカラムを介して、反応混合物を溶離させて除い
た。°回収ADH−ADH−872.3複合体を、カチオン性デタージエント移
動相、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド(0,5%CTAB、 0.0
5M Na0Ac、 0.1M NaCj2)を有スるバイオシルTSK250
カラムのゲルフィルトレージョンPHLCで、分析した。遊離ADH−ADHは
検出されず、ダウエックス50Wカラム(2ml樹脂/ 100 mg複合体、
pH7,0)で溶出を遂行した。複合体の最終抗体濃度は、2.4mg/Ωであ
り、複合体は、872.31モル当り、1.6モルのADR−ADHを含有して
いた。
[3HコーM e 2 A D R−A D HをN7.23の被酸化成分にカ
ップリングさせ、77.000cpm1500ugの特異活性および3.5モル
の[3Hl Me2 ADR1モル抗体含有高水溶性複合体を得た。
8.3.イダルビシンーADH−抗体複合体イダルビシンーADHをR72,3
の被酸化成分にカップリングさせ、3.8モルIDA1モル抗体含有高水溶性複
合体を形成した。
8.4.A D R−ペンタグルタミルヒドラジド抗体複合体ADR−ペンタグ
ルタミルヒドラジドをR9,75被酸化炭水化物成分にカップリングさせ、6モ
ルADR1モル抗体含有高水溶性複合体を形成した。
ADH−E−γ HYを、0.05M M、OPS、MESまたは炭酸水素バッ
ファー中において20倍過剰でインキュベーションすることによって、872.
3またはN4抗体の被酸化炭水化物成分に選択的にカップリングさせて、ADR
−Glu−r−ヒドラジド−抗体複合体(2,5モルADR1モル抗体)を形成
した。
8.6.ADR−GLU−(α−ヒドラジド)(ADR−E−α−Hy)抗体複
合体
おいて20倍過剰でインキュベーションすることによって、872.3またはN
4抗体の被酸化炭水化物成分に選択的にカップリングさせて、若干の塊を有する
ADR−Glu−α−ヒドラジド抗体複合体を形成した(2モルADH1モル抗
体)。
9、部位選択性アドリアマイシン−アジピックジヒドラジド−抗体複合体の治療
効果
9.1.結腸ヒトアデノカルシノーマに対する治療効果次の一連の実験は、本発
明に従って調製された部位選択性アドリアマイシン−アジピック酸ジヒドラジド
(ADR−ADH)およびアドリアマイシン−αグルタミル−γ−ヒドラジド(
ADR−E−γ−Hy)抗腫瘍抗体複合体がインビボ投与されるとアデノカルシ
ノーマ腫瘍異種移植片に顕著な治療効果を有すことを、示す。対照的に、ADH
−ADH単独または部位選択的に付着した非関連抗体は、非処置動物と比較する
と、腫瘍異種移植片の生長と何ら異なることがない。 実験で使用された腫瘍細
胞系は、ボグデン ラボラトリーズ(マチューセッツ州 ワーチェスター)から
得られた、ヒト結腸アデノカルシノーマ腫瘍BL/CX−3であった。この細胞
系は、セントヨーゼフ病院(テキサス州ヒユーストン)において50令の老人か
ら得られた転移性物の新たな外科的体外移植組織からヌードマウスに確立された
。予備実験(結果は示さない)は、BL/CX−3細胞系がADH(副腎小体ア
ッセイ)に必須であり、コルチャー等(Icher et al、 1982.
Proc、 Nat’L Acad、 Sci、 USA 78: 3199
−03)により記載されたモノクローナル抗体B72.3によって特に確認され
たTAG−72抗原を表わすことを示した。
ある実験において、腫瘍特異ADR−ADH−抗体複合体を、第8節に記載の如
< (ADR−ADH−B72.3と称する)、(セルチックから得られた)B
72.3抗体を用いて調製した。第8節に記載如くの、ブラウン ノールウェイ
ラットのクラスIメイジャーヒストコンパティビリティ抗原(Smilek
et at、、 1980. J、 Exp、 Med、 151:1139参
照のこと)に特異的なR9,75抗体を用いて、関連のないADR−ADH抗体
複合体を調製した。
インビボ治療効果は、第4シリーズマウス継代接種において0日に約3mm3の
BL/CX3で皮下注入された平均28gのメスヌードマウス(N I Hスイ
ス ウェブスター、タコニック ファーム、ジャーマンタウン、ニューヨーク)
で評価された。
80の腫瘍発生マウスを各10匹づつの8グループに分けた。腫瘍が計測可能と
なった7日から始め、次の処置プロトコール1こ従って7.14.21.28お
よび35臼1こ治療剤を動物の静脈内(尾の静脈)に注射した。
グループ1(対照)、非処置;
グループ2.0.92mg精製872.3抗体(腫瘍特異抗体);グループ3.
1.0 mg精製R9,75抗体(非関連抗体)ニゲループ4. Bug AD
R−ADH−B72.3(0,96mg)(腫瘍特異ADR−ADH複合体);
グループ5. loug ADR−ADH−R9,75(0,99mg)(非関
連ADR−ADH複合体);
グループ6、200ug ADR−ADH;グループ7、200ug ADR[
約7 mg / )cg体重;最高耐性投与量(mtd)/動物] ;そして
グループ8.200ug ADR+0.92mgB72.3 (特異抗体十薬の
混合物)。
7日から76日にかけて2〜3日毎に動物を針足し、腫瘍を計測した(長さと幅
)。結果を第1図(A−F)に示す。
第1図(A−F)に示されるように、部位選択性ADH−ADH−(B72.3
)複合体(グループ4.第1C図)処置動物の腫瘍生長は、非処置グループ(P
o、 05. 12〜40日)と比較して顕著に阻害された。腫瘍阻害効果は、
約35日間200ugADR単独、すなわちほとんど最高ADH耐性投与量、を
受けた動物と同等と思われる。腫瘍生長阻害は、35日、すなわち処置の終りを
越えても継続した。
腫瘍異種移植注入に続く21日までに、図面に示されるように、腫瘍生長の統計
的に顕著な阻害は、非処置動物(グループ1)に比較して、部位選択性ADH−
ADH−(B72.3)複合体(グループ4)処置動物において観察された。対
照的に、ADH−ADH非関連抗体複合体処置動物(グループ5)は、非処置グ
ループと差がなかった。
同様に、腫瘍生長の統計的顕著な阻害は、ADR単独(グループ7)かまたは腫
瘍特異抗体との混合物(グループ8)のいずれかの最高耐性投与量で、ADH処
置された動物においても観察された。一方、等価投与量(グループ6、200u
g)において、ADR−ADH処置動物で観察された腫瘍生長は、非処置動物で
観察されたものと顕著な相違がなかった。
他の実験において、腫瘍特異ADH−ADH−B72゜3抗体複合体が上記の如
く調製された。同様に、腫瘍特異ADR−E−γ−Hy−B72.3抗体複合体
も上記の如と非関連A D R−E’−γ−Hy−H後合体は、上記の如くS4
抗体、腎性細胞カルシノーマ特異ネズミ抗体(ルロイドオールド、メモリアル
スローンーケッターリング、ニューヨーク州から得られもの)を用いて調製され
た。
110匹のメスヌードマウス(nu/nuスイス、タコニック ファームジャー
マンタウン、ニューヨーク州)は、各10匹ずつの11グループに分けられた。
マウスの平均重量は、23.6mgであった。0日に、グループ1を除く全グル
ープの動物は、第4シリアル継代接種において約3mm3 BL/CX3を注入
された。腫瘍が測定可能となった7日から始め、動物は、次のように7.14.
21.20および35日に治療剤を静脈内(尾の静脈を介して)に注入された。
グループ1、(生長対照)非腫瘍発生;非処置;グループ2.(対照)、非処置
;
グループ3.1.0 mg精製872.3抗体(腫瘍特異抗体);グループ4.
190ug A、DR(動物当りほぼmtd)ニゲループ5.12.4ug A
DR;
グループ6、190ug ADR+1.OmgB72.3[特異抗体十薬剤(m
td)混合物]
グループ7、12.4ug ADR+1.0 mgB72.3 [特異抗体+薬
剤(低投与量)混合物コ ;
グループ8.12.4ug ADR−ADH−872,3(1,08mg)(腫
瘍特異A D H−A D H複合体);グループ9.12.6ug ADR−
E−7−HY−B72.3(1,03■)(腫瘍特異ADH−E−γ−Hy複合
体);
グループ10.11.5ug ADR−ADH−84(0,46mg)(非関連
ADR−ADH複合体)ニ
ゲループ11.約10ug ADR−E−7−Hy−34(0,25mg) (
非関連ADH−E−7−HY複合体)。
腫瘍は、7〜40日かけて2〜4日間間隔で測定された。
結果は第2図(A−H)に示される。
第2図(EとF)に示されるように、腫瘍生長の統計的に顕著な阻害は、10〜
24日にかけて部位選択性ADH−ADH−872,3複合体処置動物(グルー
プ8、第2E図)および10〜17日ににかけて部位選択性ADR−E−γ−H
y−B72.3複合体処置動物(グループ9、これらは記載の実験だけから得ら
れたものを確認し、拡張した。対照的に、非関連抗体複合体抗体(グループ10
、第2G図とグループ11、第2H図)処置動物は、非処置グループとの差がな
かった。
薬剤単独、すなわち最高耐性投与量のADH(グループ4、第2図、A−H)処
置動物は、非処置動物と比較して、10〜〜40日にかけて腫瘍生長の顕著な阻
害を示した。
同様に、腫瘍生長は、最高耐性投与量の顕゛著な阻害を示した。同様に、腫瘍生
長は、最高耐性投与量における腫瘍特異抗体とADHとの混合物処理動物(グル
ープ6、第2c図)において阻害された。同一投与量において薬剤単独の場合と
比較すると、混合物を使用してもそれ以上の阻害は観察されなかった。しかしな
がら、重要なことに、特に顕著な阻害は、ADR単独(グループ5、第2B図)
かまたは腫瘍特異抗体との混合物(グループ7、第2D図)を複合体中の抗体に
カップリングさせたものと等価のADR処置動物において観察されなかった。
この実験は、部位選択性ADR−ADH抗腫瘍抗体複合体がインビボ投与される
とリンパ腫異種移植に対し治療腫瘍生長阻害効果を有することを示す。
上記の如く、ブラウン ノールウェイ(BN)ラットリンパ腫細胞系に特異なR
9,75抗体(“ADH−ADH−R9,75″と称する)を用いて、腫瘍特異
ADR−ADH抗体複合体を調整した。同様に、非関連ADR−ADH−抗体複
合体を上記の如く調製した。
20〜24g1Ilの70匹のメスヌードマウス(nu/nuスイス;タコニッ
ク ファーム、ジャーマンタウン、ニューヨーク州)を各10匹の7グループに
分けた。0日に、グループ1(非処置、生長対照グループ)のものを除き全マウ
スに1×10ブラウンノルウエイ(BN)リンパ腫細胞を注入した。1,5,9
.13および17日に、全実験グループのマウスは、次のように治療剤の静脈注
射(尾の静脈)を受けた;
グループ2、腫瘍発生、非処置;
グループ3.1.0mg精製R9,75抗体(腫瘍特異抗体単独);
グループ4.14Jug ADR−ADH;グループ5.14Jug ADR−
ADH+1.0 tr+gR9,75抗体(混合物);
グループ6 、 A D R−A D H−R9,75複合体(11,2HgA
DR−ADHカップリング1.0mgグループ7、ADR−ADH−非関連抗体
複合体(1,0mg抗体にカップリングした5、8Hg ADR−ADH)(非
関連複合体)。
研究期間中毎日、動物を軽量し1.腫瘍を計測した(長さと幅)。結果(平均±
SEM)は、第3図(A−B)に示される。
非処置対照動物、腫瘍特異ADR−ADH抗体複合体(グループ6)と非関連A
DH−ADH−抗体複合体(グループ7)を受けた平均腫瘍生長は、第3図に示
される。
ADR−ADH単独(グループ4)、腫瘍特異抗体とADR−ADHとの混合物
(グループ5)と腫瘍特異抗体単独(グループ3)を受ける動物の平均腫瘍生長
は、第3B図に示される。
第3(A)図に示されるように、部位選択性腫瘍特異ADR−ADH複合体(グ
ループ6)処置動物の腫瘍生長は、非処置腫瘍発生動物(グループ2)と比較し
て、極めて顕著に阻害(p=0.001)された。対照的に、抗体単独(グルー
プ3)ADR−ADH(グループ4)またはADR−ADH非関連抗体複合体(
グループ7)で処置された動物の腫瘍生長は、非処置動物(第3A−B図)と顕
著に相違しなかった。ADH−ADHと腫瘍特異抗体(グループ5)の混合物を
受けた動物の腫瘍生長は、非処置動物に比較して同様に顕著に阻害された(p=
0.01)。
ここに記載され、かつ請求された発明は、ここに開示さならば、これらの実施態
様は、本発明の数々の概念を示すことを意図するものだからである。いかなる等
価な態様もとに加えて本発明の多くの修正は、前記内容から当業者には明らかと
なるだろう。かかる修正は、添付請求の範囲の範囲内に入るだろう。
この実験は、(、[3Hl−ジメチルアドリアマイシン−ADH)[3Hコ−M
e 2 A D R−A D H抗体複合体が部位選択性である、即ち、大部
分のカウントは、アデノカルシノーマ腫瘍異種移植処置マウスの腫瘍に主に分布
するこ9とを示す。
放射性標識化M e 2 A D R−A D Rは、7.2.5節に記載の方
法で調製された。その後、8.2節に記載の方法を用いて抗体B72.3に共役
された。
平均25gのヌードマウスは、ヒト結腸アデノカルシノーマ細胞系、LSI74
Tの移植を受けた。腫瘍が10關X10m+aであると、通常移植後7日、異種
移植および正常(非腫瘍発生)マウスは、注射され、次の如く切断された;グル
ープ 異種移植 サ シ ブ ル 切断I LS174T B72.3− [3
HコーMe 2 ADR−ADH3日2 LS174T [3H]−Me 2
ADR−ADH3日3 なし B72.3− C3H1−Me 2 ADR−A
DH3日4 なし [3HコーMe 2’ADR−ADH3日動物を3日に切断
し、組織可溶化剤で器官を可溶化し、シンチレーション液を加え、βカウンター
で計測した。注入投与量g当りの%を計算した。結果を下記第2表および第4図
に要約する。
これらの研究からの結果は、平均的10%1.D、/gを有する抗体複合体が腫
瘍にのみ局在することを示す。遊離薬剤は、0.5%1.D、/g以下の局在お
よび牌臓への少量接種(1〜2.5%1.’ D、/g)を示した。
L(mm)xW(mm)
OL(mm)xW(mm)
口 L(mm)xW、(mm)
OL (mm)x W(mm)
口 L(mm)xW(mm)
1111 +L&% 、/LS1747 函Kkt+J /LS174T国際調
査報告
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.ヒドラジン、ヒドラジド、フェニルヒドラジン、フェニルヒドラジド、アル コキシアミン、フェノキシアミン、セミカルバジドおよびチオセミカルバジドか らなる群より選ばれた反応性アミンを含有する抗腫瘍性アンスラサイクリン抗生 物質からなるアンスラサイクリン抗生物質のアミン誘導体。 2.前記アンスラサイクリン抗生物質がダウノルビシン、ドキソルビシン、エピ ルビシン、エソルビシン、イダルビシン、カルミノシン、4−デメトキシ−4′ −O−メチルドキソルビシン、4′−O−テトラヒドロピラニル−ドキソルビシ ンおよび3′−デアミノ−3′−(3′′−シアノ−4′′−モルホリニル)ド キソルビシンからなる群より選ばれる請求の範囲第1項に記載の誘導体。 3.グルタミル−(7−ヒドラジド)−α−アドリアマイシン。 4.グルタミル−(α−ヒドラジド)−r−アドリアマイシン。 5.ヒドラジドースクシニル−アドリアマイシン。 6.ヒドラジノアセチル−アドリアマイシン。 7.アミノキシアセチル−アドリアマイシン。 8.ヒドラジノベンゾイル−アドリアマイシン。 9.ヒドラジノアセチル−チロシニル−アラニル−アラニル−アラニル−アドリ アマイシン。 10.アドリアマイシン−アジピックジヒドラジド。 11.アドリアマイシン−ペンタグルタミルヒドラジド。 12.ダウノルビシン−アジピックジヒドラジド。 13.イダルビシン−アジピツクジヒドラジド。 14.ジメチルアドリアマイシン−アジピックジヒドラジド。 15.ダウノルビシン−14−S−(3−プロピオニルヒドラジド)。 16.ダウノルビシン−14−N−メチル−(アチセルヒドラジド)。 17.グリシル−アドリアマイシン;アラニル−アドリアマイシン;D−アラニ ル−アドリアマイシン;イソロイシニル−アドリアマイシン;バリル−アドリア マイシン;チロシニル−アドリアマイシン;アルギニル−アドリアマイシン;ア ラニル−アラニル−アドリアマイシン;アラニルーアラニル−アラニル−アドリ アマイシン;D−アラニルーアラニル−アラニル−アドリアマイシン;チロシニ ル−グリシル−グリシル−アドリアマイシン;チロシニル−グリシル−グリシル −アルギニル−アドリアマイシン;チロシニル−アラニル−アラニル−アラニル −アドリアマイシン:チロシニル−バリル−ロイシル−リシル−アドリアマイシ ン;バリル−ロイシル−リシル−アラニル−アドリアマイシン;およびバリル− ロイシル−リシル−バリル−アドリアマイシンからなる群より選ばれたアンスラ サイクリン抗生物質の3′アシル誘導体。 18.共有結合を介してアンスラサイクリン抗生物質誘導体のアミン、および抗 体および抗体フラグメンドの被酸化炭水化物成分を付着させたアシン含有アンス ラサイクリン抗生物質誘導体を含み、かつ該アミンがヒドラジン、ヒドラジド、 フェニルヒドラジン、フェニルヒドラジド、アルコキシアミン、フェノキシアミ ン、セミカルバジドおよびチオセミカルバジドからなる群より選ばれた反応性の アミンから誘導されたものであり、そして(1)非複合抗体または抗体フラグメ ントと実質的に同一免疫特異性であり、かつ(2)水溶性であるのでインビボ投 与に好適であることを特徴とするアンスラサイクリン抗生物質−抗体複合体。 19.前記アミン含有アンスラサイクリン抗生物質誘導体がダウノルビシン、ド キソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、カルミノシン、4 −デメトキシ−4′−O−メチルドキソルビシン、4′−O−テトラヒドロピラ ニル−ドキソルビシンおよび3′−デアミノ−3′−(3′′−シアノー4′′ −モルホリニル)ドキソルビシンからなる群より選ばれたアンスラサイクリン抗 生物質から誘導される請求の範囲第18項に記載のアンスラサイクリン抗生物質 −抗体複合体。 20.前記アミン含有アンスラサイクリン抗生物質誘導体がグルタミル−(γ− ヒドラジド)−α−アドリアマイシン;グルタミル−(α−ヒドラジド)−γ− アドリアマイシン;ヒドラジドースクシニル−アドリアマイシン;ヒドラジノア セチル−アドリアマイシン;アミノキシアセチルーアドリアマイシン;ヒドラジ ノベンゾイル−アドリアマイシン;ヒドラジノアセチル−チロシニル−アラニル −アラニル−アラニル−アドリアマイシン;アドリアマイシンーアジピックジヒ ドラジド;ジメチルアドリアマイシン−アジピックジヒドラジド;イダルビシン −アジピックジヒドラジド;アドリアマイシン−ペンタグルタミルヒドラジド; ダウノルビシン−アジピックジヒドラジド;ダウノルビシン−14−S−(3− プロピオニルヒドラジド)およびダウノルビシン−14−N−メチル−(アチセ ルヒドラジド)からなる群より選ばれる請求の範囲第18項に記載のアンスラサ イクリン−抗生物質−抗体複合体。 21.前記アミン含有アンスラサイクリン抗生物質誘導体がアドリアマイシン− アジピックジヒドラジドである請求の範囲第18項に記載のアンスラサイクリン −抗生物質−抗体複合体。 22.前記アミン含有アンスラサイクリン抗生物質誘導体がグルタミル−(γ− ヒドラジド)−α−アドリアマイシンである請求の範囲第18項に記載のアンス ラサイクリンー抗生物質−抗体複合体。 23.前記アミン含有アンスラサイクリン抗生物質誘導体がイダルビシン−アジ ビックジヒドラジドである請求の範囲第18項に記載のアンスラサイクリン−抗 生物質−抗体複合体。 24.(a)抗体または抗体フラグメントを酸化剤と反応させて該抗体または抗 体フラグメントの炭水化物成分にアルデヒド基を形成し、そして (b)該抗体または抗体フラグメントの被酸化炭水化物のアルデヒド基とアミン 含有アンスラサイクリン抗生物質誘導体の反応性アミン基、すなわち該反応性ア ミンはヒドラジン、ヒドラジド、フェニルヒドラジン、フェニルヒドラジド、ア ルコキシアミン、フェノキシアミン、セミカルバジドおよびチオセミカルバジド からなる群より選ばれたものである、とを反応させて複合体、ここで該複合体は (1)水溶性が高いのでインビボ投与に好適であり、かつ(2)非複合抗体また は抗体フラグメントと実質的に同一免疫特異性で特徴づけられる、を形成してな る治療上有効なアンスラサイクリン抗生物質−抗体複合体の調整方法。 25.抗体または抗体フラグメントの被酸化炭水化物のアルデヒド基とアミン含 有アンスラサイクリン抗生物質誘導体の反応性アミン基、すなわち該反応性アミ ンはヒドラジン、ヒドラジド、フェニルヒドラジン、フェニルヒドラジド、アル コキシアミン、フェノキシアミン、セミカルバジドおよびチオセミカルバジドか らなる群より選ばれたものである、とを反応させて複合体、ここで該複合体は( 1)水溶性が高いのでインビボ投与に好適であり、かつ(2)非複合抗体または 抗体フラグメントと実質的に同一免疫特異性で特徴づけられる、を形成してなる 治療上有効なアンスラサイクリン抗生物質−抗体複合体の調整方法。 26.前記アミン含有アンスラサイクリン抗生物質誘導体がグノレタミル−(γ −ヒドラジド)−α−アドリアマイシン;グルタミル−(α−ヒドラジド)−γ −アドリアマイシン;ヒドラジドースクシニル−アドリアマイシン;ヒドラジノ アセチル−アドリアマイシン;アミノキシアセチルーアドリアマイシン;ヒドラ ジノベンゾイル−アドリアマイシン;ヒドラジノアセチル−チロシニル−アラニ ル−アラニル−アラニル−アドリアマイシン;アドリアマイシンーアジピックジ ヒドラジド;イダルピシン−アジピックジヒドラジド;ジメチルアドリアマイシ ン−アジピックジヒドラジド;アドリアマイシン−ペンタグルタミルヒドラジド ;ダウノルビシン−アジピックジヒドラジド;ダウノルビシン−14−S−(3 −プロピオニルヒドラジド)およびダウノルビジン−14−N−メチル−(アチ セルヒドラジド)からなる群より選ばれる請求の範囲第24項に記載の方法。 27.前記抗体フラグメンドがFabフラグメント、(Fab′)2フラグメン トおよび半抗体分子よりなる群から選ばれる請求の範囲第24項に記載の方法。 28.前記抗体または抗体フラグメントがモノクローナル抗体またはモノクロー ナル抗体フラグメントである請求の範囲第24項に記載の方法。 29.共有結合を介してアンスラサイクリン抗生物質誘導体と抗体または抗体フ ラグメントの被酸化炭水化物成分を付着させた治療上有効量のアミン含有アンス ラサイクリン抗生物質複合体を、動物またはヒトに投与してなる、ここで該複合 体のアミンがヒドラジン、ヒドラジド、フェニルヒドラジン、フェニルヒドラジ ド、アルコキシアミン、フェノキシアミン、セミカルバジドおよびチオセミカル バジドよりなる群より選ばれた反応性アミンから誘導されたものであり、該複合 体が(1)非複合体抗体または抗体フラグメントと実質的に同一免疫特異性であ り、(2)水溶性が高いので該複合体はインビボ投与に好適であることで特徴づ けられ、該抗体−複合体が細胞障害と関連した標的部位に免疫反応性かつ免疫特 異性であり、そして細胞障害と関連しない組織に実質的に免疫非反応性および免 疫非特異性である、ことを特徴とする細胞障害の治療処置方法。 30.前記アミン含有アンスラサイクリン抗生物質誘導体がダウノルビシン、ド キソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、カルミノシン、4 −デメトキシ−4′−O−メチルドキソルビシン、4′−O−テトラヒドロピラ ニル−ドキソルビシンおよび3′−デアミノ−3−4′−O−メチルドキソルビ シン、4′−O−テトラヒドロピラニル−ドキソルビシンおよび3′−デアミノ −3′−(3′′−シアノ−4′′−モルホリニル)ドキソルビシンからなる群 より選ばれたアンスラサイクリン抗生物質から誘導される請求の範囲第29項に 記載の方法。 31.前記アミン含有アンスラサイクリン抗生物質誘導体がグルタミル−(γ− ヒドラジド)−α−アドリアマイシン;グルタミル−(α−ヒドラジド)−γ− アドリアマイシン;ヒドラジドースクシニル−アドリアマイシン;ヒドラジノア セチル−アドリアマイシン;アミノキシアセチルーアドリアマイシン;ヒドラジ ノベンゾイル−アドリアマイシン;ヒドラジノアセチル−チロシニル−アラニル −アラニル−アラニル−アドリアマイシンニアドリアマイシン−アジピックジヒ ドラジド;ジメチルアドリアマイシン−アジピックジヒドラジド;イダルビシン −アジピックジヒドラジド;アドリアマイシン−ペンタグルタミルヒドラジド; ダウノルビシン−アジピックジヒドラジド;ダウノルビシン−14−S−(3− プロピオニルヒドラジド)およびダウノルビシン−14−N−メチル−(アチセ ルヒドラジド)からなる群より選ばれる請求の範囲第28項に記載の方法。
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