JPH0248532A - 制癌作用を有する生物活性物質の製造方法およびそれにより得られる制癌作用を有する生物活性物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、制癌作用を有する生物活性物質およびその製
造方法に関するものである。

〔従来の技術〕

制癌作用を有する生物活性物質の精製方法に関し、特開
昭５７−１４０７２６号公報記載の発明が開示されてい
る。

その概要は、網内系賦活化作用を有する物質の一種また
は二種以上を哺乳動物に投与し、次いでダラム陰性菌由
来のエンドトキシンを注射することにより誘発される制
癌作用を有する蛋白性生理活性物質の粗製溶液（あるい
は、哺乳動物由来の活性化マクロファージを含む組織培
養系にダラム陰性菌由来のエンドトキシンを加えること
により誘発される制癌作用を有する蛋白性生理活性物質
の粗製溶液）を塩基性イオン交換体に吸着させた後、そ
の溶出液を分子量３万〜７万の物質の分離に適した担体
を用いたゲル濾過に付し、さらに必要に応じて上記蛋白
性生理活性物質を含む両分を固定化シバクロンブルー−
Ｆ２Ｏ−Ａを用いたアフィニティークロマトグラフィー
に付すことにより、上記制癌作用を有する蛋白性生理活
性物質の精製を行う、というものである。

〔発明が解決しようとする課題〕

癌治療剤は、担癌生物の癌細胞（癌組織）に直接作用し
てこれを消滅させる、いわゆる癌化学療法剤と、癌細胞
（癌組織）の増殖によって低下した担癌生物の生体防御
機構を強化してその恒常性を回復させる、いわゆる癌免
疫療法剤とに大別される。

癌化学療法剤は、細胞毒作用を有する薬剤を使用するも
のであるために正常な細胞までもが障害を受けるという
副作用があり、その投与量には限度があるが、反面、投
与量が少ないと、癌細胞の存在する部位によって効果に
差が生じたり、癌細胞に薬剤耐性が生ずるなどの問題が
ある。

そこで、他の補助薬と組み合わせて使用することにより
、薬剤を癌細胞の存在する部位に高濃度に輸送する試み
や、癌細胞に対して特異的に作用するモノクローナル抗
体と薬剤とを結合させて癌細胞のみを攻撃しようという
試みなどがなされている。

一方、癌免疫療法剤は、担癌によって活性弱化ないしは
活性抑制を受けた免疫系を賦活化することによって透導
されたリンフ才力イン、モノ力インなどのサイト力イン
を介して抗腫瘍効果を引き出そうという目的で利用され
ている。

従って、癌免疫療法剤は、正常細胞に対する障害作用が
少ないという利点があるが、その反面、癌細胞（ｒＩ組
織）を特異的に直接攻撃するものではないことから、即
効性に乏しく、長期間投与を継続しなげればならないと
いう問題がある。

本発明者は、癌細胞を移植した哺乳動物の腹水中に含ま
れている生物活性物質の免疫賦活作用について研究を重
ね、制癌作用を存する生物活性物質を担癌生物の復水か
ら製造する技術を見出すに到ったものである。

本発明の目的は、制癌作用を有する生物活性物質および
その製造方法を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、癌細胞を哺乳動物の腹腔内に移植した後、抗
癌剤を前記腹腔内に投与し、さらに、同種の正常な哺乳
動物から採取した膵臓細胞を前記哺乳動物の静脈内に投
与して所定期間経過後、その腹腔内に貯溜した腹水を採
取してその上澄液をコーン分画法に付し、その第５画分
から制癌イ乍用を有する生物活性物質を得るものである
。

また、免疫監視療法によって改善の見られた癌患者の腹
腔内から腹水を採取してその上澄液をコーン分画法に付
し、その第５画分から制癌作用を有する生物活性物質を
得るものである。

〔発明の効果〕

本発明により得られた生物活性物質含有画分の所定量を
、あらかじめ抗癌剤を投与した担癌生物に数日間連続投
与した後、この担癌生物の生存日数を癌化学寮法の効果
判定基準に従って調べたところ、未投与の担癌生物に比
べて顕著な延命効果が認められた。これにより、上記画
分中に顕著な制癌作用を有する生物活性物質が含有され
ていることが判明した。

従って、本発明による生物活性物質は、制癌作用を存す
る生物活性物質として極めて有用なものである。

以下、実施例により詳細な説明を行うが、本発明は、下
記の実施例に限定されるものではない。

〔実施例１〕 ■移植用腹水型癌細胞の調製： マウス腹水型乳癌細胞の一系統であるＭＭ４６細胞をＣ
３Ｈ／Ｈｅマウス（雄、８週齢）の腹腔内に移植（ＩＸ
ＩＯ’　〜１０”　個／匹）してＭＭ４６細胞を増殖さ
せた。移植１０日後、上記担癌マウスの腹腔内に貯溜し
た復水を採取して遠心分離（８００ｒｐｍ、１０分）を
行い、増殖したＭＭ４６細胞を採取した。次に、このＭ
Ｍ４６細抱を生理食塩水に浮遊させ、２〜３回遠心分離
（８０Ｑｒｐｍ　、１０分）を行って残留赤血球を除去
した後、さらに生理食塩水に浮遊させ、ＭＭ４６細胞の
濃度が２８１０’　個／−となるように調製した。

なお、上記操作は無菌状態、かつ水冷下で行った。

■膵臓細胞の調製： 常法によりＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスの膵臓細胞を
調製した。すなわち、正常なり　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマ
ウス（雄、８週齢）から無菌的に採取した膵臓細胞を素
早くハンクス液（Ｈａｎｋ’ｓ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）　
　に浸し、次いで、この液を径６０ｓのシャーレ中のス
テンレスメツシュ（＃２００）で濾過して細胞浮遊液を
得た。さらに、この細胞浮遊液を遠心操作により、ハン
クス液で洗浄した。

次に、０．８３％ＮＨ＊（１：０．１７モルＴｒｉｓ　
−ＨＣβ＝９　：　ｌ　（ｐＨ＝７．６５）の混液を濾
過滅菌した。この緩衝液を牌−細胞ペレットの約ｌＯ倍
量加え、手早く撹拌してから低温で遠心分離（１０００
ｒｌ）ｍＳ１０分）を行い、生理食塩水で３回洗浄して
混在する残留赤血球を除去し、膵臓細胞調製品を得た。

この膵臓細胞調製品は、生理食塩水中に浮遊させた状態
で４℃、１６時間保冷してから用いた。

■　生物活性物質の製造： ■で調製したＭＭ４６細胞をＣ３Ｈ／Ｈｅマウス（雄、
８週齢）の腹腔内に移植（２Ｘ　１０’個／匹）した。

移植３日後、抗癌剤としてアクラシノン（ａｃ　ｌ　ａ
ｃ　ｉ　ｎｏｎ　；山之内製薬■製、塩酸アクラルビシ
ン、以下、ＡＣＲという）を腹腔に内投与（３ｍｇ／ｋ
ｇ）　した。

移植４〜６日後、■で調製したＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ
マウスの膵臓細胞を上記Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスの尾静脈内
に投与（ＩＸＩＯ’　個／匹）した。

移植２１〜２５日後、上記Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスの腹腔内
に貯溜した復水を採取した（その際、部のマウスから溶
血した腹水が得られたが、これは以下の工程では使用し
なかった）。

次に、採取した上記腹水中に含まれているＭＭ４６細胞
、血球などの細胞残渣を遠心分離（１００００ｒｐｍ、
２０分）で除去した後、上澄液を凍結乾燥させて濃縮し
、これをコーン分画法（Ｃｏｈｎ’ｓ　ｆｒａｃｔｉｏ
ｎ　：有機溶媒分画法）　に付してその第５画分を得た
。

く抗腫瘍効果試験〉 上記製法により得られたコーン分画の第５画分（以下、
腹水由来界という）の抗腫効果を調べるため、下記の試
験を行った。

試験方法： 上記製法に従って３種の腹水由来界を調製し、さらに、
対照物質である２種の腹水由来界を調製した（表−１）
。

表−１中、標品番号ｌを付した復水由来品は、前記ＭＭ
４６細胞をＣ３Ｈ／Ｈｅマウスの腹腔内に移植して２１
日８に同マウスの腹腔から採取した（ＡＣＲおよび膵臓
細胞を投与しない）ｌ１３［水を前記■の方法で処理し
て得た対照物質である。

なお、ＭＭ４６細胞のみを移植したマウスは、腹腔内に
腹水が貯溜し、移植後１８〜１９日目頃か日日亡（殆ど
が血性復水による）し始めたため、採取四散は少なかっ
た。

また、標品番号２を付した腹水由来界は、ＭＭ４６細胞
をＣ３Ｈ／Ｈｅマウスの腹腔内に移植して３日後にＡＣ
Ｒを腹腔内に投与（３■／ｋｇ）Ｌ、移植２１日８に採
取した腹水（膵臓細胞非投与のもの）復水を前記■の方
法で処理して得た対照物質である。

さらに、標品番号３．４．５を付したものは、１シ１　
１　　　　１　１　　（ 元状態を観察して下記の表−２（１−ｉ、１−Ｊｌ−ｋ
）に示す結果を得た。

また、ＡＣＲを投与しなかった対照群、およびＡＣＨの
投与後、上記腹水由来界に代えて市販のアルブミン（シ
グマ社製、ＬＯＴ　Ｎα４５Ｆ−９３３９）を投与（１
２，５ｍｇ／　ｋｇ）　した対照群などについても同様
の観察を行った。

なお、試験結果は、癌化学寮法の効果判定基準に従い、
生存日数中央値（！Ｊｅｄｉａｎ　５ｕｒｖｉｖａｌ　
Ｔｉｍｅ：以下、Ｍ、Ｓ、Ｔという）または平均生存日
数比（Ｔ／Ｃ％）を算出した。その他、平均生存日数、
および中間マウス（各群中、５番目に死亡したマウス）
の生存日数も求めた。

いずれも前記実施例法により得られた腹水由来界である
が、ＭＭ４６細抱を移植してから肺臓細胞を投与する迄
の期間（４日または６日）あるいは、腹水を採取する迄
の期間（２１日または２５日）を変えて調製したもので
ある。

標品番号３．４．５を付した腹水由来界は、いずれも黄
色を呈し、ＭＭ４６細胞が多量に存在する場合に見られ
る濁りは、標品番号１．２を付した腹水由来界に比べて
少なかった（なお、−邪ののマウスの腹水には少量の溶
血性腹水が認められたが、コーン分画法で分画する際に
はこのような腹水は使用しなかった）。

次に、前記■に記載した要領で調製したＭＭ４６細胞を
検定群（１０匹／群）のＣ３Ｈ／Ｈｅマウス（雄、８週
齢）の腹腔内にそれぞれ移植（２Ｘ１０４個／匹）し、
その翌日、ＡＣＲ（１０ｍｇ／ｋｇ）をそれぞれ腹腔内
に投与した。

さらにその翌日、上記標品番号１〜５の腹水由来界を連
日１０日間、腹腔内に投与（１２，５日１ｇ／ｋｇ）Ｌ
、その後４５日経過するまでのマウスの生試験結果（表
−２）： ＭＭ４６細胞のみを移植した対照群（１−ａ）のマウス
の腹腔内には、移植１０日日日から急速に復水が貯留し
、移植１９日日日から死亡し始め、移植２２日目迄には
全例が死亡した。

ＭＭ４６細胞移植後、ＡＣＲを投与せずに腹水由来品（
標品３または５）を連日１０日間投与した対照群（１−
ｂまたは１−Ｃ）のマウスの平均生存日数は上記無処置
群とほとんど同じく２１日前後であり、抗腫効果は認め
られなかった。

すなわち、本実施例法により得られた復水由来品を単独
投与した場合には、ＭＭ４６担癌マウスに対する延命効
果は認められなかった。

また、ＭＭ４６細胞を移植した翌日にＡＣＲを投与し、
腹水由来品を投与しなかった対照群（１−ｄおよび１−
ｇ）のマウスの平均生存日数は、ＡＣＲを投与せずに腹
水由来品を投与した前記対照群（１−ｂおよび１−ｃ）
のマウスよりも数日間長かったが、最終的には移植２９
日目迄に全例が死亡した。

次に、ＭＭ４６細胞を移植した翌日にＡＣＲを投与し、
その後、標品番号１の腹水由来品を連日１０日間投与し
た対照群（１−ｅ）、標品番号２の腹水由来品を連日ｌ
Ｏ日間投与した対照群（１−ｆ）、市販のアルブミンを
連日１０日間投与した対照群（１−ｈ）では、生き残っ
たマウスは各−匹であり、いずれも有意な延命効果が認
められなかった。

一方、ＭＭ４６細胞を移植した後、ＡＣＲおよび本実施
例法で得た腹水由来品（標品番号３．４．５）を投与し
た群（１−１、ｌ−ｊ、１−ｋ）のマウスは生存日数が
長くなり、４５日以降の生残率も高かった。この場合、
標品番号３．４．５の各腹水由来品の間では、延命期間
に及ぼす影響に有意差が認められなかった。

上記試験における代表的な群の試験結果を寿命的で表し
たものを第１図の上欄に示す。

次に、標品番号３を付した腹水由来品と同様の方法によ
って調製した腹水由来品にそれぞれ標品番号３′１およ
び３゛２を付し、第１回試験と同様の方法で引き続き第
２回および第３回試験を行い、表−３に示す結果を得た
。

なお、これらの試験では、ＭＭ４６細胞の移植後に検体
標品と同１ｉ（０，１ｍｊ！／回・匹）の生理食塩水を
１０日間連続投与した一群、ＭＭ４６細胞の移植後にＡ
ＣＲを投与した一群、およびＭＭ４６細胞の移植後にＡ
ＣＲを投与し、さらに（腹水由来品に代えて）市販のア
ルブミンを１０日間連続投与した一群を対照群として選
んだ。

試験結果（表−３） ＭＭ４６細胞移植の後にＡＣＨのみ投与した対照群（２
−ｂＪよび３−ｂ）は、生理食塩水のみを投与した対照
群（２−ａ＃よび３−ａ）に比べて多少の延命効果が認
められたが、最終的には１匹しか生存しなかった。なお
、対照群（２−ａおよび３−ａ）において、注射針の穿
刺刺激による延命効果は観察されなかった。

また、ＭＭ４６細胞の移植後にＡＣＲおよび市販アルブ
ミンを投与した対照群（２−ｃおよび３−ｃ）は、ＭＭ
４６１［１１胞の移植後にＡＣＲのみを投与した対照群
（２−ｂおよび３−ｂ）に比べて多少の延命効果が認め
られたが、生き残ったマウスは１〜２匹であった。

一方、ＭＭ４６細胞を移植した後、ＡＣＲおよび本実施
例法で得た腹水由来品（標品番号３°、または３°２）
を投与した群（２−ｄ、２−ｅ、３−ｄおよび３−ｅ）
は、上記対照群と比べて死亡開始日が遅れ、しかも移植
４５日経過後の生存数も増加するなど、顕著な延命効果
を認めることができた。

上記第２回および第３回試験における代表的な群の試験
結果を延命曲線で表したものを第１図の中、下欄に示す
。

以上の試験結果から、本実施例法によって得られる腹水
由来高中に顕著な抗腫効果を有する生物活性物質が産生
されることが明らかになった。

〔実施例２〕 癌患者に免疫監視療法〔財団法人がん免疫振興財団発行
、「がん免疫監視療法に関する研究・昭和５４年度研究
報告書」に記載された、いわゆる佐■療法〕を施し、改
善の見られた患者の腹腔内から腹水を採取した。次に、
この腹水中に含まれている細胞残渣を前記実施例１の方
法に準じて遠心分離で除去した後、上澄液を凍結乾燥さ
せて濃縮し、これをコーン分画法に付してその第５画分
を得た。

下記に示す症例Ｉ〜ｍは、この第５画分からなる生物活
性物質（ＢＲＰ）の抗腫効果を示す具体例である。

４、

【図面の簡単な説明】

第１図（Ａ） （Ｌ） は、 本発明法により得ら れた生物活性物質および対照群の抗腫効果を延命曲線で
表したグラフ図である。 特 許 出 願 人 佐 藤 英

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、癌細胞を哺乳動物の腹腔内に移植した後、抗癌剤を
   前記腹腔内に投与し、さらに、同種の正常な哺乳動物か
   ら採取した膵臓細胞を前記哺乳動物の静脈内に投与して
   所定期間経過後、前記腹腔内に貯溜した腹水を採取して
   その上澄液をコーン分画法に付し、コーン分画の第５画
   分を得ることを特徴とする制癌作用を有する生物活性物
   質の製造方法。 ２、前記腹腔内から採取した腹水を遠心分離に付して細
   胞残渣を除去し、その上澄液をコーン分画法に付すこと
   を特徴とする請求項１記載の制癌作用を有する生物活性
   物質の製造方法。 ３、哺乳動物がマウスであることを特徴とする請求項１
   記載の制癌作用を有する生物活性物質の製造方法。 ４、抗癌剤が塩酸アクラルビシンであることを特徴とす
   る請求項１記載の制癌作用を有する生物活性物質の製造
   方法。 ５、請求項１、２、３または４記載の製造方法により得
   られる制癌作用を有する生物活性物質。 ６、免疫監視療法によって改善の見られた癌患者の腹腔
   内から腹水を採取してその上澄液をコーン分画法に付し
   、コーン分画の第５画分を得ることを特徴とする制癌作
   用を有する生物活性物質の製造方法。 ７、前記腹腔内から採取した腹水を遠心分離に付して細
   胞残渣を除去し、その上澄液をコーン分画法に付すこと
   を特徴とする請求項６記載の制癌作用を有する生物活性
   物質の製造方法。 ８、請求項６または７記載の製造方法により得られる制
   癌作用を有する生物活性物質。