JPH0247101A

JPH0247101A - 高分子量のヒアルロン酸を製造する方法

Info

Publication number: JPH0247101A
Application number: JP19709088A
Authority: JP
Inventors: Yasuko Yoshizawa; 吉沢　康子; Koji Yamada; 浩司山田; Fumio Fukui; 福井　史生
Original assignee: Showa Sangyo Co Ltd
Current assignee: Showa Sangyo Co Ltd
Priority date: 1988-08-09
Filing date: 1988-08-09
Publication date: 1990-02-16
Anticipated expiration: 2014-05-24
Also published as: JP2893451B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、鶏冠等のヒアルロン酸含有原料から、高分子
量のヒアルロン酸を高純度、かつ高収率で製造する方法
に関する。

（従来の技術）ヒアルロン酸は、アミノ糖とウロン酸から成る複雑な多
糖類の一種である。動物諸組織、特に開光組織に広く分
布し、硝子体、水様液、ヘソの緒、関節液、肋膜液、皮
膚、ニワトリの鶏冠（いわゆるトサカ）等に多く含まれ
、動物組織にあっては、遊離酸および塩としてゲル状を
なして細胞間、および繊維間を埋める結合物質である。

粘稠性、保水性、潤滑性等の性質を有するヒアルロン酸
は、医薬や化粧品基材として需要が多く、高粘度、高純
度のものが要求されている。

従来、ヒアルロン酸を得るには、原料を水で抽出して得
た水溶液から塩化セチルピリジニウムで沈澱させ、塩化
ナトリウム溶液に溶解して、更にエタノールで再沈澱す
る方法が基本的方法として知られている。

また、品質の良いムコ多糖類を収率よく、大量に製造す
るためには、適切な原料の前処理が必要であることから
、多くの方法が提案されており、このことについては、
特願昭６２−２７３１９４号明細書に詳述した。例えば
、結合組織をその形状のまま約７０〜１３０℃に加熱処
理した後に蛋白質分解酵素処理し、常法により処理する
方法（特公昭６〇−９０４２号公報）、鶏冠をその形状
のまま、または裁断して３５〜６５℃で加温後蛋白質分
解酵素処理を行い、以下常法により処理する方法（特公
昭６１−８０８３号公報）、予め加熱処理したヒアルロ
ン酸含有原料をペースト化した後、プロテアーゼ処理す
る方法（特開昭６０−２４１９４号公報）等がある。

これらの方法は、いずれも大量に製造する方法として簡
単で効率の良い方法であるが、原料および製造工程中に
混入するヒアルロニダーゼが、ヒアルロン酸の低分子化
に作用し、また、長時間の加熱により品質を低下する等
の問題があった。

（発明が解決しようとする課題）一方、多糖類の精製手段の一つとして限外濾過膜処理が
ある。これは多糖類をエタノール等の沈澱剤での処理に
先立ち、溶液中に共存する無機塩類等の低分子の不純物
を除去し、もって高純度の多糖類を得るためのものであ
る。

しかしながら、多糖類溶液の限外濾過膜処理は、多糖類
溶液が一般に極めて粘稠なものであるため、高い圧力を
かける必要がある、濃縮率の増大に伴い膜透過速度が著
しく低下する、等の欠点があり、これを防ぐためには予
め処理液を大量の水で希釈したり、しかも膜の洗浄を頻
繁に行う必要があったりして、必ずしも効率的な方法と
はいえ・ない。

また、限外濾過膜（孔径は通常、０．００１〜０．０５
声）より孔径の大きな濾過膜としては、精密濾過膜と呼
称されるものがある。これは通常０．０５〜１０−程度
の孔径を有するものであるが、かなりの高分子物質をも
通過させることから、培養液の除菌等に使用されること
が多く、多糖類の生成に利用することは、従来全く行わ
れていなかった。

（課題を解決するための手段）本発明者らは、限外濾過膜処理における上記の欠点に鑑
み、種々検討を行った結果、孔径０．０５〜１−の濾過
材（以下単にＭＦ膜と略称する場合がある）を用いるこ
とによって上記課題を解決できることを見出した。

すなわち、本発明はヒアルロン酸を含有する溶液を孔径
０．０５〜１岬の濾過材に接触せしめ、続いて常法によ
り処理することを特徴とする高分子量のヒアルロン酸の
製造方法である。

以下本発明を詳述する。

原料としては、ヒアルロン酸を多量に含む結合組織を用
いる。このような原料としては、鶏冠、皮慮、項靭帯、
関節液、調帯、血管壁、軟骨、硝子体等が挙げられ、特
に多量に入手が容易な鶏冠が好ましい。原料は、採取し
て日数を、経るに従って、原料中に混在するヒアルロニ
ダーゼ（ヒアルロン酸の分解酵素）が作用してヒアルロ
ン酸を低分子化する、等の品質低下が生ずるので、採取
後、速やかに使用するか、あるいは急速冷凍して保存す
ることが望ましい。

これらの原料は、例えばその形状のまま約７０〜１３０
℃で加熱処理した後にミンチする（特公昭６０−９０４
２号公報）方法等、公知の方法により水分散液を調製す
る。なお、原料の水分散液として、前記の急速冷凍した
原料を解凍することな（、そのままミートチョッパー等
を用いて細断し、更にホモゲナイザー、超微粒粉砕機（
スーパーマスコロイダー等）を用いてペースト化し、こ
れを７０〜１４０℃で１〜６０秒間殺閑処理したものを
使用するならば、抽出工程におけるヒアルロニダーゼの
作用が防止され、しかも完全な失活が達せられるため、
従来法にない高分子量のヒアルロン酸を取得できるので
特に有利である。

本発明では、上記原料から常法によるプロテアーゼ処理
等によって得たヒアルロン酸を含有する溶液を、遠心分
離または濾過等により、固形物を除去した後、ＭＦ膜処
理に供する。膜処理に先立ち、前記濾液に再度プロテア
ーゼを添加し、混在する蛋白性の不純物を分解するなら
ば、その後の精製効率をより向上させることができる。

本ＭＦ膜処理の条件としては、一般に処理液中のヒアル
ロン酸濃度０．００５〜０．２％、温度４〜５０℃が採
用される。

本発明に適用できる濾過材としては、ポリサルフォン系
、ポリプロピレン系、酢酸セルロース系、ポリビニルア
ルコール系、ポリエチレン系のＭＦ膜の他、金属、ガラ
ス、セラミック等を焼結した濾過材等の公知の膜モジュ
ールのいずれをも使用できるが、その孔径が０．０５〜
１−であることを必須とする。すなわち、この範囲の下
限未満の濾過材では透過速度が小さく、しかも目詰まり
が激しいため、処理液を大量の水で希釈したり、処理に
極端な高圧を要し、しかも濾過材の頻繁な洗浄が必要で
ある。逆に上記範囲を上回る濾過材ではヒアルロン酸自
体がこれを透過してしまうため、製品の歩留りが著しく
低下する等、いずれも実際的ではない。かかる条件を満
足する濾過材として、具体的には（■クラレ製のＮＳＦ
−Ｍ８２０２（孔径０．３卿）等を挙げることができる
。

かかる濾過材による処理で非透過液として得られたヒア
ルロン酸画分は、そのまま、あるいは更に常法による沈
澱処理を経た後、乾燥して粉末製品を得ることができる
。この沈澱処理としては、例えば、透過液にそのまま、
あるいは必要に応じて第四級アンモニウム塩（例えば塩
化セチルピリジニウム）を添加して生成する沈澱物を食
塩水に再溶解する等の処理を施した後、エタノールを終
濃度が５０〜８５％（Ｖ／Ｖ）　　となるように添加す
る、等の方法がある。

（実施例）実施例１屠殺直後に採取した鶏冠を噴霧式冷凍装置を用い、液体
窒素で急速冷凍した。該冷凍鶏冠１　ｋｇをミートチョ
ッパーにより細断した。これにフレーク状の氷２　ｋｇ
を添加し、スーパーマスコロイダー（増幸産業■製）で
ペースト化した。得られたペーストを１３０℃にて３秒
間瞬間殺菌し、直ちに急速冷却した。水を２１加え、ｐ
Ｈを７．０に調整し、プロテアーゼとして、アクチナー
ゼＥ（科研製薬■製）３０■添加し、５０℃で３時間イ
ンキュベートし、得られた溶液を濾過した。以上の操作
を３回繰り返し得られた濾液をまとめ、９．５１を得た
。

該濾液をアルバックサービス■製精密濾過装置ＭＲ６１
−００１５（■クラレ製ＭＦ膜ＮＳＦ−Ｍ８２０２　（
孔径０．３ＪＭ）使用）を用い、温度３０℃、液の供給
圧力０．５ｋｇ／ｃｎｉで、処理液が当初の１７３とな
るまで循環処理した。内液２．１１を回収し、更に２１
の純水でモジュール内を洗浄、これを先の内液と合した
。

これに５（Ｗ／ν）％塩化セチルピリジニウム液１．８
１を加えた。

生成した沈澱物を濾取し、０．５Ｍの塩化ナトリウム溶
液に再溶解した。この溶液にエタノールを６０（ｖ／ｖ
）％になるように添加し、生成した沈澱物を濾取し乾燥
した。

実施例２実施例１におけるアクチナーゼＥ処理後の濾液９１に対
し、更にニュートラーゼ（ノボインダストリージャパン
■製）１０μｌを加え、５０℃に１時間保持した。反応
液を冷却後、２倍容の純水を加え、実施例１と同様のＭ
Ｆ膜処理に供した。内液が３１となるまで濃縮を行い、
以下凍結乾燥により乾燥品を得た。

比較例１実施例工におけるアクチナーゼＥ処理後の濾液３１に５
　（ｗ／ｖ）％塩化セチルピリジニウム液０．６１を加
え、生成した沈澱物を濾取して、０．５Ｍの塩化ナトリ
ウム溶液に再溶解した。この溶液にエタノールを６０（
ｖ／ｖ）％になるように添加し、生成した沈澱物を濾取
し乾燥した。

比較例２膜モジュールとしてダイセル化学工業■製の限外濾過膜
ＭＯＬＳＥＰファイバー、ＰＣ−Ｘ−０１を装着した濾
過装置ＨＳＤ−０５Ａを用いた他は実施例２と同様に処
理し、得られた非透過液を乾燥して、粉末状のヒアルロ
ン酸製品を得た。

実施例および比較例で得られたヒアルロン酸の収量、純
度、分子量を第１表に示す。

第１表注１）原料１　ｋｇ当たりの収量（ｇ）２）カルバゾー
ル硫酸法で測定したウロン酸量に２．０６を乗じて算出
。

３）ウベローデ型粘度計を用いて測定した極限粘度から
算出。

（発明の効果）本発明で用いる孔径０．０５〜１−の濾過材は、ヒアル
ロン酸の分子量（１００〜２００万ダルトン）からして
常識的には同分子をも通過させると考えられるところ、
予想外にもヒアルロン酸分子を通過させず、第１図に示
すように従来の限外濾過膜に顕著であった処理中の目詰
まりによる透過速度の低下も殆どなく、無機塩類等の低
分子の夾雑物や蛋白質が効率よく除かれ、純度が著しく
向上することが判明した。

しかも、更に驚くべきことには、上記処理によりＭｉ織
由来の金属イオン等が速やかに除去され、これらを媒介
としたヒアルロン酸の分解が抑制されるためと思われる
が、従来の方法では全く得られなかった極めて高分子の
製品が得られることが判った。このことは第１表に示す
実施例と比較例の分子量の比較から明らかである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、鶏冠をプロテアーゼ（アクチナーゼＥ）で処
理して得た実施例１のヒアルロン酸抽出溶液を、本発明
に使用するＭＦ膜および従来の限外濾過膜で処理する際
の、濃縮倍率（横軸）の変化に伴う透過速度（縦軸）の
変化を示すグラフである。透過速度は濾過膜−ｍ位面積
、時間当たりの透過量である。図中の実線（○印）は本
発明実施例に使用するＭＦ膜〔■クラレ製、ＮＳＦ−Ｍ
８２０２）、点線（×印）は対照の限外濾過膜（ダイセ
ル化学工業■製、ＭＯＩ、５ＥＰ７フイハー　ＦＣ−Ｘ
−０１）での変化を、それぞれ示している。

Claims

【特許請求の範囲】

ヒアルロン酸を含有する溶液を孔径０．０５〜１μｍの
濾過材に接触せしめ、続いて常法により処理することを
特徴とする高分子量のヒアルロン酸の製造方法。