JPH02452A

JPH02452A - クローン化ｄｎａ、これを含むプラスミドおよび微生物

Info

Publication number: JPH02452A
Application number: JP63075069A
Authority: JP
Inventors: Yoshifumi Inoue; 敬文井上; Masao Fukuda; 雅夫福田; Keiji Yano; 矢野　圭司; Emi Sunakawa; 砂川　恵美; Akihiko Mori; 森　明彦; Chuhei Imai; 今井　忠平
Original assignee: Kewpie Jyozo Co Ltd; QP Corp
Current assignee: Kewpie Jyozo Co Ltd; Kewpie Corp
Priority date: 1987-10-30
Filing date: 1988-03-29
Publication date: 1990-01-05

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、酢酸菌の改良（育Ｆｌｉ）に有用な、アルコ
ール脱水素酵素遺伝子に関するものである。

〔従来の技術〕

酢酸菌は、一般に水溶液中のアルコールを脱水素してア
ルデヒドに変換し、更にこれを脱水素して酢酸に変換す
る。この際各変換において、即ち、アルデヒドへの変換
のときにはアルコール脱水素酵素が、また酢酸への変換
のときにはアルデヒド脱水素酵素がそれぞれ作用し、ア
ルコール脱水素酵素（以下、単にＡＤＨと称す）の活性
と酢酸生成能は）目間的な関係を示すことが多い。従っ
て、ＡＤＨに対応する遺伝子（断片）が見い出し得るな
らば、これをクローン化ＤＮＡとして、例えば酢酸菌内
へ導入してＡＤＨ活性を高め延いては酢酸生成能を高め
るなど、菌の改良（育８）に役立てることが期待できる
。

しかし、酢酸菌の遺伝情報が乏しいこと、および遺伝子
操作技術の適用が容易でない等のために、これまで上記
したＡＤＨ遺伝子が取り出されていないのが現状である
。

〔発明が解決しようとする課題〕

従って、従来、ＡＤＨ遺伝子からなるクローン化ＤＮＡ
を菌の改良、育種に用い得ないという問題があった。よ
って、本発明はこのようなりローン化ＤＮＡを一提供す
ることを主たる目的とする。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、上記の目的に即して鋭意研究を重ね、本
発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、第一に、アセトバクター・アセチに１
００６株（微工研菌寄第７５２８号）（特開昭６０−１
８８０８０号公報参照）由来のアルコール脱水素酵素遺
伝子またはこれと機能的に等価な相同物を含むクローン
化ＤＮＡを提供するものである。

アルコール脱水素酵素遺伝子は、アルコールから水素を
璋ってアルデヒドに変換するＡＤＨに対応する遺伝子で
ある。また、これと機能的に等価な相同物とは、ＡＤＨ
の生成をつかさどり、塩基配列の約７割以上が同じであ
るものを意味する。

このような相同物は、アルコール脱水素酵素遺伝子とし
て一般に認められているＤＮＡとポリペプチドの並列的
関係から同じＡＤＨを生成し得る。

本発明のクローン化ＤＮＡは、上記のアルコール脱水素
酵素遺伝子ないしはその相同物を含むものであって、代
表的にはアセトバクター・アセチに１００６Ｐｋから得
られるものがある。具体的な例としては、後述する大き
さ約５ｋｂで第２図に示す制限酵素地図ないしは大きさ
約３，３ｋｂで第３図に示す制限酵素地図で各々表わさ
れるＤＮＡが挙げられる。また、これらを含むものの例
として、後述する大きさ約１０ｋｂで第１図に示す制限
酵素地図のＤＮＡなどが挙げられる。

本発明は、第二に、上記のクローン化ＤＮＡを含む組み
換えプラスミドを提供するものである。

この組み換えプラスミドは、上記のクローン化ＤＮＡを
種々ノヘクター、例えばｐＲＫ２９０、ｐＫＳ１３、ｐ
ＵＣ１８などに常法に従って連結してつくることができ
る。

また、本発明は、第三に、上記の組み換えプラスミドを
含む微生物を提供するものである。

尚、ここでいう微生物とは、代表的には酢酸菌であり、
酢酸菌に上記組み換えプラスミドを含ませることにより
、その酢酸菌のＡＤＨ活性、延いては酢酸生成能を高め
るのに役立て得る。また、ＡＤＨ活性が実質的に存在し
ない菌株についてはその機能を付与することができる。

例えば、微生物として酢酸菌以外の菌、例えば大腸菌な
どとすることもでき、大腸菌の場合には、大腸菌にＡＤ
Ｈ遺伝子を付与し、大腸菌にＡＤＨを産生させ、大腸菌
からＡＤＨを採取することができるようになる。

本発明のクローン化ＤＮＡの代表的な製法について以下
説明する。

まず、アセトバクター・アセチＫ　１００６株（ないし
はこの変異株でＡＤＨ活性は失なわれていないもの）か
らそのＤＮＡを取り出して、制限酵素５ａｕ３ＡＩで部
分分解し２０〜３０ｋｂのＤＮＡ　（断片）を得、コス
ミドベクターｐＫＳ１３のＢａｍＨ１部位に連結後λフ
ァージにパッケージングする。これを大腸菌に導入して
保存する（導入された大腸菌は、いわゆる遺伝子図書館
である）。

次いでこの大腸菌を、ヘルパー（伝達性プラスミド）と
してｐＲＫ２０１Ｂを含む大腸菌と混合し、上記ＤＮＡ
断片を含む組み換えプラスミドを三親接合伝達法（Ｔ、
Ｉｎｏｕｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｐｅｒｍ、　Ｔｅｃｈ
、。

Ｇ３．１−４．１９８５）により、ＡＤＨ活性を欠く酢
酸菌（ＡＤＨ欠損株、ただしアルデヒドの脱水素酵素活
性（ＡＬＤ）Ｉ活性）は有する）に伝達する。

接合伝達を受けた酢酸菌を選択するため、伝達処理後の
菌体を、まず酢酸とテトラサイクリンを含んだ寒天培地
に塗布して、第１次スクリーニングをする。この処理で
、酢酸に弱い大腸菌と、上記組み換えプラスミド（ｐＫ
ｓ１３にはテトラサイクリン耐性あり）の導入されてい
ないＡＤＨ欠損酢酸菌が淘汰除去される。次にこの寒天
培地に生じたコロニーを、第２次スクリーニングとして
、アルコールおよび炭酸カルシウムを添加し炭酸カルシ
ウムにより白濁している寒天培地にレプリカする。この
培地に生じたリング状のハロー（ｈａｌｏ）を示すコロ
ニーは、酸を生成しており、この生成は組み換えＤＮＡ
によるＡＤＨ欠損株の相補もしくは単なるＡＤＨ欠損株
の復帰変異によるものと考えられる。このコロニー（菌
）からプラスミドを取り出し、前記のＡＤＨ欠損酢酸菌
に再導入してＡＤＨ活性が回復していれば、そのプラス
ミドはＡＤＨ欠損を相補するＤＮＡを含むものであると
いえる。

ＡＤＨ欠損を相補するより小さいＤＮＡ領域を見い出す
ため、上記のプラスミドを更に制限酵素で切断し、各１
；７１断片をベクターｐＫ８１　Ｂに組込み、この組み
換えベクターを前記と同じ三親接合伝達法によりＡＤＨ
欠損株に伝達処理したのちその欠損株についてその機能
の相補の有無を確認する。相補「有」の確認によりＡＤ
Ｈ活性を備えるより小さいＤＮＡを見い出す。

次に、更にその相補「有」とされたベクターについて、
エキソヌクレアーゼ■、マング・ビーン・ヌクレアーゼ
を用いた末端欠失法により端からＤＮＡを少しずつ消化
し、このものについて上記の操作を繰返してＡＤＨ欠損
を相補する最小のＤＮＡ領域を見い出す。次いで、この
Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｍ域の塩基を分析して塩基配列を決定する
。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例でもって更に詳しく説明する。

イ、ＤＮＡ断片サンプルの作成ＡＤＨ活性があり酢酸を生成するアセトバクター・アセ
チに１００６株（微工研菌寄第７５２８号）からＤＮＡ
を取り出し、これを制限酵素５ａｕ３ＡＩで部分分解し
、ショ糖密度勾配遠心法で、平均２０〜３０ｋｂのＤＮ
Ａ断片を得た。

これを、広宿主域のコスミドベクターｐＫＳ　１３のＢ
ａｍＨ１部位に連結し、λファージにパッケージングし
たのち、このλファージを大腸菌Ｈ８１０１株に感染さ
せ、遺伝子図書館とした。

口、ＡＤＨＡＤＨ欠損株ＮＡ断片の伝達前記のλファー
ジ入り大腸菌ＨＢ　１０１株と、ヘルパーとしてｐＲＫ
２０１３を含ませた大腸菌Ｈ８１０１株と、更にＡＤＨ
欠損アセトバクター・パスツリアヌスＮＰ２５０４株（
ＩＦ０３１９１株の自然変異株、微工研菌寄第９６７４
号、昭和６２年１０月２７日寄託、この変異株の菌学的
性質は、形態上の性質および培地における生育状態につ
いては親株のＩＦ０３１９１株と全く同じで、生理学的
性質については、アルコール脱水素酵素を欠失している
以外は親株のＩＦ０３１９１株と全く同じ性質を有し、
かつアルデヒドの脱水素酵素活性も有している）との混
合懸濁液をメンブランフィルタ−でン濾過した。

このフィルターをＬ寒天培地にて３０℃で培養し、フィ
ルター上で接合伝達させた。尚、上記ＩＦＯ３１９１株
についてはＪ、　Ｇｅｎ、　Ａｐｐｌ、　Ｍｉｃｒｏｂ
ｆｏｌ。

４、２８’ｌ（１９５ｇ）に詳説されており、本明細書
において準用する。但し、この文献にはアセトバクター
・ランセンス　ＮＲＲＬ　　Ｂ−６５株としてｇ己載さ
れているが、このＮＲＲＬ　　Ｂ−６５株はＩＦＯが受
理した際ＩＦ０　３１９１株と命名されたものであって
、同一菌株である。また、ランセンスはバージ−の分類
法の変更に伴いパスツリアヌスに編入されたためにこの
菌株の種名もそれに応じて改められている。

ハ、ＡＤＨ対応ＤＮＡ断片伝達の確認前記濾過５時間後にフィルターを無菌水で洗いフィルタ
ーに付着している菌を水に懸濁させた。

この菌懸濁液を０．２５％酢酸入りのＹＰＤ寒天培地（
テトラサイクリン含有：　Ｔ、Ｉｎｏｕｅ　ｅｔ　ａｌ
、。

Ｊ、［’ｃｒ＋＋＋、Ｔｃｃｈ、、　６３．１（１９８
５））上に塗布した。更に、二の寒天培地で生じたコロ
ニーを３％アルコール、１９６炭酸カルシウム含有のＹ
ＰＤ寒天培地にレプリカした。

その結果、明確なハローをつくるコロニーを１株見い出
した。このコロニー（菌）から取り出したプラスミドｐ
ＡＡ７０１は、２０ｋｂ以上の挿入ＤＮＡ断片を含んで
いた。尚、この１株を見い出すために検索に用いた前記
遺伝子図書館からのＤＮＡ断片の数は、およそ１０，０
００個であった。このプラスミドｐＡＡ７０１をＮＰ２
５０４株に再導入して調べたところ、第１表に示すよう
に酢酸生成能並びにＡＤＨ活性が認められ、従って、プ
ラスミドｐＡＡ７０１はＡＤＨ欠損を相補する遺伝子が
含まれていることが示された。

第１表〔註〕表中の符号の意味：：酸をほとんどつくらない＋　　：酸を少量つくる＋＋：酸をやや多くつくる＋＋＋：酸を非常に多くつくる二、ＡＤＨ活性に対応するより小さいＤＮＡ断片の存在
の確認前記のプラスミドｐＡＡ７０１を、制限酵素ＢａｍＨＩ
、Ｃ１ａ　Ｉ、ＥｃｏＲＩＳＨｉｎｄＤＩおよびＰｓｔ
ｌを用いて各酵素毎に切断し、それぞれ１，０％アガロ
ースゲル電気泳動に付した。

次いで、アセトバクター−アセチに１００６株のつくる
ＡＤＨ蛋白のアミノ酸配列を基礎にして合成したＤＮＡ
プローブを使い、サザン交雑法（Ｊ。

Ｍｏ１．ｌ３ｉｏ１．９８５０３−５１７（１９７５）
）を用いて電気泳動後のＤＮＡ切断片を処理したところ
、上記プローブと相同なりＮＡ断片が存在することが確
認された。そのうち、サザン交雑法でポジティブなシグ
ナルを示すＨｉｎｄＤ１１０ｋｂ断片をベクターｐｃＰ
１３にサブクローンして（組込んで）製したプラスミド
ｐＡＡ７２１は、プラスミドｐＡＡ７０１と同様にＡＤ
Ｈ欠損株（ＮＰ２５０４株）を相補し、ＡＤＨ欠損株の
ＡＤＨ活性を回復した。

ＡＤＨ欠損株を相補すること、及びサザン交雑法の結果
プローブと相同なりＮＡ配列が存在することにより、本
ＤＮＡ断片はＡＤＨ遺伝子を含んでいることが証明され
た。

ホ、ｐＡＡ７２１の制限酵素地図プラスミドｐＡＡ７２１を各種制限酵素を用いて切断し
、電気泳動分析を行なったところ、この１０ｋｂの挿入
断片は第１図に示す制限酵素地図を有することがわかっ
た。

へ、ｐＡＡ７２１の挿入ＤＮＡ断片の縮小化上記１０ｋ
ｂの挿入断片を、ベクターの一種、ブルースクリプトＭ
１３＋にサブクローンしたのち、エキソヌクレアーゼ■
およびマング・ビーン・ヌクレアーゼを用いて末端部を
少しずつ消化した。消化処理後の挿入断片にいてＡＤＨ
欠損株（ＮＰ２５０４株）への導入をはかり、ＡＤＨ欠
損の相補が起るか否かを確認し、その結果前記１０ｋｂ
のＤＮＡ断片は、ＡＤＨ欠損を相補するＤＮＡとして、
第２図に示す制限酵素地図を有する断片（大きさ約５ｋ
ｂ）まで、更には第３図に示す制限酵素地図を有する断
片（大きさ約３．３ｋｂ）まで小さくしうることか確認
された。尚、第２図および第３図で示す挿入ＤＮＡ断片
は、制限酵素、ＸｈｏＩ、５ａｃＩ、５ａｉｌＳＣ１ａ
Ｉ、およびＸｂａｌでは切断されながった。

ト、ＤＮＡプローブの調製前記のサザン交雑法で用いたＤＮＡプローブは、次のよ
うにして調製した。

まず、アセトバクター・アセチに１００６株由来のＡＤ
Ｈ蛋白を精製した。この蛋白は、’５ＤＳ−ＰＡＧＥ分
析により、７２ｋｄと４５ｋｄとの２つのサブユニット
からなっていることが明らがとなった。この７２ｋｄの
サブユニットは、ＡＤＨ活性を有しており、７２ｋｄの
サブユニットについてＮ末端からのアミノ酸配列を次の
ように１５残基決定した。

Ａｓｐ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｇ　Ｉｙ−Ａｓｎ−Ｔｈ
ｒ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｉ　ｌｅ−Ｉ　Ｉｅ−
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｓｐｓｐ次に、その配列に基づいて合成りＮＡプローブを２種作
成した。

その１種を示すと次の通りである。

５’　ＧＣＱＴＣＮＣＣＮＧＴＰＴＴ３’ここで、Ｐ−
Ａ又はＧ、Ｑ−Ｃ又はＴ、Ｎ−Ａ。

ＧＳＣ又はＴチ、ＡＤＨ遺伝子の解析上記プローブに対し相同な領域は第３図で示された断片
の中央部に存在することが示された。この領域を中心と
してＤＮＡの塩基配列をダイデオキシ法（Ｆ、Ｓａｎｇ
ｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｉ。

ＵＳＡ、７４．５４６３−５４８７．１９７７　）によ
り決定した。解明した塩基配列および対応するアミノ酸
を第４図に示す。

アセトバクター・アセチに１００６株のＡＤＨの構造遺
伝子は、開始コドンＡＴＧから始まり停止コドンＴＡＡ
で終る２２２６のコーディング領域を持ち（第４図上、
開始位置は第１番目で終了位置は停止コドンＴＡＡまで
含めて第２２２９番［］）、７４２個のアミノ酸をコー
ドしていた。

ＡＤＨ蛋白質より決定したＮ末端から１５残基までのア
ミノ酸配列は、塩基配列に対応したアミノ酸配列（開始
コドンＡＴＧに対応するメチオニンを第１残基とする）
の第３６残基より第５０残基までの配列（第４図上、下
線付きで示す）と完全に一致し、前項トで例示したＤＮ
Ａプローブも第１１８番目から第１３１番目まで（第４
図に囲み付きで示す）の塩基の相補塩基配列と一致した
。

また、Ｎ末端の上流の塩基配列は、分泌蛋白質特有のシ
グナル配列と考えられる。

す、クローン化ＤＮＡの育種への活用プラスミドｐＡＡ７２１を、アセトバクター・パスツリ
アヌスＩＦ０３１９１株に三親接合伝達法（前記）によ
り導入した。この導入菌についてＡＥ培地（始発酢酸０
．３８％、エタノール４．８％を含むＹＰＤ培地）を用
いて培養したところ、結果は第２表に示す通りであった
。

第　　２　　表上記の表から、導入閑の場合は静置および振盪のいずれ
の培養条件下でも酸化速度および酢酸の生成量とも増大
していることがわかる。これはプラスミドｐＡＡ７２１
の導入によりアセトバクター・パスツリアヌスＩＦ０３
１９１株の酸化能が増大されたことを示すものであり、
よって菌の改良、育種に有用であることが理解される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、アルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）欠損株アセ
トバクター・バスツリアヌスＮＰ２５０４株（微工研菌
寄第９６７４号）の酢酸生成能を相補したプラスミドｐ
ＡＡ７２１の挿入ＤＮＡ断片（約１０ｋｂ）の６塩基認
識制限酵素による制限酵素地図を示す。第２図は、上記断片を末端欠失法で縮小したＡＤＨ欠損
株を相補するより小さい領域のＤＮＡ断片（約５ｋｂ）
の制限酵素地図を示し、これは第１図上で、矢印で示し
た領域に相当する。第３図は、第２図の断片を更に縮小した最小領域のＤＮ
Ａ断片（約３．３ｋｂ）の制限酵素地図を示す。これは
第２図に破線の矢印で示した領域に相当する。また第４図は、アセトバクター・アセチに１００６株の
ＤＮＡの構造遺伝子部分の２２２６個からなる全塩基配
列（上段）およびそれに対応するアミノ酸（下段）を示
している。塩基配列中、塩基番号第１番目から第２２２
９番目までの領域がＡＤＨの構造遺伝子をコードする領
域である。これは第３図において１点鎖線の矢印で示し
た領域に相当する。

Claims

【特許請求の範囲】１、アセトバクター・アセチＫ１００６株（微工研菌寄
第７５２８号）のアルコール脱水素酵素遺伝子またはこ
れと機能的に等価な相同物を含むクローン化ＤＮＡ。２、アルコール脱水素酵素遺伝子が、大きさ約３．３ｋ
ｂで第３図に示す制限酵素地図で表わされるものである
、請求項１に記載のクローン化ＤＮＡ。３、アルコール脱水素酵素遺伝子が、第４図上第１番目
から第２２２９番目までの塩基配列で特定されるもので
ある、請求項１に記載のクローン化ＤＮＡ。４、アセトバクター・アセチＫ１００６株（微工研菌寄
第７５２８号）のアルコール脱水素酵素遺伝子またはこ
れと機能的に等価な相同物を含むクローン化ＤＮＡを組
込んだ組み換えプラスミド。５、アセトバクター・アセチＫ１００６株（微工研菌寄
第７５２８号）のアルコール脱水素酵素遺伝子またはこ
れと機能的に等価な相同物を含むクローン化ＤＮＡを組
込んだ組み換えプラスミドが保持された微生物。