JPH02276571A - 哺乳動物細胞の培養からのアンモニア除去方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 アンモニアは、細胞代謝の有毒廃副生物であり、哺乳動
物の細胞の培養中水性細胞成長培地（ｍｅｄ　ｉ　ｕｍ
）中に蓄積されるので、細胞成長及び所望の最終生成物
の生成を抑制する。この問題を解決するために多くの努
力がなされた。

現在、抑制レベルのアンモニアを含有する水性細胞成長
培地は、単に廃棄され、新たな培地に取り替えられる。

これは、新培地の滅菌及び貯蔵用装置の追加並びに新培
地中の高価な血清の取り替えを必要とするので、非能率
である。アンモニア蓄積問題に対して他に提案された解
決方法は、アンモニアに対する耐性がまさる細胞系統の
選択と使用であった（オノ（Ｏｎｏ）ら、９４　Ｊ、　
Ｂｉｏｃｈｅｍ１４９３　（１９８３）参照）。しかし
、アンモニアの抑制効果に対し耐性かあることが知られ
る細胞系統は、比較的少ない。アンモニア蓄積を扱う最
近の戦術は、培養基（ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｄｉｕｍ）
中のグルタミン（主要アンモニア源）の厳密な制御であ
った（グラッケン（Ｇｌａｃｋｅｎ）ら、６　　Ｂｉｏ
／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１０４１（１９８８）参照）
。しかし、この方法は、アンモニアを２５〜３０％だけ
減らしたに過ぎず、他方では他の必須アミノ酸を利用す
る細胞能力と妥協するものである。

したがって、必要なものは、培地の取り替え及びグルタ
ミン制御の必要がなく、しかも既知の種々の現存細胞系
統について利用しつる、哺乳動物細胞培養からのアンモ
ニア除去方法である。

発明の要約 この発明は、疎水性高分子膜マトリックス中に支持され
る流体を経るガス移動を哺乳動物細胞の培養中の有毒ア
ンモニアの蓄積の前記問題に適用することを含み、アン
モニアを水性培養基から除去して培養基の再使用を可能
にすることにより前記要求を満たすものである。方法は
、次の不可欠の段階からなる：水性培養基を微孔性の疎
水性高分子膜マトリックスである支持体で支持された流
体膜の一面と接触させること；及び前記膜の多面とｐＦ
（≦７．０を有する水溶液からなるストリップ溶液との
接触を保つこと。

発明の詳細 な説明によって、単純であり、現有技術を利用してバッ
チ式又は連続式で用いることかでき、かつアンモニア除
去後、細胞培養基の再使用を可能にする、水性の哺乳動
物細胞培養からアンモニアを非抑制レベルまで定量的に
除去する方法を提供する。

基本的な全体方法は、第１図に示すように、水性培養基
ｌをその容器２からポンプ３て取り出し、流量計４及び
圧力計５を経て循環させて微孔性の疎水性高分子マトリ
ックスに支持された流体膜６の一面と接触させ膜の多面
を酸性ストリップ溶液と接触させるのである。水性培養
基は、アンモニアを奪われて膜を出て第２圧力計７を経
て容器２に戻る。

第２図は、微孔性の疎水性高分子支持体マ）　ＩＪソッ
クス支持された流体膜を使用し、流体かガスである場合
のこの発明のアンモニア除去機構を略図的に説明する。

この図で水性のアンモニア含有細胞培養基からなる供給
溶液がガスを満たした細孔８を有する微孔性の疎水性高
分子膜マトリックス９の一面１０−１と接触される；ガ
スとしては非酸性又は非塩基性のいかなるガスも適する
が最初に細孔に存在する代表的なガスは空気である。水
は疎水性高分子マトリックスを湿潤させることかできな
いので、水性供給液とストリップ溶液は互いに混合しな
い。アンモニアは、微孔中のガス媒質内を拡散して膜の
他面１Ｏ−２に達し、そこでは酸性ストリップ溶液が維
持又は循環されていてアンモニアは直ちに非可逆的にガ
ス／ストリップ溶液界面でプロトン化されてアンモニウ
ムイオンとなり、膜のストリップ溶液側のアンモニアの
濃度がゼロに近いので、供給溶液側とストリップ溶液側
の間の化学ポテンシャルが供給溶液側からストリップ溶
液側へのアンモニアの不可逆的輸送に極めて有利である
という事実によりアンモニウムイオンが膜のストリップ
溶液側に閉じ込められる。

第２図は、支持ガス膜の場合を示すが、支持液体膜もこ
の発明の方法において同様に有効である。

高分子膜マトリックスの微孔をほぼ満たす適当な液体に
は、リン酸ジアルキル、アルキルホスホン酸ジアルキル
、アリールスルホン酸、アルキルスルホン酸、アリール
カルボン酸、アルキルカルボン酸、アリールアルコール
、アルキルアルコール、アリールアミン、アルキルアミ
ン及び酸化トリアルキルホスフィンが含まれ、いずれか
がそのまま又は適当な溶媒と組み合わせて使用される。

この発明に有用な疎水性高分子微孔性膜マトリックスに
適する重合体には、ポリエチレン及びポリプロピレンの
ようなポリオレフィン、ポリテトラフルオロエチレン及
びその共重合体、ポリフッ化ビニリデン、ポリスルホン
並びにポリエーテルスルホンが含まれる。膜マトリック
スの形状は、中空繊維、平板、ビーズ又はビーズ基体上
の重合体被膜であることができる。特に好ましい膜は、
米国ノースカロライナ州のセラニーズ・プロダクツ・オ
ブ・チャーロッテ（Ｃｅｌａｎｅｓｅ　Ｐｒｏｄｕｃｔ
ｓ　ｏｆＣｈａｒｌｏｔｔｅ）襞間品名「セルガードＸ
　−２０（ＣｅｌｇａｒｄＸ−２０）　Ｊ及び西独国の
エンカ・アーゲー（Ｅｎｋａ　Ａ。

Ｇ、）襞間品名「アキュレルＰＰ（Ａｃｃｕｅｒｌ　Ｐ
Ｐ）　Ｊのポリプロピレン中空繊維である。

第３図は、多数本の中空繊維１１が各端部に植え付けら
れ、かつ供給溶液及びストリップ溶液を循環させるため
の入口それぞれ１２．１３及び出口それぞれ１４及び１
５を有する支持流体膜モジュール１６の特に好ましい形
状を示す。ストリップ溶液は、入口１３及び出口１５を
経て循環するように示されるが、モジュールの外殻側を
単に強酸溶液で満たし、これによりストリップ溶液を膜
のストリップ溶液側と接触させ続けることもできる。な
お、供給溶液を中空繊維の内腔側に入れ、ストリップ溶
液を「外殻」側すなわち繊維の外側で循環させることが
好ましいが逆の仕方を同様に用いることもできる。

符号１７は植え付は材料を示す。

第２図及び第３図は、この発明の方法における中空繊維
膜支持体マトリックスの使用を示すが、ビーズ形状の膜
マトリックス又はアンモニア吸収材料のビーズを囲む膜
材料も同様に有効である。

ビーズ及び膜被覆ビーズは、振とうフラスコ、ローラー
ボトル（ｒｏｌｌｅｒ　ｂｏｔｔｌｅ）又は小型細胞培
養発酵そう中での細胞培養中に生成したアンモニアの除
去に特に有用である。代表的な膜被覆可能なビーズは、
多孔質セラミックス材料及び陽イオン交換樹脂材料でつ
くられる。代表的な多孔質セラミックビーズは、米国ミ
ネソタ州セントポール（Ｓｔ、　Ｐａｕｌ）の３Ｍｌン
パニーによりｒＭ４０Ｘ−ホロラーマクロスフェア（Ｍ
４０Ｘ　Ｈｏｌｌｏｗ　Ｍａｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）」
の商品名で市販されるものである；このようなビーズは
、少なくとも０．２５Ｍの酸水溶液で充てんし、次いで
上記の型の微孔性疎水性重合体膜で吹付塗りすることが
できる。好ましい陽イオン交換樹脂ビーズは、Ｈ″″形
で少なくとも１　ｍｅｑ／−の酸含量を有する１６〜５
０メツシユのものである；代表的な市販ビーズは、米国
ペンシルベニア州フィラデルフィアのローム・アンド・
ハース・コンパニー（Ｒｏｈｍ　ａｎｄ　Ｈａａｓ　Ｃ
ｏｍｐａｎｙ）の商品名［アンバーライトＩＲＡ−１１
８８（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ　（ＲＡ−１１８８）　Ｊの
ビーズである。

ビーズの吹付塗は、ビーズを疎水性重合体の適当な溶媒
の溶液と吹付塗装置中で混合することにより行うことが
できる。代表的装置は、オーガー（Ａｕｇｅｒ）供給装
置と２液空気噴霧外部混合ノズルとからなり、オーガー
でビーズと重合体溶液を混合しビーズを一度に一つずつ
ノズルに送り、そこで噴霧空気と混合する。代表的方法
において、キナル（Ｋｙｎａｒ）　７６０　　（ポリフ
ッ化ビニリデン、米国ペンシルベニア州フィラデルフィ
ア、ペンウォルト・コーポレーション（Ｐｅｎｎｗａｌ
ｔ　Ｃｏｒｐ、）製品の商品名）の１５重量％ジメチル
アセトアミド溶液を１０ｍ／／Ｉ［Ｉｉｎの速度です−
ガー供給装置に圧送する。ビーズは、０．５ｇ／ｍｉｎ
の速度で導入される。オーガーを５０Ｏｒｐｍの速度に
セットし、噴霧空気をノズルに２．８１　ｋｇ／Ｃ１（
４０９Ｓｉ）で供給する。被覆ビーズを加熱空気が上方
に移動する塔内に上方に吹き付ける。この装置は、ビー
ズを浮遊させ、ビーズのまわりの２０〜５０ミクロン厚
さの乾燥重合体膜の生成に対してじゅうぶんな浮遊時間
を与える手段を提供する。

この発明の方法の操作では、水性培養基供給液を希釈、
ｐＨ調節又はろ過を行うこ−となく直接膜の供給溶液側
に循環させることができる。培養基のｐＨは、一般に７
．０〜７．４の範囲内である。酸性ストリップ溶液、好
ましくは、硫酸のような強酸の溶液のｐＨは、７．０以
下、好ましくは５．０以下である。方法は、周囲温度な
いし培養工程の若干高い温度で行うことができる。

参考例 仔つシ血清ｌＯ容量％を含有するダベルコの修飾イーグ
ル培地（Ｄｕｂｅｌｃｃｏｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａ
ｇ１４ｓ　ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥ）からなる水性培養
基の５個のフラスコ内て０〜１３ｍＭの範囲内の種々の
アンモニア初濃度で３７℃のインキュベーター中ハムス
ターの子の腎（ＢＨＫ）　４ｔｆｌ胞を培養した。培養
を１４０時間の期間にわたって監視した。アンモニアの
存在は、最高アンモニア初濃度で６２％も細胞成長速度
を減らすことが証明された。

実施例１ １４ｍＭのアンモニア初濃度を有するが次のような膜処
理をした参考例１と同じ培養基の新鮮なバッチ中で参考
例１と同じＢＨＫ細胞を培養した。水性培養基は、第３
図に示す型のモジュール中に束にして植え付けた、セル
ガードＸ−２０中空繊維からなる支持体に支持したガス
（空気）膜の内腔を通して１９１／ｈｒの速度で４．５
ｈｒ循環させた。なお、前記中空繊維は、内径４００ミ
クロン、外径４５０ミクロン、細孔径０．０４ミクロン
、空隙率４０％及び破裂圧１５．４７　ｋｇ／ｃａｒ　
（２２０・ｐｓｉ）であった。合計した全膜表面積は、
０．１８６　ｒｄ（２，０ｆｔ”）であった。

モジュールの外殻は、０．３のＩ）Ｈを有する０、５Ｍ
硫酸で満たし適当な入口及び出口にふたをつけることに
より該硫酸を中で動かなくした。水性培養基をモジュー
ルを通して循環することにより、そのアンモニア濃度を
１４ｍＭから０．５ｍＭに減少させた。

次いで、ＢＨＫ細胞を前記処理培養基中３７°Ｃで１４
０時間成長させ、細胞計算値を参考例の若干の値と比較
した。結果は、第４図のグラフに示すが、膜が抑制アン
モニアの除去に成功し、しかも驚くべくことには膜処理
培養基中での細胞成長がアンモニアを含まない未処理培
養基の細胞成長と本質的に同じであったという事実によ
り証明されるように膜が細胞培養基から必要な栄養素又
は代謝中間体を除去しないことを証明する。

実施例２ 前述の吹付塗技術を用いてアンバーライトＩＲＡ−１１
８１（ビーズを２０ミクロン厚さの微孔性疎水性ポリフ
ッ化ビニリデン膜マトリックスで被覆し、次いで乾燥す
ることにより疎水性重合体被覆アンモらア吸収ビーズを
調製した。次いで、乾燥した重合体被覆ビーズを水中に
２４時間懸濁させビーズの内部を水で飽和させ（約６０
重量％）、ろ過して集めた。微孔性疎水性高分子マトリ
ックスの細孔をそれを酸化トリオクチルホスフィンの３
３重量％ヘキサデカン溶液に浸漬することにより該溶液
で満たした。次いで充てんビーズをろ過によりガラスフ
ィルター上に集め水洗して過剰の有機液体を除き、内側
にアンモニア吸収強酸性陽イオン交換樹脂基体を有する
一般に球状の支持液体膜を得た。

参考側記載のようにしてＢＨＫ細胞を振とうフラスコ中
で成長させた。前記調製支持液体膜ビーズを培養基１１
当たり１ＯＷＬｌ加えることにより２００　ｈｒの培養
期間中に生じたアンモニアを連続的に除去した。

前記明細書中に用いた用語及び表現は、説明用語として
用いたもので限定のためでな（、このような用語及び表
現の使用により示され記載された特徴又はその一部の同
等物を排除する意図はなく、この発明の範囲は特許請求
の範囲によってのみ明示され限定されるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明の全体の方法を示す流れ図、第２図は
この発明の代表的な膜を通るアンモニアの拡散を示す説
明図、 第３図は代表的な膜モジュールの部分断面図、第４図は
哺乳動物の細胞計算値を細胞培養基のアンモニア濃度の
関数として示すグラフである。 ｌ・・・水性培養基　　　　２・・・容器３・・・ポン
プ　　　　　　４・・・流量計５．７・・・圧力計　　
　　６・・・流体膜８・・・細胞 ９・・・微孔性の疎水性高分子マトリックス１０−１・
・・膜の一面　　　　１０−２・・・膜の他面１１・・
・中空繊維　　　　　１２・・・供給溶液入口１３・・
・ストリップ溶液入口 １４・・・供給溶液出口　　　１５・・・ストリップ溶
液出口１６・・・支持流体膜モジュール １７・・・中空繊維植え付は材料

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、水性培養基中での哺乳動物細胞の培養中に生成する
   アンモニアを除去するに当り、 （イ）微孔性の疎水性高分子マトリックスを膜支持体と
   する二面の支持流体膜の一面と前記水性培養基を接触さ
   せること；及び （ロ）前記支持流体膜の他の面と７．０以下のｐＨを有
   する水溶液からなるストリップ溶液との接触を保つこと
   を特徴とする哺乳動物細胞の培養からのアンモニア除去
   方法。 ２、前記支持流体膜の前記流体がガスである請求項１記
   載の方法。 ３、前記支持流体膜の前記流体がリン酸ジアルキル、ア
   ルキルホスホン酸ジアルキル、アリールスルホン酸、ア
   ルキルスルホン酸、アリールカルボン酸、アルキルカル
   ボン酸、アリールアルコール、アルキルアルコール、ア
   リールアミン、アルキルアミン、酸化トリアルキルホス
   フィン及びそれらの溶液よりなる群から選ばれた液体で
   ある請求項１記載の方法。 ４、前記微孔性の疎水性高分子膜支持体マトリックスが
   少なくとも１本の中空繊維、少なくとも１個のビーズ及
   びビーズ基体上の少なくとも一つの被膜から選ばれた請
   求項１記載の方法。 ５、前記膜支持体マトリックスが少なくとも１本の中空
   繊維であり、前記水性培養基が前記少なくとも１本の中
   空繊維の内腔中に循環される請求項４記載の方法。 ６、前記少なくとも１本の中空繊維を、前記水性培養基
   用及び前記ストリップ溶液用入口及び出口を有する少な
   くとも一つのモジュールに植え付けた請求項４記載の方
   法。 ７、前記少なくとも１本の微孔性中空繊維がポリプロピ
   レン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリ
   デン、ポリスルホン及びポリエーテルスルホンよりなる
   群から選ばれた重合体である請求項４記載の方法。 ８、前記膜支持体マトリックスがアンモニア吸収材料の
   ビーズ基体上の少なくとも一つの被膜である請求項４記
   載の方法。 ９、前記のアンモニア吸収材料のビーズ基体が陽イオン
   交換樹脂及び水素イオン含有多孔質セラミックスから選
   ばれた請求項８記載の方法。 １０、前記水性培養基を哺乳動物細胞培養に再使用する
   ために再循環する請求項１記載の方法。