JPH02265485A - ヒト乳頭腫ウイルス５２型ｄｎａ配列およびその使用方法 - Google Patents
ヒト乳頭腫ウイルス５２型ｄｎａ配列およびその使用方法Info
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- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
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- C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
この特許出願の基礎となる研究の一部はナショナル・イ
ンスチテユーツ・オブ・ヘルス・グランド（Ｎａｔｉｏ
ｎａｌ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ
Ｇｒａｎｔ）の援助により行われた。この発明はヒト乳
頭腫ウィルス、特にヒト乳頭腫ウィルス５２型（以下ｒ
ｌ−ＩＰ■５２」という）のための核酸ハイブリダイゼ
ーションプローブおよびその使用方法に関するものであ
る。
ンスチテユーツ・オブ・ヘルス・グランド（Ｎａｔｉｏ
ｎａｌ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ
Ｇｒａｎｔ）の援助により行われた。この発明はヒト乳
頭腫ウィルス、特にヒト乳頭腫ウィルス５２型（以下ｒ
ｌ−ＩＰ■５２」という）のための核酸ハイブリダイゼ
ーションプローブおよびその使用方法に関するものであ
る。
［従来の技術］
Ａ、ヒト乳頭腫ウィルス型
ヒト乳頭腫ウィルス（以下用（ＰＶ、という）はイボ、
コンジローム、異形酸のような各種上皮性病変の病因と
してコ２められている［ＤＮＡ・ツモール・ウイルスイ
ズ（ＤＮＡ Ｔｕｍｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ）、第２部、
Ｊ、ツーズ編、第２版（１９８１年）、コールド・スプ
リング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ ）ｌａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）
、 ３７１〜３８２ｄ頁、ギスマン、し１、キャンサー
・サーベイ（Ｃａｎｃｅｒ ５ｕｒｖ、）、３巻、１６
１頁（１９８４年）、プフィスター、Ｈｌ、バイオケミ
カル・ファーマコロジー（Ｂｉｏｃｂｅｍ、 Ｐｈａｒ
ｍａｃｏｌ、）、 ９９巻、１１１頁（１９８３年）、
ダースド１Ｍ、ら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミーオブ・サイエンシズ・オブ・ジ・
Ｕ Ｓ Ａ （Ｐｒｏｃ。
コンジローム、異形酸のような各種上皮性病変の病因と
してコ２められている［ＤＮＡ・ツモール・ウイルスイ
ズ（ＤＮＡ Ｔｕｍｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ）、第２部、
Ｊ、ツーズ編、第２版（１９８１年）、コールド・スプ
リング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ ）ｌａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）
、 ３７１〜３８２ｄ頁、ギスマン、し１、キャンサー
・サーベイ（Ｃａｎｃｅｒ ５ｕｒｖ、）、３巻、１６
１頁（１９８４年）、プフィスター、Ｈｌ、バイオケミ
カル・ファーマコロジー（Ｂｉｏｃｂｅｍ、 Ｐｈａｒ
ｍａｃｏｌ、）、 ９９巻、１１１頁（１９８３年）、
ダースド１Ｍ、ら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミーオブ・サイエンシズ・オブ・ジ・
Ｕ Ｓ Ａ （Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、、 ＵＳＡ）、８０
巻、３８１２頁（１９８３年）、ポジヤード、Ｍ、ら、
ＥＭＢＯ・ジャーナル（ｒｇＭｌ禾ＯＪ、）、３巻、１
１５１頁（１９８４年）参照］、子宮頚部のｙ４形成（
また子宮頚部上皮肉新生物（ＣＩＮ）としても知られて
いる）は子宮頚癌Ｉ＼進行する初期徴候であると信じら
れており、軽度異形成（ＣＩ Ｎ ！ ）から中等変異
形成（ＣＩＮ■）、重度異形成へと進行してそのまま癌
（−・括的にＣＩＮ厘）となり侵襲性癌へ移行する。
巻、３８１２頁（１９８３年）、ポジヤード、Ｍ、ら、
ＥＭＢＯ・ジャーナル（ｒｇＭｌ禾ＯＪ、）、３巻、１
１５１頁（１９８４年）参照］、子宮頚部のｙ４形成（
また子宮頚部上皮肉新生物（ＣＩＮ）としても知られて
いる）は子宮頚癌Ｉ＼進行する初期徴候であると信じら
れており、軽度異形成（ＣＩ Ｎ ！ ）から中等変異
形成（ＣＩＮ■）、重度異形成へと進行してそのまま癌
（−・括的にＣＩＮ厘）となり侵襲性癌へ移行する。
子宮頚部具形成および子宮頚癌に随伴するＨＰＶ型を検
討する研究からＨＰＶ６．１１．１６゜１８．３１およ
び３３型が生殖器病変に高率で随伴することが判明した
［ギスマン、Ｌｏ、キャンサー・サーベイ、３巻、１６
１頁（１９８４年）、プフィスター、■１、バイオケミ
カル・ファーマコロジー、９９巻、１１１頁（１９８３
年）、ダースト、Ｍ、ら、プロシーディングズ・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オ
ブ・ジ・ＵＳＡ、８０巻、３８１２頁（１９８３年）、
ポジヤード、Ｍ、ら、ＥＭＢＯ・ジャーナル、３巻、１
１５１頁（１９８４年）、デ・ビリエールズ、Ｅ、−Ｍ
、ら、ジャーナル・オブ・バイｏｎジー（Ｊ、 ｖｉｒ
ｏｌ、）、４０巻、９３２頁（１９８１年）、ギスマン
、Ｌ、ら、ジャーナル・オブバイロロジー、４４巻、３
９３頁（１９８２年）。
討する研究からＨＰＶ６．１１．１６゜１８．３１およ
び３３型が生殖器病変に高率で随伴することが判明した
［ギスマン、Ｌｏ、キャンサー・サーベイ、３巻、１６
１頁（１９８４年）、プフィスター、■１、バイオケミ
カル・ファーマコロジー、９９巻、１１１頁（１９８３
年）、ダースト、Ｍ、ら、プロシーディングズ・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オ
ブ・ジ・ＵＳＡ、８０巻、３８１２頁（１９８３年）、
ポジヤード、Ｍ、ら、ＥＭＢＯ・ジャーナル、３巻、１
１５１頁（１９８４年）、デ・ビリエールズ、Ｅ、−Ｍ
、ら、ジャーナル・オブ・バイｏｎジー（Ｊ、 ｖｉｒ
ｏｌ、）、４０巻、９３２頁（１９８１年）、ギスマン
、Ｌ、ら、ジャーナル・オブバイロロジー、４４巻、３
９３頁（１９８２年）。
ロリンツ、Ａ、Ｔ、ら、ジャーナル・オブ・パイロロジ
ー、５８巻、２２５頁（１９８６年）およびボーデノン
、Ｓ６、ネーチャ（Ｎａｔｕｒｅ）、３２１巻、２４６
頁（１９８６年）参照］。
ー、５８巻、２２５頁（１９８６年）およびボーデノン
、Ｓ６、ネーチャ（Ｎａｔｕｒｅ）、３２１巻、２４６
頁（１９８６年）参照］。
ＨＰＶはそのＤＮＡ配列の相似性に基づいて型分類が行
われる。２つのＨＰＶｆＪ（［和な緊縮ハイブリッド形
成条件下の溶液中のハイブリッド形成による測定で５０
％を超えてＤＮＡ交差反応するならば分類学上同一型で
あると分類される。この緊縮ハイブリッド形成条件は完
全に塩基対合した２本鎖ＤＮＡの融解温度より低い約２
５℃と定義され（＋’！宜的にＴｍ−２５℃と記載する
）、ついでヒドロキシアパタイトを使用したクロマトグ
ラフィーに掛け２本鎖ＤＮＡを１本ｊｉＤＮＡから分離
する［コギン、Ｊ、Ｒ，ら、キャンサー・リサーチ（Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、 ）、３９巻、５４５頁（１９７
９年）参照］、完全に塩基対合した２本鎖ＤＮＡの融解
温度（Ｔｍ）は下記の確立された式 ７式％ を用いて正確に予測することができる。
われる。２つのＨＰＶｆＪ（［和な緊縮ハイブリッド形
成条件下の溶液中のハイブリッド形成による測定で５０
％を超えてＤＮＡ交差反応するならば分類学上同一型で
あると分類される。この緊縮ハイブリッド形成条件は完
全に塩基対合した２本鎖ＤＮＡの融解温度より低い約２
５℃と定義され（＋’！宜的にＴｍ−２５℃と記載する
）、ついでヒドロキシアパタイトを使用したクロマトグ
ラフィーに掛け２本鎖ＤＮＡを１本ｊｉＤＮＡから分離
する［コギン、Ｊ、Ｒ，ら、キャンサー・リサーチ（Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、 ）、３９巻、５４５頁（１９７
９年）参照］、完全に塩基対合した２本鎖ＤＮＡの融解
温度（Ｔｍ）は下記の確立された式 ７式％ を用いて正確に予測することができる。
上記の式は、塩およびホルムアミド濃度を変えた溶１へ
中の各ｌＤＮＡ間で個々のＤＮＡに対するそれぞれのハ
イブリッド形成条件のＴｎ＋を実測する必要なく、非緊
縮および緊縮ハイブリッド形成条件を決定する標準点を
設定するのに好都合な手段を提供する。
中の各ｌＤＮＡ間で個々のＤＮＡに対するそれぞれのハ
イブリッド形成条件のＴｎ＋を実測する必要なく、非緊
縮および緊縮ハイブリッド形成条件を決定する標準点を
設定するのに好都合な手段を提供する。
もし緩和な緊縮条件下に溶液中で交差反応し、ヒト１７
キシアパタイトとの結合能によって測定され規定された
完全なまたは部分的な２本鎖構造を生成し得るＨＰＶ
ＤＮＡが、それぞれ５０％より少なければそれシのＨ
ＰＶＤＮＡは分類学上同一型に属すると分類するに足る
関係はない、この方法を用いた５０％交差反応の切捨て
は、命名の目的で新規ＨＰＶ型の帰属をきめるために合
意された基帛として用いられている。Ｉ−ＨＰＶＤＮＡ
間の交差反応度を測定するこの方法は、２つのＨＰＶ
ＤＮＡが共通の型の異なった単離体を表すのか、異なっ
た型の’４Ｍ体を表すのかを決定する方法として歴史的
に採用されてきた。この基準を使用するのはＨＰ Ｖ型
を決定し、定義する臨床的基準の確立以前のことである
。以Ｆさらに詳細に説明するようにＨＰＶ型を決定し、
これを定義する臨床的基準は生殖器病変間のＨＰ Ｖ型
の疫Ｔ的分布に基づいて行われる。
キシアパタイトとの結合能によって測定され規定された
完全なまたは部分的な２本鎖構造を生成し得るＨＰＶ
ＤＮＡが、それぞれ５０％より少なければそれシのＨ
ＰＶＤＮＡは分類学上同一型に属すると分類するに足る
関係はない、この方法を用いた５０％交差反応の切捨て
は、命名の目的で新規ＨＰＶ型の帰属をきめるために合
意された基帛として用いられている。Ｉ−ＨＰＶＤＮＡ
間の交差反応度を測定するこの方法は、２つのＨＰＶ
ＤＮＡが共通の型の異なった単離体を表すのか、異なっ
た型の’４Ｍ体を表すのかを決定する方法として歴史的
に採用されてきた。この基準を使用するのはＨＰ Ｖ型
を決定し、定義する臨床的基準の確立以前のことである
。以Ｆさらに詳細に説明するようにＨＰＶ型を決定し、
これを定義する臨床的基準は生殖器病変間のＨＰ Ｖ型
の疫Ｔ的分布に基づいて行われる。
交差反応度を測定する上記の方法は、ハイブリッド形成
反応後の完全にまたは部分的に２本鎖とな−）たＤＮＡ
分子の形成度を評価することに基づいている。然しなが
らＤＮＡの５０％が完全なまたは部分的な２本鎖ＤＮＡ
分子Ｉ＼変換されることは、ＤＮＡのヌクレオチド配列
が５０％相同であることを意味するものではないことに
注意すべきである。
反応後の完全にまたは部分的に２本鎖とな−）たＤＮＡ
分子の形成度を評価することに基づいている。然しなが
らＤＮＡの５０％が完全なまたは部分的な２本鎖ＤＮＡ
分子Ｉ＼変換されることは、ＤＮＡのヌクレオチド配列
が５０％相同であることを意味するものではないことに
注意すべきである。
Ｌ述のようにＨＰＶはまた、臨床的な基準に基づいて分
類できる。即ち上記の交差反応基準の順位によって定義
された異なった型のＨＰＶは１重症度の異なった生殖器
病変および異なった地理的集団間で際立った疫学的分布
を示す０例えばＨＰＶ６およびＨＰＶＩＩは主として外
長性コンジロームのような良性の病変に随伴し、それよ
り程度は少ないが口平コンジロームに随ｆＰする〔ギス
マン、ｉ−，ら、１０シーデイングズ・オプ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ジ・
ｔＪｓＡ、８０巻、５６０頁（１９８３年）参照コ、ま
たＨＰＶ６およびＨＰＶＩＩはある種の稀な型の悪性上
皮ｌ！瘍で検出される［ザコフ、Ｋ、Ｒ，ら、ネーチャ
ー、３００巻、７７１頁（１９８２年）およびランド−
１Ｒ，Ｅ、、ジャーナル・オブ・パイロロジー、５７巻
、３５３頁（１９８６年）］、これに反してＨＰＶ１６
、ＨＰＶＩ８、ＨＰＶ３１およびＨＰＶ３３は子宮頚癌
およびその他の上部生殖器癌およびそれらの前駆病変に
おいてさまざまな頻度で検出される［ダースト、Ｍ、ら
、１０シーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミ−・オプ・サイエンシズ・オブ・ジ・ＬＪＳＡ、８０
巻、３８１２頁（１９８３年）。
類できる。即ち上記の交差反応基準の順位によって定義
された異なった型のＨＰＶは１重症度の異なった生殖器
病変および異なった地理的集団間で際立った疫学的分布
を示す０例えばＨＰＶ６およびＨＰＶＩＩは主として外
長性コンジロームのような良性の病変に随伴し、それよ
り程度は少ないが口平コンジロームに随ｆＰする〔ギス
マン、ｉ−，ら、１０シーデイングズ・オプ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ジ・
ｔＪｓＡ、８０巻、５６０頁（１９８３年）参照コ、ま
たＨＰＶ６およびＨＰＶＩＩはある種の稀な型の悪性上
皮ｌ！瘍で検出される［ザコフ、Ｋ、Ｒ，ら、ネーチャ
ー、３００巻、７７１頁（１９８２年）およびランド−
１Ｒ，Ｅ、、ジャーナル・オブ・パイロロジー、５７巻
、３５３頁（１９８６年）］、これに反してＨＰＶ１６
、ＨＰＶＩ８、ＨＰＶ３１およびＨＰＶ３３は子宮頚癌
およびその他の上部生殖器癌およびそれらの前駆病変に
おいてさまざまな頻度で検出される［ダースト、Ｍ、ら
、１０シーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミ−・オプ・サイエンシズ・オブ・ジ・ＬＪＳＡ、８０
巻、３８１２頁（１９８３年）。
ポジヤード、Ｍ、ら、ＥＭＢＯ・ジャーナル、３巻、１
１５１頁（１９８４年）、ロリンツ、Δ、Ｔら、ジャー
ナル・オブ・パイロロジー、５８巻、２２５頁（１９８
６年）およびボーデノン、Ｓｌ、ネーチャー、３２１巻
、２４６頁（１９８６年）参照］ 、ＨＰＶ１６．ＨＰ
Ｖ１８、）ＨＰＶ３１およびＨＰＶ３３のこの分布は、
ＨＰ Ｖ ６および４（ＰＶｌｌに感染しり病変と比べ
て［ＨＰＶ１６．１４ｐｖｉｓ、ＨＰＶ３１およびＨＰ
Ｖ３３に感染した生殖器病変から発症した子宮頚癌の危
険が一層大きく、その進行も一層急速であることを反映
したものと信じられる。
１５１頁（１９８４年）、ロリンツ、Δ、Ｔら、ジャー
ナル・オブ・パイロロジー、５８巻、２２５頁（１９８
６年）およびボーデノン、Ｓｌ、ネーチャー、３２１巻
、２４６頁（１９８６年）参照］ 、ＨＰＶ１６．ＨＰ
Ｖ１８、）ＨＰＶ３１およびＨＰＶ３３のこの分布は、
ＨＰ Ｖ ６および４（ＰＶｌｌに感染しり病変と比べ
て［ＨＰＶ１６．１４ｐｖｉｓ、ＨＰＶ３１およびＨＰ
Ｖ３３に感染した生殖器病変から発症した子宮頚癌の危
険が一層大きく、その進行も一層急速であることを反映
したものと信じられる。
米国の一連の生検では、異形成および悪性子宮頚部病変
９３例の約５６％にＨＰＶ６．１１，１６．１８および
３１型が検出されている。病変の残りの４４％は緩和な
ハイブリッド形成条件によってのみ検出し得たウィルス
性配列（５０％）がもしくはＨＰＶ ＤＮＡの存在を示
し得ながったものである９Ｍ和なハイブリッド形成条件
によって検出されたＨＰＶ陽性検体のうち５６％はＩ−
Ｉ ＰＶ３３．３５．４２．４３．４４または４５の何
れかを含んでいることが判明した。またＨＰＶＩ６はア
フリカよりヨーロッパで一層多くＥダースト、Ｍ、ら、
プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
−・オブ・サイエンシズ・オプ・ジ・ＵＳＡ、８０巻、
３８１２頁（１９８３年）］、一方ＨＰＶ１８はヨーロ
ッパよりアフリカで一層多い［ポジヤード、Ｍ、ら、Ｅ
ＭＢＯ・ジャーナル、３巻、１１５１頁（１９８４年）
］。
９３例の約５６％にＨＰＶ６．１１，１６．１８および
３１型が検出されている。病変の残りの４４％は緩和な
ハイブリッド形成条件によってのみ検出し得たウィルス
性配列（５０％）がもしくはＨＰＶ ＤＮＡの存在を示
し得ながったものである９Ｍ和なハイブリッド形成条件
によって検出されたＨＰＶ陽性検体のうち５６％はＩ−
Ｉ ＰＶ３３．３５．４２．４３．４４または４５の何
れかを含んでいることが判明した。またＨＰＶＩ６はア
フリカよりヨーロッパで一層多くＥダースト、Ｍ、ら、
プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
−・オブ・サイエンシズ・オプ・ジ・ＵＳＡ、８０巻、
３８１２頁（１９８３年）］、一方ＨＰＶ１８はヨーロ
ッパよりアフリカで一層多い［ポジヤード、Ｍ、ら、Ｅ
ＭＢＯ・ジャーナル、３巻、１１５１頁（１９８４年）
］。
したがってＨＰＶ型の決定は臨床於断上価値があり、Ｈ
ＰＶ感染の徴候を示す患者における発癌の危険性を評価
する上で重要な要素である。評価された発癌の危険性に
基づいて好適な臨床処置を選ぶことができる。
ＰＶ感染の徴候を示す患者における発癌の危険性を評価
する上で重要な要素である。評価された発癌の危険性に
基づいて好適な臨床処置を選ぶことができる。
Ｂ、ＨＰＶ型のクローニング
組換えＤＮＡクローニング手法はＨＰＶ６．１１．１６
，１８．３１および３３型のような多数の１１ Ｆ）
Ｖ型のＤＮＡｔ単離し精製することを可能とした［ダー
スト、Ｍ、ら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ジ・［
ＪＳＡ、８０巻、３８１２頁（１９８３年）、ポジヤー
ド＝Ｍ、ら、ＥＭＢＯ・ジャーナル、３巻、１１５１頁
（１９８４年）、デ・ビリエールズ、Ｅ 、−Ｍ 、ら
、ジャーナル・オブ・パイロロジー、４０巻、９３２頁
（１９８１年）、ギスマン、１４．ら、ジャーナル・オ
プ・パイロロジー、４４巻、３９３頁（１９８２年）、
ロリンツ、Ａ、Ｔ、ら、ジャーナル・オブ・パイロロジ
ー、５８巻、２２５頁（１９８６年）およびボーデノン
、Ｓ９、ネーチャー、３２１巻、２４６頁（１９８６年
）参照］、ＨＰＶに関する知識の大部分はそのような組
換えＤＮＡにおけるＤＮＡ配列の研究および組織検体中
のＨＰＶを検出するためこれらのＤＮＡを核酸ハイブリ
ダイゼーションプローブ生産に使用することからもたら
された。
，１８．３１および３３型のような多数の１１ Ｆ）
Ｖ型のＤＮＡｔ単離し精製することを可能とした［ダー
スト、Ｍ、ら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ジ・［
ＪＳＡ、８０巻、３８１２頁（１９８３年）、ポジヤー
ド＝Ｍ、ら、ＥＭＢＯ・ジャーナル、３巻、１１５１頁
（１９８４年）、デ・ビリエールズ、Ｅ 、−Ｍ 、ら
、ジャーナル・オブ・パイロロジー、４０巻、９３２頁
（１９８１年）、ギスマン、１４．ら、ジャーナル・オ
プ・パイロロジー、４４巻、３９３頁（１９８２年）、
ロリンツ、Ａ、Ｔ、ら、ジャーナル・オブ・パイロロジ
ー、５８巻、２２５頁（１９８６年）およびボーデノン
、Ｓ９、ネーチャー、３２１巻、２４６頁（１９８６年
）参照］、ＨＰＶに関する知識の大部分はそのような組
換えＤＮＡにおけるＤＮＡ配列の研究および組織検体中
のＨＰＶを検出するためこれらのＤＮＡを核酸ハイブリ
ダイゼーションプローブ生産に使用することからもたら
された。
Ｃ，ハイブリダイゼーションプローブ
上述のようにＨＰＶ ＤＮＡはＨＰ Ｖ型を鑑別するハ
イブリダイゼーションプローブとして使用されてきた。
イブリダイゼーションプローブとして使用されてきた。
異なった型の２つのＩ−ＩＰＶＤＮＡを緊縮ハイブリッ
ド形成条件下にハイブリッド形成することによって容易
に区別できる。この緊縮ハイブリッド形成条件は、完全
に塩基対合した２本鎖ＤＮＡハイブリッドの融解温度よ
り約１０℃低温で（便宜的にＴｍ−１０℃と記載する）
そのようなハイブリダイゼーションプローブを使用する
と定義される。同様に１つの型のＨＰＶ ＤＮＡを緊縮
ハイブリッド形成条件下にハイブリッド形成することに
よって別の型のＨＰＶ ＲＮＡと容易に区別できる。こ
の緊縮ハイブリッド形成条件は、完全に塩基対合した２
本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの融解温度より約１０
℃低温で（便宜的にＴｍ−１０℃と記載する）そのよう
なハイブリダイゼーションプローブを使用すると定義さ
れる。
ド形成条件下にハイブリッド形成することによって容易
に区別できる。この緊縮ハイブリッド形成条件は、完全
に塩基対合した２本鎖ＤＮＡハイブリッドの融解温度よ
り約１０℃低温で（便宜的にＴｍ−１０℃と記載する）
そのようなハイブリダイゼーションプローブを使用する
と定義される。同様に１つの型のＨＰＶ ＤＮＡを緊縮
ハイブリッド形成条件下にハイブリッド形成することに
よって別の型のＨＰＶ ＲＮＡと容易に区別できる。こ
の緊縮ハイブリッド形成条件は、完全に塩基対合した２
本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの融解温度より約１０
℃低温で（便宜的にＴｍ−１０℃と記載する）そのよう
なハイブリダイゼーションプローブを使用すると定義さ
れる。
また異なった型の２つのＨＰＶ ＲＮＡを緊縮ハイブリ
ッド形成条件下にハイブリッド形成することによって容
易に区別できる。この緊縮ハイブリッド形成条件は、完
全に塩基対合した２本鎖ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの
融解温度より約１０℃低温で（便宜的にＴｍ−１０℃と
記載する）そのようなハイブリダイゼーションプローブ
を使用すると定義される。上記の基準を用いて異なった
型と指定されたＨＰＶ ＤＮＡまたはＲＮＡが、実際に
は共通なヌクレオチド配列を８０％程度まで有し得るこ
とに注意すべきである。
ッド形成条件下にハイブリッド形成することによって容
易に区別できる。この緊縮ハイブリッド形成条件は、完
全に塩基対合した２本鎖ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの
融解温度より約１０℃低温で（便宜的にＴｍ−１０℃と
記載する）そのようなハイブリダイゼーションプローブ
を使用すると定義される。上記の基準を用いて異なった
型と指定されたＨＰＶ ＤＮＡまたはＲＮＡが、実際に
は共通なヌクレオチド配列を８０％程度まで有し得るこ
とに注意すべきである。
また異なった型の２つのＨＰＶ ＤＮＡを非緊縮ハイブ
リッド形成条件下に交差反応することができる。この非
緊縮ハイブリッド形成条件は、完全に塩基対合した２本
鎖ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの融解温度より約３５℃
またはそれ以上低温で（便宜的にＴｍ−３５℃またはそ
れ以上と記載する）そのようなハイブリダイゼーション
プローブを使用すると定義される。同様に１つの型のＨ
ＰＶ ＤＮＡを別の型のＨＰＶ ＲＮＡと非緊縮ハイブ
リッド形成条件下に交差反応することができる。
リッド形成条件下に交差反応することができる。この非
緊縮ハイブリッド形成条件は、完全に塩基対合した２本
鎖ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの融解温度より約３５℃
またはそれ以上低温で（便宜的にＴｍ−３５℃またはそ
れ以上と記載する）そのようなハイブリダイゼーション
プローブを使用すると定義される。同様に１つの型のＨ
ＰＶ ＤＮＡを別の型のＨＰＶ ＲＮＡと非緊縮ハイブ
リッド形成条件下に交差反応することができる。
この非緊縮ハイブリッド形成条件は、完全に塩基対合し
た２本ｊｌ［ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの融解温度よ
り約３５℃またはそれ以上低温で（便宜的にＴｌ１ｌ−
３５℃またはそれ以上と記載する）そのようなハイブリ
ダイゼーションプローブを使用すると定義される。また
異なった型の２つのＨＰＶＲＮＡを非緊縮ハイブリッド
形成条件下に交差反応することができる。この非緊縮ハ
イブリッド形成条件は、完全に塩基対合した２本鎖ＲＮ
Ａ−ＲＮＡハイブリッドの融解温度より約３５℃または
それ以上低温で（便宜的にＴｎ＋−３５℃またはそれ以
上と記載する）そのようなハイブリダイゼーションプロ
ーブを使用すると定義される［アンダーソン、Ｌ、Ｍ、
、ヌクレイツク・アシブト・ハイプリダイゼーシＥｌ
７ （Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａ
ｔｉｏｎ）、７３〜１１１頁、Ｂ、Ｄ、ヘイムズおよび
Ｓ、Ｊ。
た２本ｊｌ［ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの融解温度よ
り約３５℃またはそれ以上低温で（便宜的にＴｌ１ｌ−
３５℃またはそれ以上と記載する）そのようなハイブリ
ダイゼーションプローブを使用すると定義される。また
異なった型の２つのＨＰＶＲＮＡを非緊縮ハイブリッド
形成条件下に交差反応することができる。この非緊縮ハ
イブリッド形成条件は、完全に塩基対合した２本鎖ＲＮ
Ａ−ＲＮＡハイブリッドの融解温度より約３５℃または
それ以上低温で（便宜的にＴｎ＋−３５℃またはそれ以
上と記載する）そのようなハイブリダイゼーションプロ
ーブを使用すると定義される［アンダーソン、Ｌ、Ｍ、
、ヌクレイツク・アシブト・ハイプリダイゼーシＥｌ
７ （Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａ
ｔｉｏｎ）、７３〜１１１頁、Ｂ、Ｄ、ヘイムズおよび
Ｓ、Ｊ。
ヒギンズ編、Ｉ 、Ｒ，Ｌ、プレス（ｌＲ，Ｌ、 Ｐｒ
ｅｓｓ）、オックスフォード（Ｏｘｆｏｒｄ）、英国お
よびワシントン（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）、 Ｄ、Ｃ，
、米国（１９８５年）参照］。
ｅｓｓ）、オックスフォード（Ｏｘｆｏｒｄ）、英国お
よびワシントン（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）、 Ｄ、Ｃ，
、米国（１９８５年）参照］。
同一ヌクレオチド配列のＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮ
ＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの融解温度は種々
の化学環境で変わり得る。これらさまざまなハイブリッ
ドの相対融解温度に対する各種ｆヒ合物の効果が幾っが
の薬物について検討された１例えばホルムアミド濃度を
さまざまに増加させるとＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドは
ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドより一層不安定になり、し
たがって８０％（Ｖ／Ｖ）のようなホルムアミドの高濃
度ではＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドはそれと同じヌクレ
オチド配列のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドより著しく高
い融解温度を示し得る。
ＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの融解温度は種々
の化学環境で変わり得る。これらさまざまなハイブリッ
ドの相対融解温度に対する各種ｆヒ合物の効果が幾っが
の薬物について検討された１例えばホルムアミド濃度を
さまざまに増加させるとＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドは
ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドより一層不安定になり、し
たがって８０％（Ｖ／Ｖ）のようなホルムアミドの高濃
度ではＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドはそれと同じヌクレ
オチド配列のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドより著しく高
い融解温度を示し得る。
Ｅ述のようにＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの融解温度は
アンダーソンらの報告のように予測できる［ヌクレイツ
ク・アシッド・ハイブリダイゼーション、７３〜１１１
頁、Ｂ、Ｄ、ヘイノ、ズおよびＳ、Ｊ、ヒギンズ編、１
．Ｒ，Ｌ、プレス、オックスフォード、英国およびワシ
ントン、Ｄ、Ｃ，、米国（１９８５年）参照］、またＤ
ＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの融解温度はハウレイ、Ｐ、
らの報告のように実測することができる［ジャーナル・
オプ・バイオケミストリー（Ｊ、 ［ｌｉｏｃｈｅｍ、
）、２５４巻、４８７６頁（１９７９年）］、またＤＮ
Ａ−ＲＮＡハイブリッドおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリ
ッドの融解温度は従来技術上よく知られた方法によって
測定できる。
アンダーソンらの報告のように予測できる［ヌクレイツ
ク・アシッド・ハイブリダイゼーション、７３〜１１１
頁、Ｂ、Ｄ、ヘイノ、ズおよびＳ、Ｊ、ヒギンズ編、１
．Ｒ，Ｌ、プレス、オックスフォード、英国およびワシ
ントン、Ｄ、Ｃ，、米国（１９８５年）参照］、またＤ
ＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの融解温度はハウレイ、Ｐ、
らの報告のように実測することができる［ジャーナル・
オプ・バイオケミストリー（Ｊ、 ［ｌｉｏｃｈｅｍ、
）、２５４巻、４８７６頁（１９７９年）］、またＤＮ
Ａ−ＲＮＡハイブリッドおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリ
ッドの融解温度は従来技術上よく知られた方法によって
測定できる。
このようにハイブリッド形成にどのような条件を採用す
るかく即ち非緊縮条件か、または緊縮条件か）により左
右される核酸ハイブリッド形成によって、ＨＰＶＤＮＡ
またはＲＮＡの一般的な存在および／または個々のＨＰ
Ｖ ＤＮＡ型またはＲＮＡ型について組織検体を検査で
きる。
るかく即ち非緊縮条件か、または緊縮条件か）により左
右される核酸ハイブリッド形成によって、ＨＰＶＤＮＡ
またはＲＮＡの一般的な存在および／または個々のＨＰ
Ｖ ＤＮＡ型またはＲＮＡ型について組織検体を検査で
きる。
［発明の構成］
この発明では、子宮頚癌の発症に役割を演じ得るＨＰＶ
５２と命名した新しいＨＰＶ型が存在することが判明し
た。
５２と命名した新しいＨＰＶ型が存在することが判明し
た。
したがってこの発明の目的はＨＰＶ５２型に特異的であ
る核酸ハイブリダイゼーションプローブを提供すること
にある。
る核酸ハイブリダイゼーションプローブを提供すること
にある。
この発明のもう一つの目的は、未知のＤＮＡまたはＲＮ
Ａ検体、特に子宮頚癌発症の危険性を測定するため生殖
器病変から得られた未知のＤＮＡまたはＲＮＡ検体中の
ＨＰＶ ＤＮＡ一般 またはＲＮＡおよび特定のＨ
ＰＶ５２型ＤＮＡまたはＲＮＡを検出する方法を提供す
ることにある。
Ａ検体、特に子宮頚癌発症の危険性を測定するため生殖
器病変から得られた未知のＤＮＡまたはＲＮＡ検体中の
ＨＰＶ ＤＮＡ一般 またはＲＮＡおよび特定のＨ
ＰＶ５２型ＤＮＡまたはＲＮＡを検出する方法を提供す
ることにある。
以下に提供する詳細な説明によってこの発明のこれらお
よびその他の目的を明らかにする。
よびその他の目的を明らかにする。
この発明は一態様として、クローニングベクターおよび
ｌ−Ｉ Ｐ Ｖ ５２ Ｄ Ｎ Ａの実質上全体または
その断片を含んだＨＰＶ５２の組換えＤＮＡによって上
記の目的を達成した。
ｌ−Ｉ Ｐ Ｖ ５２ Ｄ Ｎ Ａの実質上全体または
その断片を含んだＨＰＶ５２の組換えＤＮＡによって上
記の目的を達成した。
またこの発明はもう一つの態様として、本質的に純粋な
ＨＰＶ５２ＤＮＡまたはその断片、またはＨＰＶ５２Ｒ
ＮＡまたはその断片、またはそれらの混合物により、ま
た検出し得るマーカーで標識した一般的なＨＰＶ ＤＮ
ＡまたはＲＮＡおよび特定のＨＰ Ｖ ５２ Ｄ Ｎ
ＡまたはＲＮＡのための核酸ハイブリダイゼーションプ
ローブによって上記の目的を達成した。
ＨＰＶ５２ＤＮＡまたはその断片、またはＨＰＶ５２Ｒ
ＮＡまたはその断片、またはそれらの混合物により、ま
た検出し得るマーカーで標識した一般的なＨＰＶ ＤＮ
ＡまたはＲＮＡおよび特定のＨＰ Ｖ ５２ Ｄ Ｎ
ＡまたはＲＮＡのための核酸ハイブリダイゼーションプ
ローブによって上記の目的を達成した。
さらにこの発明はもう一つの態様として（１） （ａ）
（ｉ ）マーカーで標識したＨＰＶ５２ＤＮＡまたは
その断片および （ｉ）マーカーで標識したＨＰＶ５２ ＲＮＡまたはその断片 からなる群から選ばれた構成成分と （ｂ）ＤＮＡまたはＲＮＡの未知の検体とで非緊縮条件
下にハイブリッド形成を実施し、（２）その検体中のＨ
ＰＶ ＤＮＡまたはＲＮＡを検出するために交差反応の
存在を検定することからなるＨＰＶ ＤＮＡまたはＲＮ
Ａの検出方法により上記の目的を達成した。
（ｉ ）マーカーで標識したＨＰＶ５２ＤＮＡまたは
その断片および （ｉ）マーカーで標識したＨＰＶ５２ ＲＮＡまたはその断片 からなる群から選ばれた構成成分と （ｂ）ＤＮＡまたはＲＮＡの未知の検体とで非緊縮条件
下にハイブリッド形成を実施し、（２）その検体中のＨ
ＰＶ ＤＮＡまたはＲＮＡを検出するために交差反応の
存在を検定することからなるＨＰＶ ＤＮＡまたはＲＮ
Ａの検出方法により上記の目的を達成した。
さらにこの発明はもう一つの態様として（１）（ａ）（
ｉ＞７−カーで標識した）−Ｉ Ｐ Ｖ ５２ＤＮＡま
たはその断片および （ｉ）マーｈ−で標識したＨＰＶ５２ ＲＮＡまたはその断片 からなる群から選ばれた構成成分と （ｂ）ＤＮＡまたはＲＮＡの未知の検体とで緊縮条件下
にハイブリッド形成を実施し、（２）その検体中のＨＰ
Ｖ５２ＤＮＡまたはＲＮＡを検出するために交差反応の
存在を検定することからなるＨＰＶ５２ＤＮＡまたはＲ
ＮＡの検出方法により上記の目的を達成した。
ｉ＞７−カーで標識した）−Ｉ Ｐ Ｖ ５２ＤＮＡま
たはその断片および （ｉ）マーｈ−で標識したＨＰＶ５２ ＲＮＡまたはその断片 からなる群から選ばれた構成成分と （ｂ）ＤＮＡまたはＲＮＡの未知の検体とで緊縮条件下
にハイブリッド形成を実施し、（２）その検体中のＨＰ
Ｖ５２ＤＮＡまたはＲＮＡを検出するために交差反応の
存在を検定することからなるＨＰＶ５２ＤＮＡまたはＲ
ＮＡの検出方法により上記の目的を達成した。
第１図はｐＣＤｌ ５の１９５０塩基ヌクレオチド配列
、非コード領域を示す。 第２図はＨＰＶ５２に対する制限酵素切断パターンの略
図を示す。 第３図は非緊縮ハイブリッド形成条件下で核酸ハイブリ
ッド形成により測定されたＨＰＶ３３とＨＰＶ５２ＤＮ
Ａの間の部分的相同領域を示す。 相同性を有する領域を矢印で示す、相同地図上にＨＰＶ
３３に属すると推定される転写解読枠の位置を示す、鶏
影を付けた区域は殆どまたは全く相同でない領域を示す
、実線矢印は強い相同領域、点線矢印は弱い相同領域を
示す。 第４図はＨＰＶ５２とＨＰＶ３３とのＬ１転写解読枠お
よび非コード領域の相同配列の比較を略図で示したもの
である。 ［発明の実施態様］ これまで未知であったＨ Ｐ Ｖ型がこの発明で発見さ
れ、これをＨＰＶ５２と命名した。この発明で最初にＨ
ＰＶ５２をクローン化し、これによって未知のＤＮＡま
たはＲＮＡ検体、ことに生殖器病変から得られた未知の
ＤＮＡまたはＲＮＡ検体中の一般的なＨＰＶ ＤＮＡま
たはＲＮＡの検出および特定のＨＰＶ５２ＤＮＡまたは
ＲＮＡの検出のための核酸ハイブリダイゼーションプロ
ーブの生産が可能となった。 ワシントンＤ、Ｃ，地域から入手した２例の軽症異形成
の生検検体を合わせたＤＮＡからＨＰＶ５２を単離し、
クローン化した。 この発明で最初にＨＰＶ５２のクローン化を提供した実
施例で使用した特異的なりローニングベクターはλＬ４
７である。１０５プラークからＨＰＶ１６との非緊縮ハ
イブリッド形成により陽性を示したプラークをサザーン
プロット分析でスクリーニングした。制限酵素分析によ
って測定して３個のプラークが同一のＤＮＡを含んでい
た。１つの単離体をｐＵＣヘクローン化し、これをＰＣ
Ｄ１５と命名したしメッシング、Ｊ、（１９８３年）、
メソッズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈ。 Ｅｎｚｙｍｏｌ 、 ）、１０１Ｃ巻、２０〜７８頁］
。 ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼを用いてＨＰ Ｖ５
２ＤＮＡ全体をクローンｐｃＤ１５から切り出し、任意
の原核および真核クローニングベクターでサブクローン
化できる。ＨＰＶ５２のサブクローニングに使用する個
々のクローニングベクターは決定的なものではな（ｐＵ
ｃｌｌ、λシャロンのようなλ誘導ベクターまたはＭ１
３誘導バクテリオファージのような任意の既知の原核ク
ローニングベクターであることができ［マニアティス、
Ｔ、ら、モレキュラー・バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒＢｉｏｌｏｇｙ）、ア・ラボラトリ−・マニュアル
（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コール
ド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、コールド・
スプリング・ハーバ−、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ）、（１９８２年）およびローエネン、Ｗ、Ａ、Ｍ、
ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）、２０巻、２４９頁（１９８０
年）参照］、あるいはＰＺＩＰ−ネオ５Ｖ（Ｘ１］また
はｐＢＫＴＫ−１のような任意の既知の真核クローニン
グベクターでもよい〔プーイールズ、Ｐ、Ｈ，ら、クロ
ーニング・ベクターズ（ＣＩｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒ
ｓ）、ア・ラボラトリ−・マニュアル（Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、エルセーベル（Ｅｌｓｅ
ｉｖｅｒ）、アムステルダム（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）
（１９８５年）参照］。 同様にその他の周知の制限エンドヌクレアーゼを用いて
ＨＰＶ５２ＤＮＡの断片をＨＰＶ５２クローンｐｃＤ１
５から切り出し、上記のクローニングベクターでクロー
ン化することができる。 ＨＰＶ５２ＤＮＡまたはその断片のクローニングによっ
て、一般的なＨＰＶ ＤＮＡまたはＲＮＡおよび特定の
ＨＰＶ５２ＤＮＡまたはＲＮＡのための核酸ハイブリダ
イゼーションプローブ生産に使用する多量のＨＰＶ５２
ＤＮＡまたはその断片を比較的簡単に生産することがで
きる。 ２つのＨＰＶ ＲＮＡＭのハイブリッド形成は２つのＨ
ＰＶ ＤＮＡ鎖のハイブリッド形成と同様であって、２
つのＨＰＶ ＲＮＡ鎖が相互に相補的である場合、即ち
ＨＰＶ ＲＮＡのセンス頒がＨＰＶ ＲＮＡのアンチセ
ンス鎖とハイブリッド形成するときに起こる。したがっ
てｒＨＰＶＲＮＡ、の語にはセンスおよびアンチセンス
ＨＰＶ ＲＮＡ配列の双方が含まれている。ＨＰＶセン
スｊｉＲＮＡは、１−（ＰＶ ＤＮＡがら転写されたＨ
ＰＶ ＲＮＡに見出されるＨＰＶ ＲＮＡ配列である。 ＨＰＶアンチセンス鎖ＲＮＡとはセンス鎖ＲＮＡと対合
し、これと２本鎖ＲＮＡを生成し得るＨＰＶセンスＲＮ
Ａ［と相補的なＲＮＡを意味する。センス鎖ＲＮＡは５
°および３゛の翻訳されない配列のようなコード領域お
よび非コード領域を含み得る。アンチセンスＨＰＶ Ｒ
ＮＡはＨＰＶ ＲＮＡセンス鎖上に存在している任意の
配列の相補鎖を含んでいる。 ＨＰＶ５２ＤＮＡまたはその断片をその他の周知のクロ
ーニングベクターでサブクローン化し、クローニングベ
クターへ挿入されたＨＰＶ５２ＤＮＡと相同なＲＮＡの
試験管内合成を促進する特定のクローニングベクターの
特殊な性質を利用することができる［マニアティス、Ｔ
、ら、モレキュラー・バイオロジー、ア・ラボラトリ−
・マニュアル、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボ
ラトリ−、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨ
ーク（１９８２年）参照］、これらのクローニングベク
ターの例を挙げればｐＴ７１２およびｐＴ７１３等であ
って、何れもＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ［ガイザースバーグ（
Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、ＭＤＩから商業的に入手
できる。ＨＰＶ５２ＤＮＡまたはその断片は、これらの
クローニングベクターへＨＰＶ５２ＤＮＡまたはその断
片が例えばＴ７、Ｔ３またはＳＰ６のようなＲＮＡポリ
メラーゼを暗号化しているファージのための有効な鋳型
として作動し得るようにサブクローン化することができ
る。そのようなりローニングベクターおよびそのような
ＲＮＡポリメラーゼを利用し、ＨＰＶ５２ＤＮＡの鎖の
１つまたはその断片の何れかと相補的なＨＰＶ５２ＲＮ
Ａを従来技術周知の方法を用いた試験管内転写により合
成することができる。 ＨＰＶ５２ＤＮＡまたはその断片を含んだクロニングベ
クターを発育させるための特異的な細菌または真核細胞
宿主は使用したクローニングベクターによって異なる０
例えばλＬ４７でクローン化したＨＰＶ５２ＤＮＡを発
育させる代表的な宿主はエシェリキア・コリ（Ｅ、 ｃ
ｏｌｉ） Ｎ Ｍ ５３８等である［フリシャンフ、Ａ
、Ｍ、ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジー（Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、）、１７０巻、８２
７頁（１９８３年）］、エシェリキア・コリＩ−Ｉ Ｂ
１０１のようなその他の宿主［ボイヤー、Ｈ，Ｗ、ら
、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、４
１巻、４５９頁（１９６９年）］はｐＢＲ３２２または
ｐＵｃｌｌをクローニングベクターとして用いた際に使
用できる。ＰＺＩＰ−ネオＳＶ［Ｘ１］でクローン化し
たＨＰＶ５２ＤＮＡを発育させる代表的な宿主はサルＣ
ｏ５１ｌ砲であるが、ｐＢＫＴＫ−１でクローン化した
ＨＰＶ５２ＤＮＡを発育させる代表的な宿主は多数のよ
く知られている任意の補乳動物細胞系である［ブーイー
ルズ、Ｐ、Ｈ，ら、クローニング・ベクターズ、ア・ラ
ボラトリ−・マヱユアル、エルセーベル、アムステルダ
ム（１９８５年）、参照］。 本質的に精製したＨＰＶ５２ＤＮＡまたはＲＮＡまたは
それらの断片はまた、形質転換種を作り出すＩ−Ｉ Ｐ
Ｖ感染を正常では起こし得ない高等生物体の生殖細胞
系または体細胞へ永久的に挿入し得る［イエイニッシュ
、Ｒ１、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２４０巻、１
４６８〜１４７４頁（１９８８年）］。 高等生物体または多細胞生物体とは酵母等を含む任意の
多＃Ｉ脂動物または植物を意味する。ＨＰＶ５２ＤＮＡ
またはＲＮＡまたはそれらの断片は生殖細胞系の前核へ
直接注入により、またはレトロウィルス感染により、ま
たはレトロウィルス性ベクター、Ｔｉプラスミドベクタ
ー（植物用）または胚幹紺胞の使用により多細胞生物体
細胞の染色体ＤＮＡへ挿入できる。そのようにして作り
出された形質転換種はＨＰＶによって生じる疾患の病原
研究またはＨＰＶ特異的なりＮＡ、ＲＮＡまたはタンパ
ク質のような成分の生産のための貯蔵体として有用であ
る［イエイニツシュ、前掲、およびヴアーマス、Ｈ８、
サイエンス、２４０巻、１４２７〜１４３５頁（１９８
８年）、ホトスタイン。 Ｄ、ら、サイエンス、２４０巻、１４３９〜１４４３頁
（１９８８年）］。 この発明のプローブの一般的なＨＰＶ ＤＮＡまたはＲ
ＮＡまたは特定のＨＰＶ５２ＤＮＡまたはＲＮＡ／＼の
ハイブリッド形成は、それに用いたハイブリッド形成条
件によって左右される。即ち非緊縮ハイブリ・アト形成
条件下では、ＨＰＶ５２ＤＮＡまたはその断片またはＨ
ＰＶ５２ＲＮＡまたはその断片は一般的なＨＰＶ ＤＮ
ＡまたはＲＮＡのためのハイブリダイゼーションプロー
ブとして使用できる。これに反して緊縮ハイブリッド形
成条件下では、ＨＰＶ５２ＤＮＡまたはその断片は特定
のＨＰＶ５２ＤＮＡまたはＲＮＡのためのハイブリダイ
ゼーションプローブとして使用できる。 上述のように異なった型のＨＰＶのＤＮＡおよびＲＮＡ
は非緊縮ハイブリッド形成条件下では、即ち一般群とし
てＨＰＶ ＤＮＡまたはＲＮＡのと等しい塩基構成を
有する完全に塩基対合した２本鎖ＤＮＡの融解温度より
約３５℃またはそれ以上低温で交差反応することができ
る。 したがって非緊縮ハイブリッド形成条件下で、即ち一般
群としてＨＰＶ ＤＮＡまたはＲＮＡと等しい塩基構成
を有する完全に対合した２本ＭＤＮＡの融解温度より約
３５℃低温でハイブリッド形成を実施することによって
、未知のＤＮＡまたはＲＮＡ検体をＨＰＶ型の存在につ
いて試験することができる。 また緊縮ハイブリッド形成条件下で、即ち一般群として
ＨＰＶ ＤＮＡまたはＲＮＡと等しい塩基構成を有する
完全に塩基対合した２本ｇＤＮＡの融解温度より杓１０
℃低温でハイブリッド形成を実施することによって、未
知のＤＮＡまたはＲＮＡ検体を特定のＨＰＶ型の存在に
ついて試験してその型を同定することができる。 この発明の方法で非緊縮条件下のハイブリッド形成は、
まず非緊縮ハイブリッド形成条件下でハイブリッドを形
成し、ついで非緊縮ハイブリッド形成条件下にこれを洗
浄することによって実施される。 またこの発明の方法で緊縮条件下のハイブリッド形成は
、まず非緊縮ハイブリッド形成条件下でハイブリッドを
形成し、ついで緊縮ハイブリッド形成条件下にこれを洗
浄するか、あるいはまず緊縮ハイブリッド形成条件下で
ハイブリッド形成をし、ついで緊縮ハイブリッド形成条
件下にこれを洗浄する何れかによって実施される。最初
の方法、即ちまず非緊縮ハイブリッド形成条件下でハイ
ブリッドを形成し、ついで緊縮ハイブリッド形成条件下
にこれを洗浄する方法では、異なった型のＤＮＡまたは
ＲＮＡ間で生成したハイブリッドは不安定であるが、同
−型のＤＮＡまたはＲＮＡ間で生成したハイブリッドは
安定である。 使用するハイブリダイゼーションプローブとして、未知
のＤＮＡまたはＲＮＡ検体が同−ＨＰＶ型であるか異な
ったＨＰＶ型であるかを決定するには、ハイブリッド形
成を好ましくは非緊縮ハイブリッド形成条件下で実施し
、ついで非緊縮ハイブリッド形成条件下にこれを洗浄す
る。ハイブリッドの存在を検定した後、検出したハイブ
リッドを緊縮ハイブリッド形成条件下に洗浄する。この
方法では、非緊縮ハイブリッド形成条件下でハイブリッ
ド形成した後に残っているハイブリッド量を測定し、緊
縮ハイブリッド形成条件下に洗浄した後も存在している
ハイブリッド量と比較する。 もし生成したハイブリッドの量が緊縮ハイブリッド形成
条件下の洗浄によって全くもしくは極めて少量しか減少
を示さないならば、これは初めに生成したハイブリッド
、即ち非緊縮ハイブリッド形成条件下に生成したハイブ
リッドが同−型のＤＮＡまたはＲＮＡ間のものであるこ
とを示している。 逆にハイブリッドが消失したり、あるいは緊縮ハイブリ
ッド形成条件下に洗浄した後、残存しているハイブリッ
ド量が著しく減少した場合は、初めに生成したハイブリ
ッド、即ち非緊縮ハイブリッド形成条件下に生成したハ
イブリッドが異なった型のＤＮＡまたはＲＮＡ間のもの
であることを示している。 したがってこの発明の方法で、２つのＨＰＶが上述の交
差反応度に関する基準に適合するならば２つのＨＰＶは
同−型であると考えられる。 緊縮ハイブリッド形成条件下に、未知のＤＮＡまたはＲ
ＮＡ検体と結合するＨＰＶ ＤＮＡまたはＲＮＡの結合
能は高度のヌクレオチド配列相同性を示す指標である。 これに反して未知のＤＮＡまたはＲＮＡ検体と非緊縮ハ
イブリッド形成条件下でのみ結合するＨＰＶ ＤＮＡま
たはＲＮＡの結合能は低いヌクレオチド配列相同性また
は中間的な配列相同性を示す指標である。正確なヌクレ
オチド配列の相同性の程度は未知のＤＮＡを直接配列決
定し、これを既知のＨＰＶ ＤＮＡの配列と比較するこ
とによってのみ決定できる。 未知のＤＮＡまたはＲＮＡ検体、例えば生殖器病変から
得られた未知のＤＮＡまたはＲＮＡ検体中の一般的なＨ
ＰＶ ＤＮＡまたはＲＮＡの検出を実施するような際は
、実際問題としてハイブリダイゼーションプローブの混
合物を含有するハイブリダイゼーション１０−１組成物
を利用するのが好都合である。これらのハイブリダイゼ
ーションプローブには、未知のＤＮＡまたはＲＮＡ検体
で存在が疑われるすべての型またはその大部分を代表す
る配列を有する１０−ブを含有する。ＨＰＶ６．１１．
１６．１８．３１．３３．５２型を表すＤＮＡまたはＲ
ＮＡのハイプリダイゼーションプローブ混合物は、未知
のＤＮＡまたはＲＮＡ検体が生殖器病変に由来するもの
である場合、これらのＨＰ Ｖ型が生殖器病変で最もよ
く発見されるようなので特に都合がよい、それ以外の既
知のＨＰＶ型は生殖器病変で決して発見されず、または
発見されるのは希有のことである０例えばＨＰＶｌ、２
および４型は一般に別の型の病変、即ち皮膚のイボで発
見される［バイルマン、Ｃ，Ａ。 ら、ジャーナル・オプ・パイロロジー、３６（ＢＪ、３
９５頁（１９８０年）参照］、このようにＨＰＶ６．Ｉ
Ｌ、１６．１８．３１．３３および５２型を含んだＤ
ＮＡまたはＲＮＡ配列のハイブリダイゼーションプロー
ブ混合物は、未知のＤＮＡまたはＲＮＡ検体が生殖器病
変に由来する場合、都合がよい。 ハイブリダイゼーションプローブ混合物に使用し得るＨ
ＰＶ６．１１．１６．１８．３１および３３型配列の例
は多数報告されている［ギスマン、し１、キャンサー・
サーベイ、３巻、１６１頁（１９８４年）、プフィスタ
ー、Ｈ１、バイオケミカル・ファーマコロジー、９９巻
、１１１頁（１９８３年）、ダースト１Ｍ、ら、プロシ
ーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オ
ブ・サイエンシズ・オブ・ジ・ＬＩＳＡ、８０巻、３８
１２頁（１９８３年）、ポジヤード、Ｍ、ら、ＥＭＢＯ
・ジャーナル、３巻、１１５１頁（１９８４年）、ロリ
ンツ、Ａ、Ｔ、ら、ジャーナル・オブ・パイロロジー、
５８巻、２２５頁（１９８６年）およびボーデノン、Ｓ
９、ネーチャー、３２１巻、２４６頁＜１９８６年）参
照］、またハイブリダイゼーションプローブ混合物に使
用し得るＨＰＶＩ、２および４型の配列の例は当技術周
知のものである［バイルマン、Ｃ，Ａ、ら、ジャーナル
・オブ・パイロロジー、３６０巻、３９５頁（１９８０
年）］、シたがってＨＰＶ５２Ｇ：関するこの発明の開
示とＨＰＶ６．１１．１６．１８．３１および３３型な
らびにＨＰＶｌ、２および４型に関する当業者の知識に
よってハイブリダイゼーションプローブ混合物は容易に
作成できる。 パイプリダイゼーシ日ンプローブ混合物における個々の
ＨＰＶ型のＤＮＡまたはＲＮＡの固有の百分率はこの発
明では決定的なものではない。 般に各ＨＰＶ型のＤＮＡまたはＲＮＡのおよそ等モル量
が混合物に使用される。 ＨＰＶを検出し、型判定を行う手段として核酸ハイブリ
ッド形成は、上述のように液体中［ロギング、Ｊ、Ｒ，
ら、キャンサー・リサーチ、３９巻、５４５頁（１９７
９年）参照］または固体支持体［マニアティス、Ｔ、ら
５モレキユラー・バイオロジー、ア・ラボラトリ−・マ
ニュアル、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラト
リ−コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク（
１９８２年）参照］またはイン・サイチュ［ブリガティ
、Ｄ、Ｊ、ら、パイロロジー（Ｖｉｒｏｌ、）、１２６
巻、３２頁（１９８３年）およびベックマン、Ａ、Ｍ、
ら、ジャーナル・オブ・メジカル・バイ００ジー（Ｊ、
Ｍｅｄ、 Ｖｉｒｏｌ、）、１６巻、２６５頁（１９
８５年）参照］で実施できる。 固体支持体によるハイブリッド形成は多くの異なった方
法を用いて実施できる。そのような方法の一つは未知の
ＤＮＡまたはＲＮＡのすべてを一本鎖の形で固体支持体
上に固定化し、ついで標識したＨＰＶ５２ＤＮＡまたは
その断片、または標識したＨＰＶ５２ＲＮＡまたはその
断片とハイブリッド形成する方法である。 好ましい一実施態様として、未知の検体を別々に固体支
持体へ固定化する。もう一つの好ましい実施態様では、
固体支持体へ固定化する前に未知の検体を一緒に混合す
る。混合検体はその大半が陰性である膨大な検体を迅速
スクリーニングするのに特に都合がよい。 別法として精製した未知のＤＮＡを１またはそれ以上の
制限エンドヌクレアーゼで消化し、得られた検体中のＤ
ＮＡ断片を電気泳動によって分離することができる。つ
いでＤＮＡ断片を固体支持体へ移し、標識したＨＰＶ５
２ＤＮＡまたはその断片または標識したＨＰＶ５２ＲＮ
Ａまたはその断片とハイブリッド形成する。 同位体または非同位体検出法を用いるイン・サイチュハ
イブリッド形成はスライドガラス上で実施し、殻終結果
を顕微鏡で評価する。この方法ではｌ） Ｎ Ａまたは
ＲＮＡは細胞から精製されないが、そのほかのすべての
細胞成分とともに残っているＩシンガー、）（，１−１
，ら、バイオテクノロジ゛ （Ｂｉ（ＩＴＩ＋ｒｔｌ＋
＋＋ｏｌｕｇｙ）、４巻、２３０−２５０頁（１９８６
年）］。 １−１１’Ｖ５２ＲＮＡまたはその断片は、ｌｌ製抽出
物、特に例えば生殖器病変から精製したＤＮＡよりむし
ろそのような生殖器病変からの［！抽出物を筒用する場
合、好ましくは一般的なＨｒ’ＶＤＮＡおよび特定のＨ
ＰＶ５２ＤＮＡの核酸ハイブリダイゼーシシン１０−ブ
として使用される。 またＨＰＶ５２アンチセンスＲＮＡまたはその断片はＨ
ＰＶセ〉ス鎖ＲＮＡとのハイブリッド形成によって、一
般的なＨＰＶ遺伝子発現および特定のＨＰＶ５２遺伝子
発現の阻害因子または調節因子として使用できる。遺伝
子発現を阻害するアンチセンスＲＮＡプローブのｆｅ用
については参考文献として本明細書に包含させたすしテ
ンスタイン、Ｃ１の論文に報告されている［ホーチャー
３３３巻、８０１〜８０２１’（（１９８８年）］。 ＨＰＶ５２アンチセンスＲＮＡまたはその断片は複製ウ
ィルスをプローブｌ＼加えることによって標識すること
なく、一般的なＨＰＶおよび特定の１−Ｉ Ｐ Ｖ５２
の発現を阻害するプローブとして使用できる。ウィルス
との接触は軟膏のような中でウィルスをアンチセンスＲ
ＮＡへ加える任意の方法により、あるいは例えば別のウ
ィルスでトランスフエフシランすることにより、または
形質転換もしくはマイクロインジェクションによりアン
チセンスＲＮＡ供給源を細胞へ挿入することによって起
こすことができる。 ウィルスのゲノムはその独自性および限定された複雑さ
から、プローブとして使用する核酸の放射性標識のよう
な種々のハイブリ・ラド形成手法、固定化した核酸との
ＤＮＡ−ＤＮＡおよびＲＮＡＤＮＡハイブリッド形成、
細胞ハイブリッド形成および溶液中のＤＮＡ ＤＮＡお
よびＤＮＡ ＲＮＡハイブリッド形成反応の速度解析法
に特によく適している。ハイブリッド形成の手技および
そのＤＮＡ診断への応用に関しては最近の総説がある１
ランデグレン、Ｕ、ら、サイエンス、２４２巻、２２９
−２３７頁（１９８８年）］。 特異的ハイブリッド形成では、プローブとして使用する
核酸の純度が最も決定的な要素である。 ウィルスを１０−ブ供給源として使用することが望まれ
る場合、特に相補的なＲＮＡ（ｃＲＮＡ）または相補的
なりＮＡ（ｃＤＮＡ）を使用する際は、ウィルスを感染
細胞からよりもむしろ細胞外液から回収する方が好まし
い、細胞から回収されたウィルスは混入した細胞性ＤＮ
Ａを随伴しており、このＤＮＡはデオキシリボヌクレア
ーゼ処理によって必ずしも除去されない、したがってデ
オキシリボヌクレアーゼで加水分解した細胞処理が被覆
されたゲノムの断片化を起こさないから５最初の段階で
ヴイリオンの完全性を保持する技術り既知の任意の方法
によって高度に純化されたウィルスを入手すべきである
。精製によって生じたゲノムは著しく断片化されず、大
きさおよび密度またはスーパーコイル状態のような物理
的性質に基づいて細胞性核酸から分離し得るから、抽出
したウィルスＤＮＡを°この時点で厳密に精製すべきで
ある。その後、高度に純化したゲノノ、をエンドヌクレ
アーゼで処理して断片とし５型特異的または属特異的な
ウィルスタンパク質を暗号化している所望のヌクレオチ
ド配列を含有する断片を単離し、回収する。別法として
特定のポリヌクレオチドプローブを試験管内で生物系ま
たは化学反応の何れかで別個に合成することもできる。 生物系としては、ｍｃａのような原核生物体および酵母
、単離した培養内細胞、多細胞生物体の生殖細胞系細胞
。 多細胞生物体の体組織細胞または植物細胞等のような真
核生物体の双方が含まれる。核酸ハイブリッド形成技術
に関する一層詳細な議論はヌクレイツク・アシッド・ハ
イブリダイゼーション［Ｂ。 Ｄ、ヘイノ、ズおよびＳ、Ｊ 、ヒギンズ編、ＩＲＩ、
１【ス、ワシントン、Ｉ）、Ｃ，（１９８５年）］に示
されている。 ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド・プ１７−
ブは原子または無機原子団で標識でき、最も ・殻に使
用されるのは放射性ヌクレオチドであるが、あるいは重
金属も使用し得る。またある状！ぶては１本鎖ＤＮＡ／
＼ハイブリッド形成した１０−プと特異的に結合する抗
体も使用し得る。オリゴヌクレオチド１０−ブの技術に
関しては参考文献として本明細書に包含させたスジスタ
ックらの報告がある１スゾスタツク、Ｊ、Ｗ、ら、メソ
ッズ・イン・エンサイモロジー。６８巻、４１９へ４２
８頁（１９７９年）Ｊ。 放射性標識にはｊ２ｐ 、 ３Ｈ，１４（−、％Ｓ、ま
たは１２′１等を含む好適な放射性標識が最も一般に使
用される。好適な信号を提供し、十分な半減期を存する
任意の放射性標識を使用し得る。その他の標識としては
りガント、螢光体、化学発光体、酵素および抗体等が挙
げられる。 未知の１３ＮＡ検体中のＨＰＶ５２ＤＮＡｔ−Ｍ出する
ハイブリダイゼーション１０−プとしてｌ−Ｉ ＰＶ’
５２ＲＮＡを使用する場合は、まず緊縮ハイブリッド形
成条件下でハイブリッド形成した後、生成したＤＮＡ−
ＲＮＡハイブリッドを室温で膵臓リボヌクレアーゼＡ″
Ｃ″処理しく約２０ ｍ ｇｅｍ ｌ、５０ｍＭＮａＣ
１溶液（ＰＨ７，０））、ついで緊縮ハイブリッド形成
条件下にこれを洗浄する。 ＨＰＶ５２ＤＮＡまたはその断片は例えばリグビーらの
報告した周知の手段による「二・ツクトランスレーショ
ン」 ［リグビー、Ｐ、Ｊ、Ｗ、ら、ジャーナル・オブ
・モレキュラー・バイオロジー１１３巻、２３７頁（１
９７７年）］および例えばディーンらの報告した”ｒ’
４ＤＮＡポリメラーゼ置換合成］デイ−〉・、Ｋ、Ｃ，
ら、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ、
Ｂｊｏｃｈｅｍ、）、 １３５巻、４５６頁（１９８
３年）］によって放射性に標識できる。別法としてＨＰ
Ｖ５２ＤＮＡまたはその断片はオリゴヌクレオチドプラ
イマーおよびポリメラーゼ連鎖反応のような酵素反応を
用いて検体内で合成および標識し、または検出すること
ができる【マークス１．１ 、 Ｌ 、、サイエンス、
１４０巻、１４０８〜１４１０頁（１９８８年）］。 ＨＰＶ５２ＲＮＡまたはその断片は、例えばダバンルー
らの報告のように試験管内転写によって放射性マーカー
で標識することができる［ダバンルー、Ｐ、ら、プロシ
ーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オ
ブ・サイエンシズ・オブ・ジ・ＵＳＡ、８１巻、２０３
５頁（１９８４年））、ＲＮＡポリメラーゼは標識した
前駆物質を利用できるので、この方法によって一般的な
）！ＰＶ ＤＮＡまたはＲＮＡ、または特定ノＨＰＶ５
２ＤＮＡまたはＲＮＡを検出するためのＨＰＶ５２ＲＮ
Ａプローブを作成するように標識したＲＮＡを合成する
ことが可能である。 またＨＰＶ５２ＤＮＡまたはその断片またはＨＰＶ５２
ＲＮＡまたはその断片はビオチン、酵素または螢光物質
のような非放射性マーカーで標識すると、一般的なＨＰ
Ｖ ＤＮＡまたはＲＮＡ、および特定のＨＰＶ５２ＤＮ
ＡまたはＲＮＡのための核酸ハイブリダイゼーション１
０−プとして有用である。ビオチンはハブテン様の基と
して作用してＤＮＡまたはｒ（ＮＡと結合することがで
き、アビジン結合酵素またはストレプトアビジン結合酵
素をビオチンと結合させ、ついで非特異的に結合した酵
素を洗浄、除去することによってこれを検出できる。そ
の酵素に好適な基質を添加すると基質が着色性生産物ｌ
＼ＩＲ換し、検出することができる（レアシー１．１．
Ｊ、ら、アロシーディングて・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ジ・ＬＩＳＡ
、８０巻、７１０４５頁（１９８３年）］、そのような
酵素の例としてアルカリ性ホスファターゼおよび西洋ワ
サビ・ペルオキシダーゼ等が挙げられる［レンツ、Ｍ。 ら、ヌクレイツク・アシシズ・リサーチ（Ｎｕｃ。 Ａ（・ｉｄｓ Ｒｅｓ、 ）、１２巻、３４３５〜３４
４４頁（１９８４年）］、またフルオレセインおよびロ
ーダミンのような螢光分子をアビジンまたはストレプト
アビジンと化学的に結合させ、非放射性マーカーとして
使用することもできる。 別法として例えばレンツ、Ｍ、の報告したようにｌ ｌ
＜ Ｍ Ｒ（’）・ジャーナル、６巻、８１７頁（］（
）８８３年］、Ｆ記の酵素または螢光分子をＨＰＶ５２
ＤＮＡまたはその断片またはＨＰＶ５２ＲＮＡまたはそ
の断片と化学的に直接結合させ、この態様でハイブリダ
イゼーションプローブとして使用できる。 このようにしてｔａＸしたＨ Ｐ Ｖ ５２ ＤＮ Ａ
またはＨＰＶ’１２）（ＮＡまたはそれらの断へを、ト
記のように未知のＤＮＡまたはＲＮＡ検体Ｊたは未知の
ＤＮＡまたはＲＮＡ検体混合物、特に生殖器に由来する
未知のＤＮＡまたはＲＮＡ検体または未知のＴ）ＮＡま
たはＲＮＡ検体混合物とのハイブリッド形成研究に使用
し、検体が一般的なＨＰＶＤ Ｎ ＡまたはＲＮＡまた
は特定のＨＰ Ｖ５２ ｒ） ＮＡを含んでいるかどう
かを測定することができる５未知のＤ Ｎ ＡまたはＲ
ＮＡ検体または未知のＤＮＡまたはＲＮＡ検体混合物は
、生殖器に由来するもの以外にも喉、口または戊膚病変
のようなその他の病賓からも得ることができる３ 未知のＤＮＡまたはＲＮＡ検体または未知のＤＮＡまた
はＲＮＡ検体混合物は・、例えば１−皮病変の生検、ま
たは子宮頚部の擦過または子宮頚部の綿棒拭き取りによ
って剥脱細胞を採取することができる。また未知のＤＮ
ＡまたはＲＮＡ検体または未知のＤＮＡまたはＲＮＡ検
体混合物は、病変から得られたＤＮＡまたはＲＮＡをマ
ニアティスらの報告した周知の手段を用いてクローン化
した細菌細胞から得ることができる［マニアティス、Ｔ
、ら、モレキュラー・バイオロジー、ア・ラボラトリ−
・マニュアル、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボ
ラトリ−、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨ
ーク（１９８２年）およびギスマン、Ｌｏ、キャンサー
・サーベイ、３巻、１６１〜１８１頁（１９８４年）参
照］。 この発明の方法において交差反応の検定は、２本鎖核酸
ハイブリッドと結合した放射性または非放射性マーカー
の存在を検定することによって実施できる。特異的なマ
ーカーが存在するかどうかを測定する方法は使用したマ
ーカーによって異なり、従来技術でよく知られている。 好ましい態様として、マークスの報告したポリメラーゼ
連鎖反応［マークス＋ Ｊ、Ｌ、、サイエンス、１４０
巻、１４０８〜１４１０頁（１９８８年）］に特異的な
ＨＰＶ５２オリゴヌクレオチドプライマーおよびＤＮＡ
ポリメラーゼを使用し、未知の検体のＨＰＶ ＤＮＡお
よび／またはＲＮＡ、またはＨＰＶ５２ＤＮＡおよび／
またはＲＮＡの存在を検定する。異なったＨＰＶ型に特
異的なリンカ−の混合物を従来技術周知の手法によって
合成し、緊縮条件下におけるこれらリンカ−のハイブリ
ッド形成によって未知の検体中のＨＰＶ型の任意の一つ
の存在を検出するのに使用できる。 別法として未知の検体中の任意のＨＰＶ ＤＮＡまたは
ＲＮＡの存在は、非緊縮条件下でプライマーを検体へハ
イブリッド形成させることによって検出できる。 もう一つの好ましい態様では、Ｊ（ＰＶ ＤＮＡおよび
／またｇｉＨＰＶ ＲＮＡ、特にＨＰＶ５２ＤＮＡおよ
び／またはＨＰ Ｖ ５２ ＲＮ Ａは、例えばＱ−ベ
ーターーレプリカーゼ系で用いられるような増幅可能な
ＨＰＶ５２ＲＮＡ配列を１０−ブとして使用して検出で
きる［チュー、Ｂ、Ｃ，Ｆ、ら、ヌクレイツク・アシッ
ズ・リサーチ、１４巻、５５９１〜５６０３頁（１９８
６年）］。 この発明のハイブリダイゼーションプローブとして使用
できるＨＰＶ５２ＤＮＡまｔ！ ＨＰ Ｖ ５２ＲＮＡ
断片の個々の大きさは決定的なものではない、）！ＰＶ
５２ＤＮＡまたはＨＰＶ５２ＲＮＡ断片の大きさは１本
鎖プローブまたは２本鎖プローブの何れを使用するかに
よって変わり１例えば約１５〜約５ｏｏｏ塩基または塩
基対、好ましくは約３００へ約ＳＯＯ＊基または塩基対
であることができる。インーサイチュでハイブリッド形
成を実施する場合は、ＨＰＶ５２ＤＮＡまたはＨＰＶ５
２ＲＮＡ断片の大きさは約５００塩基または塩基対より
小さい方が、それより大きいＨＰＶ ＤＮＡまたはＨＰ
Ｖ ＲＮＡよりもこの大きさの断片が一層効率的にイン
・サイチュ・ハイブリッド形成するので好ましい、１５
〜１００塩基と一層小さい側の断片でもポリメラーゼ連
鎖反応で使用するプライマーとして好ましい、２本Ｗ４
ＤＮＡまたはＲＮＡを使用する場合は、ハイブリッド形
成を実施する前にＤＮＡまたはＲＮＡを変性しなければ
ならない。 ＨＰＶ５２ＤＮＡ断片はＨＰＶ５２りＯ−７ｐＣＤ１５
の制限エンドヌクレアーゼ消化により、または商業的に
入手可能な任意のＤＮＡ合成装置を使用する合成的な製
造方法により、または周知の手段によって測定できるＨ
ＰＶ５２ＤＮＡ配列を使用する周知の化学的方法によっ
て得ることができる［サンガー、Ｓ、ら、プロシーデイ
ングズ・オプ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ
イエンシズ・オブ・ジ・ＬＩＳＡ、７４巻、５３６３頁
（１９７７年）］。 ［実施例］ 以下に実施例をあげてこの発明をさらに詳細に説明する
。実施例は単に発明を説明するためのものであって、発
明の範囲を限定する目的をもつものではない、説明中、
特に示さない限りすべての部、百分率および比率等は重
量単位で示す。 実施例Ｉ ＨＰＶ５２ＤＮＡのクローニング 使用した出発物質は数ミリグラムの組織からなる生検検
体から得られた子宮頚部上皮的新生物である。ＤＮＡ全
体をマニアティスの報告のように精製した［マニアティ
ス、Ｔ、ら、モレキュラー・バイオロジー、ア・ラボラ
トリ−・マニュアル、コールド・スプリング・ハーバ−
・ラボラトリ−コールド・スプリング・ハーバ−ニュー
ヨーク（１９８２年）］、具体的には組織を細く刻み、
これを０．６％（Ｗ／Ｖ）ドデシル硫酸ナトリウムおよ
び５０Ｍｇ／ｍ＋プロテイナーゼＫを含有する５ ０ｍ
Ｍ トリス−ＭＣＩ （ｐＨ８，０）１−Ｏｍ＋溶液で
３７℃で一夜消化した。得られた消化物をフェノール：
クロロポルム（１： １ （ｖ／ｖ）） １．０ｍｌで
２回抽出した。ついで９０％（ｖ／ｖ）エタノール２容
量を加えて水層からＤＮＡを沈殿させた。沈殿したＤＮ
Ａを１０ｍＭ＋・リス、１．ＯｍＭ ＥＤＴＡ縛ｌＦ
Ｉ液（ｐＨ８，０）（以下ｒＴＥ、緩街液という）に約
１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で再溶解した。 ＤＮＡをＰｓｔｆで完全に消化し、サザーンの報告のよ
うに１．０％（ｗ／ｖ ）アガロースゲルで電気泳動し
、ＤＮＡをニトロセルロースフィルターへ移した［サザ
ーン、Ｅ、Ｍ、、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ
イオロジー、９８巻、５０３頁（１９７５年）］、つい
でフィルターを非緊縮ハイブリッド形成条件下（Ｔｍ−
３５℃）および緊縮ハイブリッド形成条件下（Ｔｍ−１
０℃）でＨＰ Ｖ２Ｏ型から得たＤＮＡとプローブした
。ハイブリッド形成は１．０ＭＮａＣ１，５０ｍＭリン
酸ナトリウムｖｉ訴液（ｐＨ７，４）、１．０ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ。 ２％（Ｗ／Ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム、０．１％（ｗ
／ｖ）ゼラチン、５０Ｍｇ／ｍｌ ｔＲＮＡおよび３０
％（Ｖ ／Ｖ ）ホルムアミド中で一夜４３℃で実施し
た。１．２ＸＳＳＣ（ＩＸＳＳＣは０．１５Ｍ Ｎａ
Ｃｌおよび０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムからなる）
、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７，４）、１．０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡおよび０．５％（Ｗ／■）ドデシル硫酸ナ
トリウム溶液で５５℃で３０分閏ずつ４回洗浄を行った
。ハイブリッド形成は非緊縮形成条件下ではＨＰＶ１６
型で実現したが、緊縮ハイブリッド形成条件下では達成
しなかった。 得られた精製ＤＮＡおよびλＬ４７をＥｃｏＲＩ ｆ＋
ＩＩ限エンドヌクレアーゼで消化すると８ｋｂの断片が
生じた。この断片をλＬ４７の唯一つのＥｃｏＲ１部位
へクローン化した。具体的には総量５０μ！＋７）ＴＥ
！［１中、４％らｔｕ、：ｔｌＷＤＮＡ ２．０μｇ
およびλＬ４７ＤＮＡ ２．ＯｔｔｇをＥｅｏＲＩ １
０単位で３７℃で１時間切断した。ついで得られた反応
混合物をＴＥ！ＩＩ液４００μｌで希釈し、上記のよう
に等容量のフェノール：クロロホルムでフェノール抽出
した。ついで水層をクロロホルム：イソアミルアルコー
ル（２４： １ （ｖ／ｖ））で抽出し、８０％（Ｖ／
Ｖ）エタノールで水層がらＤＮＡを沈殿させ、乾燥した
。ついで乾燥したＤＮＡをそれぞれ６６ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｌ、６．６ｍＭ Ｍｇ ＣＩｔ １０ ｍ Ｍ Ｄ
Ｔ Ｔおよび１．ＯｍＭ ＡＴＰを含有する１×リガ一
ゼＭ！街液１０μｌに浮遊させ、４２℃で２時間インキ
ュベートしてλアームをアニーリングした。つぎに７４
ＤＮＡリガーゼ０ 、５ ｔｔ ｌ （ＰＪＪち約１
単位）および１０ｍＭＡＴＰ（ｐＨ７，０）０．５μｍ
を各反応液へ添加し、１２℃で一夜ライゲーションを進
行させた。 つぎにライゲーション生産物をパッケージして感染性の
あるファージを作成し、エシェリキアコリＬ４７の感染
に使用した。具体的には１リツ１１し当りトリプトン１
０ｇおよびＮａＣ１５，Ｏｇを含有するアガロースプレ
ート（以下ｒＴＮ培地Ｊという）Ｌで発育させたエシェ
リキア・コリＬ４７の単一コロニーを選び、ＴＮ培地２
０ｍ１で初期定常期となるまで振とう培Ｊ［上（２５０
ｒｐｍ）、３７℃で一夜発育させた。ついで細胞培養を
ＴＮ培地で４倍に希釈し、さらに３時間発育さセタ、ツ
ぎにツルポール（Ｓｏｒｖａｌｌ） ＨＲ−４０−ター
で５０００ｒｐｍ、５分間遠心することによって細胞を
回収し、得られた細胞ベレットを１０ ｍ Ｍ Ｍ ｇ
Ｓ Ｏａ溶液で初めの容量の０．２５に再浮遊し、４
℃で貯蔵した。 パッケージした感染性のあるファージは商業的に入手可
能なりＲＬラムダ・イン・ビトロ・パッケージング・シ
ステノ、（ＢＲＬ Ｌａｍｂｄａ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ
Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて調製した
［マニアテイス、Ｔ、ら、モレキュラー・バイオロジー
、ア・ラボラ！・リー・マニュアル、コールド・スプリ
ング・ハーバ−・ラボラ■−リー、コールド・スプリン
グハーバ−、ニューヨーク（１９８２年）］。 パッケージしたファージを０．５Ｍトリス−ＨＣＩ（ｐ
Ｈ８，０＞、０．１Ｍ ＮａＣＩ、０．０１ＭＭｇ５
０４および０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン（デイフコ（
Ｄｉｒｃｏ＞）含有ファージ貯蔵榎街液で希釈した好適
な希釈液（直径９ｃｍのグレート１枚当りプラーク１．
５Ｘ１０’を与える）１００μｌを、１０〜１５ｍ１の
試験管に前記のように調製したエシェリキア・コリＮＭ
５３８ １００μ！へ加えて静かに混合し、室温で１５
分間インキュベートした。ついでこの、Ｉｎ胞−ファー
ジ溶液を１リットル当りｌ・リブチカーゼ大豆ブロス１
０ｇ、ＮａＣ１５，０ｇおよび寒天１５ｇを含有する少
なくとも１日前に調製し、あらかじめ３７℃に加温した
トリ１チカーゼ大豆ブロス寒天プレートへ移植した。使
用前に電子レンジで溶液が沸騰するまで加熱し、４５℃
に冷却した１ ０ ｍ Ｍ Ｍ ｇ Ｓ Ｏａ溶液に溶
解した０、５％アガロース（超高純度品、電気泳動縁）
を含有するアガロースオーバーレイ３・〜５ｍｌ を移
植した細胞−ファージへかぶせた。 アガロースが固化した後、循環の良い３７℃空気吹き込
み式インキュベーターへプレートを移し、３０分間プレ
ートの蓋を開け、ついで蓋を閑じてプレートを裏返しに
した。８〜１２時間後、プラークが明瞭に現れた。 感染によってプレート上の細菌の全面溶菌が生じた。ベ
ントンらが報告した「プラーク釣り上げ（ｐｌａｑｕｅ
１ｉｆｔｓ）」を実施することによってＨＰＶＤＮＡ
を保有する組換えファージの位置をつきとめな［ベント
ン、Ｗ、Ｄ、ら、サイエンス、１９６巻、１８０頁（１
９７７年）］、具体的には全面溶菌したプレートを４℃
で１時間放置し、アガロースを固化させた。ついで好適
な大きさのニトロセルロースフィルター片を中央で曲げ
てプレート中心部に接触させ、接触点を端の方までひろ
げることによって各プレート上に配置した。ついで細い
ゲージの針でニトロセルロースフィルターおよび寒天に
４つの対称的な穴を開け、パーマネントマーカーで穴の
位置をプレートの底に印した。これによって二Ｉ・ロセ
ルロースフィルターおよび陽性の信号を含んでいる任意
の他の区域をプレートの対応する位置と照合することが
できる。１０分後にニトロセルロースフィルターをはが
し、プラーク側を上にして二１〜口セルロースフィルタ
ーを０．５Ｍ ＮａＯＨ１２，０Ｍ ＮａＣ＋溶液２０
０ｒｎ＋を含有する平皿へ１分間加えることによってＤ
ＮＡを変性した。ついでニトロセルロースフィルターを
０．５Ｍ）リス−ＭＣＩ、２．０Ｍ ＮａＣＩ（ｐ）１
７．５）５００ｍｌに５分間浸けることによって中和し
な、つぎにフィルターを０．９ＭＮａＣ１，０，０９Ｍ
クエン酸ナトリウムを含有する６ｘｓｓｃ溶液で１分間
すすぎ、ワットマン（１＃ｈａｔｍａｎ）３ＭＭペーパ
ー上で乾燥した後、真空下に３０分間８０℃で焼成した
。 その後、［ニックトランスレーション」によって ）２
Ｐ標識したＨＰＶＩ ６ＤＮＡをプローブとして使用す
る非緊縮ハイブリッド形成を、釣り上げたプラークから
単離したＤＮＡに実施し［リグビー、Ｐ、Ｊ、Ｗ、ら、
ジャーナル・サブ モレキュラー・バイオロジー、１１
３巻、２３７頁（１９７７年）およびマニアティス、Ｔ
、ら、モレキュラー・バイオロジー、ア・ラボラトリ−
マニュアル、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラ
Ｉ・リー、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨ
ーク（１９８２年）参照］、ついでこれを洗浄し、オー
トラジオグラフィーに掛けた。具体的には１．０Ｍ Ｎ
ａＣｌ、２８％（Ｖ／Ｖ）ホルムアミド、５０ｍＭＮ−
）リス（ヒドロキシメチル）メチル ２−アミノエタン
スルホン酸（以下［′「ＥＳＪと言う）、１０Ｘデンハ
ーマー溶液、０．１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１０ｍＭリン
酸ナトリウム（ｐＨ７，４＞を含有する溶液中で４１℃
でハイブリッド形成を実施した。ついで非緊縮条件下に
、］ＯｒｎＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７，４）、０．１
ＭＭ ＥＤＴＡ溶液中、１．Ｉ Ｘ５ＳＣ（０，１６５
ＭＮａＣ＋および０．０１６５Ｍ クエン酸ナトリウ
ムを含有）を使用して５２℃で洗浄を実施した。 放射線照射部位と対応させることによって、ｌ４ＰＶ１
６ＤＮＡへハイブリッド形成したＤＮＡを含んだファー
ジを含有するブレー１〜の領域を切り取り、前記と同様
にエシェリキア・コリの再感染に使用した。上記の方法
を縁り返すことによってＨＦ’ＶＤＮＡを含んだファー
ジ・１ラークの位置をつきとめた。Ｅｃｏ旧で消化した
ＤＮＡを使用したクローニングからスクリーニングした
１０％のプラークから１プラークを同定した。クローン
化した断片は８ｋｂの大きさを有し、これをクローンＣ
Ｄ１５と命名した。 ついでＨＰＶ５２クローンＣＤ１５のＨＰＶＤＮＡをＥ
ｃｏＲＩで消化し−ｐｕｃの唯一のＥｃｏＲ１部位でサ
ブクローン化した。得られた組換えＤＮＡをＨＰＶ５２
クローンｐＣＤ１５と命名した。 実施例２ ＨＰ Ｖ ５２ Ｄ Ｎ Ａ （７）確認１、ハイブリ
ッド形成研究 ＨＰ Ｖ ５２クローンｐＣＤ １５についてハイブリ
ッド形成研究を実施し、ＨＰＶ５２クローンｐＣＤ １
５が新しいＨＰＶ型であることを証明した。 具体的にはＨＰＶ５２クローンｐｃｏ １５から作成し
た３２Ｐ「ニックトランスレーション」したＤＮＡを緊
縮条件下にＨＰＶＩ〜５１型に由来するＤＮＡ５ｎｇヘ
サザーンブロツティングすることによりハイブリッド形
成した。ＨＰＶ１〜４２型のＤＮＡはインスティテユー
ト・パスツール（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｐａ５ｒｅｕｒ
） （パリ、フランス）のジェラール・オルト博士（Ｈ
ＰＶ型命名担当者）、ババビローマ・リファランス・セ
ンター（Ｐａｐｉ ｌ ｌｏｍａＲｅｆｅｒｅｎｃｅ
Ｃｅｎｔｅｒ）（ハイデルベルク、西ドイツ）のエセル
・ミシェル・デ・ヴイリエール博士およびライフ チク
ノロシーズ・インコーホレーテッド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ、）からニトロセルロースフィ
ルターへ固定化する前の形で入手した。具体的には１．
ＯｍＭ ＮａＣｌ、２８％（Ｖ／Ｖ）ホルムアミド、
５０ｍＭ Ｎ−トリス ＴＥＳ、１０×デンハート溶
液、０．５ｍＭ ＥＤＴＡおよび２０ｍＭリン酸ナトリ
ウム（ｐＨ７，４）を含有する溶液で４１℃でハイブリ
ッド形成を実施した。ついで緊縮条件下に１０ｍＭリン
酸ナトリウム（ｐＨ７，４）、０．１ｍＭＦ、ｒ）Ｔへ
溶液中、０．０３ＸＳＳＣ（０，００４５Ｍ ＮａＣｌ
および０．０００４５Ｍクエン酸ナトリウムを含有）を
使用して洗浄を６５℃で実施した。 標準的なハイブリッド形成条件（Ｔｍ−２５℃〉、飽和
ハイブリッド形成およびヒドロキシアパタイトクロマ１
へグラフィーによってρＣＤ１５および１１ Ｐ Ｖ
３３は２８％のＤＮＡ配列相同性を有することを示した
。型命名は標準的なハイブリッド形成条件下における５
０％またはそれ以下のＤＮＡ配列相同性に基づいている
から、この単離体は新しい型のＨＰ Ｖを表している。 ＨＰＶ５２クローンｐＣＤ１５の組換えＤＮＡとＨＰＶ
３３およびそのほか大多数のＨＰ Ｖ型との間で非緊縮
ハイブリッド形成条件下では著しい相同性が検出される
が、緊縮ハイブリッド形成条件下ではＨＰＶＩ〜・５１
型のいずれとも何ら相同性が認められない、したがって
ＨＰＶ５２クローンｐｃＤ１５は新規のＨＰＶ型を表し
ていることが証明された。 ２、核酸配列 Ｌ１転写読み取り枠の中央からＨＰＶ５２り１７−ンｐ
ＣＤ １５のための非コード領域の全域にまたがる部分
的ヌクレオチド配列を第１図に示す。 ３、ν１限酵素切断地図 ＨＰＶ５２のための制限酵素切断地図を第２図に示す、
下記の制限酵素、Ｂａｎ１ｌ 、 Ｂｃｌ Ｉ 、ｌ１
ｐａ ＋、）１ｉｎｄｌ 、Ｓａｃ Ｉ 、 ５ｐｈｌ
ｌ 、 Ｓｐｈ Ｉ 、ＸｈｏｌはＨＰＶ５２ＤＮＡを
切断しない。 ４、ゲノム構成 １−Ｉ Ｐ Ｖ ５２のゲノムがＨＰＶ３３と同一また
は類似の転写読み取り枠構成を有することを証明するた
め、下記のハイブリッド形成研究を実施した。 ＨＰＶ５２クローンｐＣＤ １５から精製したＤＮＡを
、ＨＰＶ３３ＤＮＡの”Ｐ ｒ二、、クトランスレーシ
ョン」した断片を１０−ブとして使用する前記のような
非ｙＡ縮条件下および緊縮条件下のサザーンブロッティ
ングに掛けた。これらの断片を各種の制限酵素で消化し
たＨＰＶ３３のサザーンブロツトヘハイブリッド形成さ
せた。大部分の１−１Ｆ’ Ｖ ５２ ノ断片はｔ（Ｐ
Ｖ ３３ （７）別／？（７１）断片へハイブリッド
形成した（第３図）、６個のｌ（Ｐ Ｖ ５２交差反応
断片のうちの５個はＨＰＶ３３断片と１” ｍ−１０で
安定な２．ｆｔｔ体を生成した。残りの断片だけはＴｍ
−３０でＨＰＶ３３とハイブリッド形成した。これらの
結果に基づき、ＨＰ Ｖ ５２ゲノノ、はＨＰ Ｖ ３
３ゲノムと共直線的であると思われる。 ＨＰ Ｖ ５２制限酵素断片はＨＰＶ３３のゲノムの２
つの領域と交差反応しない、１つの領域は早期領域の３
°末端を包含し、もう１つはＬ１転写読み取り枠（ＯＲ
Ｆ ）の３′末端からＥ６０ＲＦへ伸長している領域で
ある。 これらの非相同領域をさらに解析するため、発明者らは
ＨＰＶ５２ゲノムの３４６ヌクレオチドの５°の点から
５°Ｂａｍ１１部位を通ってＨＰＶ５２ゲノムの独自の
Ｋｐｎ １部位へ至る１９５０ヌクレオチドの配列を決
定した（第１図）、この領域はＬＩ ＯＲＦのアミノ酸
１５３からＩ−Ｉ Ｐ Ｖ ３３の非コード領域にわた
って等しい、ＨＰＶ３３とＨＰ Ｖ ５２のヌクレオチ
ド配列を比較するとＬｌＯＲＦで７５％の配列相同性お
よび非コード領域で５０％より小さい相同性が見られる
。このＬｌｏＲＦおよび非コード領域の間の相同性にお
ける突然の変化を第４図に示す、ＬＩＯＲＦの部分的ヌ
クレオチド配列のアミノ酸配列の比較からこれら２つの
ウィルス間では８２％のアミノ酸相同性があることが判
明した。 実施例３ 有病率の研究 米国における有病率の研究から、ＨＰＶ５２配列は子宮
頚部上皮肉新生物の１３７例中３例（２％）に、また子
宮頚部扁平上皮細胞癌の４８例３ｌ例（２％）に存在し
た。 この発明について詳細に特殊な実施態様を引用して説明
したが、この発明の精神および権利範囲から外れること
なくさまざまな変更および修飾を切断部位を図式的に示
した図、第３図は非緊縮ハイブリッド形成条件下の核酸
ハイブリッド形成によって測定したＨＰＶ３３とＨＰＶ
５２との閏の部分的相同領域、第４図はＬ１転写解読枠
とＨＰＶ５２およびＨＰＶ３３の非コード領域との相同
配列の比較を示した図である。 第１図は非コード領域、ｐＣＤｌ ５の１９５０特許出
願人 ジョージタウン・ユニバージティー化 理 人
弁理士 青 山 葆 ほか１名塩基配列、第２図はＨＰ
Ｖ ５２に対する制限酵素手続補正書 （方式） ％式％ 発明の名称 ３、補正をする者 事件との関係
、非コード領域を示す。 第２図はＨＰＶ５２に対する制限酵素切断パターンの略
図を示す。 第３図は非緊縮ハイブリッド形成条件下で核酸ハイブリ
ッド形成により測定されたＨＰＶ３３とＨＰＶ５２ＤＮ
Ａの間の部分的相同領域を示す。 相同性を有する領域を矢印で示す、相同地図上にＨＰＶ
３３に属すると推定される転写解読枠の位置を示す、鶏
影を付けた区域は殆どまたは全く相同でない領域を示す
、実線矢印は強い相同領域、点線矢印は弱い相同領域を
示す。 第４図はＨＰＶ５２とＨＰＶ３３とのＬ１転写解読枠お
よび非コード領域の相同配列の比較を略図で示したもの
である。 ［発明の実施態様］ これまで未知であったＨ Ｐ Ｖ型がこの発明で発見さ
れ、これをＨＰＶ５２と命名した。この発明で最初にＨ
ＰＶ５２をクローン化し、これによって未知のＤＮＡま
たはＲＮＡ検体、ことに生殖器病変から得られた未知の
ＤＮＡまたはＲＮＡ検体中の一般的なＨＰＶ ＤＮＡま
たはＲＮＡの検出および特定のＨＰＶ５２ＤＮＡまたは
ＲＮＡの検出のための核酸ハイブリダイゼーションプロ
ーブの生産が可能となった。 ワシントンＤ、Ｃ，地域から入手した２例の軽症異形成
の生検検体を合わせたＤＮＡからＨＰＶ５２を単離し、
クローン化した。 この発明で最初にＨＰＶ５２のクローン化を提供した実
施例で使用した特異的なりローニングベクターはλＬ４
７である。１０５プラークからＨＰＶ１６との非緊縮ハ
イブリッド形成により陽性を示したプラークをサザーン
プロット分析でスクリーニングした。制限酵素分析によ
って測定して３個のプラークが同一のＤＮＡを含んでい
た。１つの単離体をｐＵＣヘクローン化し、これをＰＣ
Ｄ１５と命名したしメッシング、Ｊ、（１９８３年）、
メソッズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈ。 Ｅｎｚｙｍｏｌ 、 ）、１０１Ｃ巻、２０〜７８頁］
。 ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼを用いてＨＰ Ｖ５
２ＤＮＡ全体をクローンｐｃＤ１５から切り出し、任意
の原核および真核クローニングベクターでサブクローン
化できる。ＨＰＶ５２のサブクローニングに使用する個
々のクローニングベクターは決定的なものではな（ｐＵ
ｃｌｌ、λシャロンのようなλ誘導ベクターまたはＭ１
３誘導バクテリオファージのような任意の既知の原核ク
ローニングベクターであることができ［マニアティス、
Ｔ、ら、モレキュラー・バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒＢｉｏｌｏｇｙ）、ア・ラボラトリ−・マニュアル
（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コール
ド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、コールド・
スプリング・ハーバ−、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ）、（１９８２年）およびローエネン、Ｗ、Ａ、Ｍ、
ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）、２０巻、２４９頁（１９８０
年）参照］、あるいはＰＺＩＰ−ネオ５Ｖ（Ｘ１］また
はｐＢＫＴＫ−１のような任意の既知の真核クローニン
グベクターでもよい〔プーイールズ、Ｐ、Ｈ，ら、クロ
ーニング・ベクターズ（ＣＩｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒ
ｓ）、ア・ラボラトリ−・マニュアル（Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、エルセーベル（Ｅｌｓｅ
ｉｖｅｒ）、アムステルダム（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）
（１９８５年）参照］。 同様にその他の周知の制限エンドヌクレアーゼを用いて
ＨＰＶ５２ＤＮＡの断片をＨＰＶ５２クローンｐｃＤ１
５から切り出し、上記のクローニングベクターでクロー
ン化することができる。 ＨＰＶ５２ＤＮＡまたはその断片のクローニングによっ
て、一般的なＨＰＶ ＤＮＡまたはＲＮＡおよび特定の
ＨＰＶ５２ＤＮＡまたはＲＮＡのための核酸ハイブリダ
イゼーションプローブ生産に使用する多量のＨＰＶ５２
ＤＮＡまたはその断片を比較的簡単に生産することがで
きる。 ２つのＨＰＶ ＲＮＡＭのハイブリッド形成は２つのＨ
ＰＶ ＤＮＡ鎖のハイブリッド形成と同様であって、２
つのＨＰＶ ＲＮＡ鎖が相互に相補的である場合、即ち
ＨＰＶ ＲＮＡのセンス頒がＨＰＶ ＲＮＡのアンチセ
ンス鎖とハイブリッド形成するときに起こる。したがっ
てｒＨＰＶＲＮＡ、の語にはセンスおよびアンチセンス
ＨＰＶ ＲＮＡ配列の双方が含まれている。ＨＰＶセン
スｊｉＲＮＡは、１−（ＰＶ ＤＮＡがら転写されたＨ
ＰＶ ＲＮＡに見出されるＨＰＶ ＲＮＡ配列である。 ＨＰＶアンチセンス鎖ＲＮＡとはセンス鎖ＲＮＡと対合
し、これと２本鎖ＲＮＡを生成し得るＨＰＶセンスＲＮ
Ａ［と相補的なＲＮＡを意味する。センス鎖ＲＮＡは５
°および３゛の翻訳されない配列のようなコード領域お
よび非コード領域を含み得る。アンチセンスＨＰＶ Ｒ
ＮＡはＨＰＶ ＲＮＡセンス鎖上に存在している任意の
配列の相補鎖を含んでいる。 ＨＰＶ５２ＤＮＡまたはその断片をその他の周知のクロ
ーニングベクターでサブクローン化し、クローニングベ
クターへ挿入されたＨＰＶ５２ＤＮＡと相同なＲＮＡの
試験管内合成を促進する特定のクローニングベクターの
特殊な性質を利用することができる［マニアティス、Ｔ
、ら、モレキュラー・バイオロジー、ア・ラボラトリ−
・マニュアル、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボ
ラトリ−、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨ
ーク（１９８２年）参照］、これらのクローニングベク
ターの例を挙げればｐＴ７１２およびｐＴ７１３等であ
って、何れもＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ［ガイザースバーグ（
Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、ＭＤＩから商業的に入手
できる。ＨＰＶ５２ＤＮＡまたはその断片は、これらの
クローニングベクターへＨＰＶ５２ＤＮＡまたはその断
片が例えばＴ７、Ｔ３またはＳＰ６のようなＲＮＡポリ
メラーゼを暗号化しているファージのための有効な鋳型
として作動し得るようにサブクローン化することができ
る。そのようなりローニングベクターおよびそのような
ＲＮＡポリメラーゼを利用し、ＨＰＶ５２ＤＮＡの鎖の
１つまたはその断片の何れかと相補的なＨＰＶ５２ＲＮ
Ａを従来技術周知の方法を用いた試験管内転写により合
成することができる。 ＨＰＶ５２ＤＮＡまたはその断片を含んだクロニングベ
クターを発育させるための特異的な細菌または真核細胞
宿主は使用したクローニングベクターによって異なる０
例えばλＬ４７でクローン化したＨＰＶ５２ＤＮＡを発
育させる代表的な宿主はエシェリキア・コリ（Ｅ、 ｃ
ｏｌｉ） Ｎ Ｍ ５３８等である［フリシャンフ、Ａ
、Ｍ、ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジー（Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、）、１７０巻、８２
７頁（１９８３年）］、エシェリキア・コリＩ−Ｉ Ｂ
１０１のようなその他の宿主［ボイヤー、Ｈ，Ｗ、ら
、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、４
１巻、４５９頁（１９６９年）］はｐＢＲ３２２または
ｐＵｃｌｌをクローニングベクターとして用いた際に使
用できる。ＰＺＩＰ−ネオＳＶ［Ｘ１］でクローン化し
たＨＰＶ５２ＤＮＡを発育させる代表的な宿主はサルＣ
ｏ５１ｌ砲であるが、ｐＢＫＴＫ−１でクローン化した
ＨＰＶ５２ＤＮＡを発育させる代表的な宿主は多数のよ
く知られている任意の補乳動物細胞系である［ブーイー
ルズ、Ｐ、Ｈ，ら、クローニング・ベクターズ、ア・ラ
ボラトリ−・マヱユアル、エルセーベル、アムステルダ
ム（１９８５年）、参照］。 本質的に精製したＨＰＶ５２ＤＮＡまたはＲＮＡまたは
それらの断片はまた、形質転換種を作り出すＩ−Ｉ Ｐ
Ｖ感染を正常では起こし得ない高等生物体の生殖細胞
系または体細胞へ永久的に挿入し得る［イエイニッシュ
、Ｒ１、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２４０巻、１
４６８〜１４７４頁（１９８８年）］。 高等生物体または多細胞生物体とは酵母等を含む任意の
多＃Ｉ脂動物または植物を意味する。ＨＰＶ５２ＤＮＡ
またはＲＮＡまたはそれらの断片は生殖細胞系の前核へ
直接注入により、またはレトロウィルス感染により、ま
たはレトロウィルス性ベクター、Ｔｉプラスミドベクタ
ー（植物用）または胚幹紺胞の使用により多細胞生物体
細胞の染色体ＤＮＡへ挿入できる。そのようにして作り
出された形質転換種はＨＰＶによって生じる疾患の病原
研究またはＨＰＶ特異的なりＮＡ、ＲＮＡまたはタンパ
ク質のような成分の生産のための貯蔵体として有用であ
る［イエイニツシュ、前掲、およびヴアーマス、Ｈ８、
サイエンス、２４０巻、１４２７〜１４３５頁（１９８
８年）、ホトスタイン。 Ｄ、ら、サイエンス、２４０巻、１４３９〜１４４３頁
（１９８８年）］。 この発明のプローブの一般的なＨＰＶ ＤＮＡまたはＲ
ＮＡまたは特定のＨＰＶ５２ＤＮＡまたはＲＮＡ／＼の
ハイブリッド形成は、それに用いたハイブリッド形成条
件によって左右される。即ち非緊縮ハイブリ・アト形成
条件下では、ＨＰＶ５２ＤＮＡまたはその断片またはＨ
ＰＶ５２ＲＮＡまたはその断片は一般的なＨＰＶ ＤＮ
ＡまたはＲＮＡのためのハイブリダイゼーションプロー
ブとして使用できる。これに反して緊縮ハイブリッド形
成条件下では、ＨＰＶ５２ＤＮＡまたはその断片は特定
のＨＰＶ５２ＤＮＡまたはＲＮＡのためのハイブリダイ
ゼーションプローブとして使用できる。 上述のように異なった型のＨＰＶのＤＮＡおよびＲＮＡ
は非緊縮ハイブリッド形成条件下では、即ち一般群とし
てＨＰＶ ＤＮＡまたはＲＮＡのと等しい塩基構成を
有する完全に塩基対合した２本鎖ＤＮＡの融解温度より
約３５℃またはそれ以上低温で交差反応することができ
る。 したがって非緊縮ハイブリッド形成条件下で、即ち一般
群としてＨＰＶ ＤＮＡまたはＲＮＡと等しい塩基構成
を有する完全に対合した２本ＭＤＮＡの融解温度より約
３５℃低温でハイブリッド形成を実施することによって
、未知のＤＮＡまたはＲＮＡ検体をＨＰＶ型の存在につ
いて試験することができる。 また緊縮ハイブリッド形成条件下で、即ち一般群として
ＨＰＶ ＤＮＡまたはＲＮＡと等しい塩基構成を有する
完全に塩基対合した２本ｇＤＮＡの融解温度より杓１０
℃低温でハイブリッド形成を実施することによって、未
知のＤＮＡまたはＲＮＡ検体を特定のＨＰＶ型の存在に
ついて試験してその型を同定することができる。 この発明の方法で非緊縮条件下のハイブリッド形成は、
まず非緊縮ハイブリッド形成条件下でハイブリッドを形
成し、ついで非緊縮ハイブリッド形成条件下にこれを洗
浄することによって実施される。 またこの発明の方法で緊縮条件下のハイブリッド形成は
、まず非緊縮ハイブリッド形成条件下でハイブリッドを
形成し、ついで緊縮ハイブリッド形成条件下にこれを洗
浄するか、あるいはまず緊縮ハイブリッド形成条件下で
ハイブリッド形成をし、ついで緊縮ハイブリッド形成条
件下にこれを洗浄する何れかによって実施される。最初
の方法、即ちまず非緊縮ハイブリッド形成条件下でハイ
ブリッドを形成し、ついで緊縮ハイブリッド形成条件下
にこれを洗浄する方法では、異なった型のＤＮＡまたは
ＲＮＡ間で生成したハイブリッドは不安定であるが、同
−型のＤＮＡまたはＲＮＡ間で生成したハイブリッドは
安定である。 使用するハイブリダイゼーションプローブとして、未知
のＤＮＡまたはＲＮＡ検体が同−ＨＰＶ型であるか異な
ったＨＰＶ型であるかを決定するには、ハイブリッド形
成を好ましくは非緊縮ハイブリッド形成条件下で実施し
、ついで非緊縮ハイブリッド形成条件下にこれを洗浄す
る。ハイブリッドの存在を検定した後、検出したハイブ
リッドを緊縮ハイブリッド形成条件下に洗浄する。この
方法では、非緊縮ハイブリッド形成条件下でハイブリッ
ド形成した後に残っているハイブリッド量を測定し、緊
縮ハイブリッド形成条件下に洗浄した後も存在している
ハイブリッド量と比較する。 もし生成したハイブリッドの量が緊縮ハイブリッド形成
条件下の洗浄によって全くもしくは極めて少量しか減少
を示さないならば、これは初めに生成したハイブリッド
、即ち非緊縮ハイブリッド形成条件下に生成したハイブ
リッドが同−型のＤＮＡまたはＲＮＡ間のものであるこ
とを示している。 逆にハイブリッドが消失したり、あるいは緊縮ハイブリ
ッド形成条件下に洗浄した後、残存しているハイブリッ
ド量が著しく減少した場合は、初めに生成したハイブリ
ッド、即ち非緊縮ハイブリッド形成条件下に生成したハ
イブリッドが異なった型のＤＮＡまたはＲＮＡ間のもの
であることを示している。 したがってこの発明の方法で、２つのＨＰＶが上述の交
差反応度に関する基準に適合するならば２つのＨＰＶは
同−型であると考えられる。 緊縮ハイブリッド形成条件下に、未知のＤＮＡまたはＲ
ＮＡ検体と結合するＨＰＶ ＤＮＡまたはＲＮＡの結合
能は高度のヌクレオチド配列相同性を示す指標である。 これに反して未知のＤＮＡまたはＲＮＡ検体と非緊縮ハ
イブリッド形成条件下でのみ結合するＨＰＶ ＤＮＡま
たはＲＮＡの結合能は低いヌクレオチド配列相同性また
は中間的な配列相同性を示す指標である。正確なヌクレ
オチド配列の相同性の程度は未知のＤＮＡを直接配列決
定し、これを既知のＨＰＶ ＤＮＡの配列と比較するこ
とによってのみ決定できる。 未知のＤＮＡまたはＲＮＡ検体、例えば生殖器病変から
得られた未知のＤＮＡまたはＲＮＡ検体中の一般的なＨ
ＰＶ ＤＮＡまたはＲＮＡの検出を実施するような際は
、実際問題としてハイブリダイゼーションプローブの混
合物を含有するハイブリダイゼーション１０−１組成物
を利用するのが好都合である。これらのハイブリダイゼ
ーションプローブには、未知のＤＮＡまたはＲＮＡ検体
で存在が疑われるすべての型またはその大部分を代表す
る配列を有する１０−ブを含有する。ＨＰＶ６．１１．
１６．１８．３１．３３．５２型を表すＤＮＡまたはＲ
ＮＡのハイプリダイゼーションプローブ混合物は、未知
のＤＮＡまたはＲＮＡ検体が生殖器病変に由来するもの
である場合、これらのＨＰ Ｖ型が生殖器病変で最もよ
く発見されるようなので特に都合がよい、それ以外の既
知のＨＰＶ型は生殖器病変で決して発見されず、または
発見されるのは希有のことである０例えばＨＰＶｌ、２
および４型は一般に別の型の病変、即ち皮膚のイボで発
見される［バイルマン、Ｃ，Ａ。 ら、ジャーナル・オプ・パイロロジー、３６（ＢＪ、３
９５頁（１９８０年）参照］、このようにＨＰＶ６．Ｉ
Ｌ、１６．１８．３１．３３および５２型を含んだＤ
ＮＡまたはＲＮＡ配列のハイブリダイゼーションプロー
ブ混合物は、未知のＤＮＡまたはＲＮＡ検体が生殖器病
変に由来する場合、都合がよい。 ハイブリダイゼーションプローブ混合物に使用し得るＨ
ＰＶ６．１１．１６．１８．３１および３３型配列の例
は多数報告されている［ギスマン、し１、キャンサー・
サーベイ、３巻、１６１頁（１９８４年）、プフィスタ
ー、Ｈ１、バイオケミカル・ファーマコロジー、９９巻
、１１１頁（１９８３年）、ダースト１Ｍ、ら、プロシ
ーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オ
ブ・サイエンシズ・オブ・ジ・ＬＩＳＡ、８０巻、３８
１２頁（１９８３年）、ポジヤード、Ｍ、ら、ＥＭＢＯ
・ジャーナル、３巻、１１５１頁（１９８４年）、ロリ
ンツ、Ａ、Ｔ、ら、ジャーナル・オブ・パイロロジー、
５８巻、２２５頁（１９８６年）およびボーデノン、Ｓ
９、ネーチャー、３２１巻、２４６頁＜１９８６年）参
照］、またハイブリダイゼーションプローブ混合物に使
用し得るＨＰＶＩ、２および４型の配列の例は当技術周
知のものである［バイルマン、Ｃ，Ａ、ら、ジャーナル
・オブ・パイロロジー、３６０巻、３９５頁（１９８０
年）］、シたがってＨＰＶ５２Ｇ：関するこの発明の開
示とＨＰＶ６．１１．１６．１８．３１および３３型な
らびにＨＰＶｌ、２および４型に関する当業者の知識に
よってハイブリダイゼーションプローブ混合物は容易に
作成できる。 パイプリダイゼーシ日ンプローブ混合物における個々の
ＨＰＶ型のＤＮＡまたはＲＮＡの固有の百分率はこの発
明では決定的なものではない。 般に各ＨＰＶ型のＤＮＡまたはＲＮＡのおよそ等モル量
が混合物に使用される。 ＨＰＶを検出し、型判定を行う手段として核酸ハイブリ
ッド形成は、上述のように液体中［ロギング、Ｊ、Ｒ，
ら、キャンサー・リサーチ、３９巻、５４５頁（１９７
９年）参照］または固体支持体［マニアティス、Ｔ、ら
５モレキユラー・バイオロジー、ア・ラボラトリ−・マ
ニュアル、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラト
リ−コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク（
１９８２年）参照］またはイン・サイチュ［ブリガティ
、Ｄ、Ｊ、ら、パイロロジー（Ｖｉｒｏｌ、）、１２６
巻、３２頁（１９８３年）およびベックマン、Ａ、Ｍ、
ら、ジャーナル・オブ・メジカル・バイ００ジー（Ｊ、
Ｍｅｄ、 Ｖｉｒｏｌ、）、１６巻、２６５頁（１９
８５年）参照］で実施できる。 固体支持体によるハイブリッド形成は多くの異なった方
法を用いて実施できる。そのような方法の一つは未知の
ＤＮＡまたはＲＮＡのすべてを一本鎖の形で固体支持体
上に固定化し、ついで標識したＨＰＶ５２ＤＮＡまたは
その断片、または標識したＨＰＶ５２ＲＮＡまたはその
断片とハイブリッド形成する方法である。 好ましい一実施態様として、未知の検体を別々に固体支
持体へ固定化する。もう一つの好ましい実施態様では、
固体支持体へ固定化する前に未知の検体を一緒に混合す
る。混合検体はその大半が陰性である膨大な検体を迅速
スクリーニングするのに特に都合がよい。 別法として精製した未知のＤＮＡを１またはそれ以上の
制限エンドヌクレアーゼで消化し、得られた検体中のＤ
ＮＡ断片を電気泳動によって分離することができる。つ
いでＤＮＡ断片を固体支持体へ移し、標識したＨＰＶ５
２ＤＮＡまたはその断片または標識したＨＰＶ５２ＲＮ
Ａまたはその断片とハイブリッド形成する。 同位体または非同位体検出法を用いるイン・サイチュハ
イブリッド形成はスライドガラス上で実施し、殻終結果
を顕微鏡で評価する。この方法ではｌ） Ｎ Ａまたは
ＲＮＡは細胞から精製されないが、そのほかのすべての
細胞成分とともに残っているＩシンガー、）（，１−１
，ら、バイオテクノロジ゛ （Ｂｉ（ＩＴＩ＋ｒｔｌ＋
＋＋ｏｌｕｇｙ）、４巻、２３０−２５０頁（１９８６
年）］。 １−１１’Ｖ５２ＲＮＡまたはその断片は、ｌｌ製抽出
物、特に例えば生殖器病変から精製したＤＮＡよりむし
ろそのような生殖器病変からの［！抽出物を筒用する場
合、好ましくは一般的なＨｒ’ＶＤＮＡおよび特定のＨ
ＰＶ５２ＤＮＡの核酸ハイブリダイゼーシシン１０−ブ
として使用される。 またＨＰＶ５２アンチセンスＲＮＡまたはその断片はＨ
ＰＶセ〉ス鎖ＲＮＡとのハイブリッド形成によって、一
般的なＨＰＶ遺伝子発現および特定のＨＰＶ５２遺伝子
発現の阻害因子または調節因子として使用できる。遺伝
子発現を阻害するアンチセンスＲＮＡプローブのｆｅ用
については参考文献として本明細書に包含させたすしテ
ンスタイン、Ｃ１の論文に報告されている［ホーチャー
３３３巻、８０１〜８０２１’（（１９８８年）］。 ＨＰＶ５２アンチセンスＲＮＡまたはその断片は複製ウ
ィルスをプローブｌ＼加えることによって標識すること
なく、一般的なＨＰＶおよび特定の１−Ｉ Ｐ Ｖ５２
の発現を阻害するプローブとして使用できる。ウィルス
との接触は軟膏のような中でウィルスをアンチセンスＲ
ＮＡへ加える任意の方法により、あるいは例えば別のウ
ィルスでトランスフエフシランすることにより、または
形質転換もしくはマイクロインジェクションによりアン
チセンスＲＮＡ供給源を細胞へ挿入することによって起
こすことができる。 ウィルスのゲノムはその独自性および限定された複雑さ
から、プローブとして使用する核酸の放射性標識のよう
な種々のハイブリ・ラド形成手法、固定化した核酸との
ＤＮＡ−ＤＮＡおよびＲＮＡＤＮＡハイブリッド形成、
細胞ハイブリッド形成および溶液中のＤＮＡ ＤＮＡお
よびＤＮＡ ＲＮＡハイブリッド形成反応の速度解析法
に特によく適している。ハイブリッド形成の手技および
そのＤＮＡ診断への応用に関しては最近の総説がある１
ランデグレン、Ｕ、ら、サイエンス、２４２巻、２２９
−２３７頁（１９８８年）］。 特異的ハイブリッド形成では、プローブとして使用する
核酸の純度が最も決定的な要素である。 ウィルスを１０−ブ供給源として使用することが望まれ
る場合、特に相補的なＲＮＡ（ｃＲＮＡ）または相補的
なりＮＡ（ｃＤＮＡ）を使用する際は、ウィルスを感染
細胞からよりもむしろ細胞外液から回収する方が好まし
い、細胞から回収されたウィルスは混入した細胞性ＤＮ
Ａを随伴しており、このＤＮＡはデオキシリボヌクレア
ーゼ処理によって必ずしも除去されない、したがってデ
オキシリボヌクレアーゼで加水分解した細胞処理が被覆
されたゲノムの断片化を起こさないから５最初の段階で
ヴイリオンの完全性を保持する技術り既知の任意の方法
によって高度に純化されたウィルスを入手すべきである
。精製によって生じたゲノムは著しく断片化されず、大
きさおよび密度またはスーパーコイル状態のような物理
的性質に基づいて細胞性核酸から分離し得るから、抽出
したウィルスＤＮＡを°この時点で厳密に精製すべきで
ある。その後、高度に純化したゲノノ、をエンドヌクレ
アーゼで処理して断片とし５型特異的または属特異的な
ウィルスタンパク質を暗号化している所望のヌクレオチ
ド配列を含有する断片を単離し、回収する。別法として
特定のポリヌクレオチドプローブを試験管内で生物系ま
たは化学反応の何れかで別個に合成することもできる。 生物系としては、ｍｃａのような原核生物体および酵母
、単離した培養内細胞、多細胞生物体の生殖細胞系細胞
。 多細胞生物体の体組織細胞または植物細胞等のような真
核生物体の双方が含まれる。核酸ハイブリッド形成技術
に関する一層詳細な議論はヌクレイツク・アシッド・ハ
イブリダイゼーション［Ｂ。 Ｄ、ヘイノ、ズおよびＳ、Ｊ 、ヒギンズ編、ＩＲＩ、
１【ス、ワシントン、Ｉ）、Ｃ，（１９８５年）］に示
されている。 ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド・プ１７−
ブは原子または無機原子団で標識でき、最も ・殻に使
用されるのは放射性ヌクレオチドであるが、あるいは重
金属も使用し得る。またある状！ぶては１本鎖ＤＮＡ／
＼ハイブリッド形成した１０−プと特異的に結合する抗
体も使用し得る。オリゴヌクレオチド１０−ブの技術に
関しては参考文献として本明細書に包含させたスジスタ
ックらの報告がある１スゾスタツク、Ｊ、Ｗ、ら、メソ
ッズ・イン・エンサイモロジー。６８巻、４１９へ４２
８頁（１９７９年）Ｊ。 放射性標識にはｊ２ｐ 、 ３Ｈ，１４（−、％Ｓ、ま
たは１２′１等を含む好適な放射性標識が最も一般に使
用される。好適な信号を提供し、十分な半減期を存する
任意の放射性標識を使用し得る。その他の標識としては
りガント、螢光体、化学発光体、酵素および抗体等が挙
げられる。 未知の１３ＮＡ検体中のＨＰＶ５２ＤＮＡｔ−Ｍ出する
ハイブリダイゼーション１０−プとしてｌ−Ｉ ＰＶ’
５２ＲＮＡを使用する場合は、まず緊縮ハイブリッド形
成条件下でハイブリッド形成した後、生成したＤＮＡ−
ＲＮＡハイブリッドを室温で膵臓リボヌクレアーゼＡ″
Ｃ″処理しく約２０ ｍ ｇｅｍ ｌ、５０ｍＭＮａＣ
１溶液（ＰＨ７，０））、ついで緊縮ハイブリッド形成
条件下にこれを洗浄する。 ＨＰＶ５２ＤＮＡまたはその断片は例えばリグビーらの
報告した周知の手段による「二・ツクトランスレーショ
ン」 ［リグビー、Ｐ、Ｊ、Ｗ、ら、ジャーナル・オブ
・モレキュラー・バイオロジー１１３巻、２３７頁（１
９７７年）］および例えばディーンらの報告した”ｒ’
４ＤＮＡポリメラーゼ置換合成］デイ−〉・、Ｋ、Ｃ，
ら、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ、
Ｂｊｏｃｈｅｍ、）、 １３５巻、４５６頁（１９８
３年）］によって放射性に標識できる。別法としてＨＰ
Ｖ５２ＤＮＡまたはその断片はオリゴヌクレオチドプラ
イマーおよびポリメラーゼ連鎖反応のような酵素反応を
用いて検体内で合成および標識し、または検出すること
ができる【マークス１．１ 、 Ｌ 、、サイエンス、
１４０巻、１４０８〜１４１０頁（１９８８年）］。 ＨＰＶ５２ＲＮＡまたはその断片は、例えばダバンルー
らの報告のように試験管内転写によって放射性マーカー
で標識することができる［ダバンルー、Ｐ、ら、プロシ
ーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オ
ブ・サイエンシズ・オブ・ジ・ＵＳＡ、８１巻、２０３
５頁（１９８４年））、ＲＮＡポリメラーゼは標識した
前駆物質を利用できるので、この方法によって一般的な
）！ＰＶ ＤＮＡまたはＲＮＡ、または特定ノＨＰＶ５
２ＤＮＡまたはＲＮＡを検出するためのＨＰＶ５２ＲＮ
Ａプローブを作成するように標識したＲＮＡを合成する
ことが可能である。 またＨＰＶ５２ＤＮＡまたはその断片またはＨＰＶ５２
ＲＮＡまたはその断片はビオチン、酵素または螢光物質
のような非放射性マーカーで標識すると、一般的なＨＰ
Ｖ ＤＮＡまたはＲＮＡ、および特定のＨＰＶ５２ＤＮ
ＡまたはＲＮＡのための核酸ハイブリダイゼーション１
０−プとして有用である。ビオチンはハブテン様の基と
して作用してＤＮＡまたはｒ（ＮＡと結合することがで
き、アビジン結合酵素またはストレプトアビジン結合酵
素をビオチンと結合させ、ついで非特異的に結合した酵
素を洗浄、除去することによってこれを検出できる。そ
の酵素に好適な基質を添加すると基質が着色性生産物ｌ
＼ＩＲ換し、検出することができる（レアシー１．１．
Ｊ、ら、アロシーディングて・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ジ・ＬＩＳＡ
、８０巻、７１０４５頁（１９８３年）］、そのような
酵素の例としてアルカリ性ホスファターゼおよび西洋ワ
サビ・ペルオキシダーゼ等が挙げられる［レンツ、Ｍ。 ら、ヌクレイツク・アシシズ・リサーチ（Ｎｕｃ。 Ａ（・ｉｄｓ Ｒｅｓ、 ）、１２巻、３４３５〜３４
４４頁（１９８４年）］、またフルオレセインおよびロ
ーダミンのような螢光分子をアビジンまたはストレプト
アビジンと化学的に結合させ、非放射性マーカーとして
使用することもできる。 別法として例えばレンツ、Ｍ、の報告したようにｌ ｌ
＜ Ｍ Ｒ（’）・ジャーナル、６巻、８１７頁（］（
）８８３年］、Ｆ記の酵素または螢光分子をＨＰＶ５２
ＤＮＡまたはその断片またはＨＰＶ５２ＲＮＡまたはそ
の断片と化学的に直接結合させ、この態様でハイブリダ
イゼーションプローブとして使用できる。 このようにしてｔａＸしたＨ Ｐ Ｖ ５２ ＤＮ Ａ
またはＨＰＶ’１２）（ＮＡまたはそれらの断へを、ト
記のように未知のＤＮＡまたはＲＮＡ検体Ｊたは未知の
ＤＮＡまたはＲＮＡ検体混合物、特に生殖器に由来する
未知のＤＮＡまたはＲＮＡ検体または未知のＴ）ＮＡま
たはＲＮＡ検体混合物とのハイブリッド形成研究に使用
し、検体が一般的なＨＰＶＤ Ｎ ＡまたはＲＮＡまた
は特定のＨＰ Ｖ５２ ｒ） ＮＡを含んでいるかどう
かを測定することができる５未知のＤ Ｎ ＡまたはＲ
ＮＡ検体または未知のＤＮＡまたはＲＮＡ検体混合物は
、生殖器に由来するもの以外にも喉、口または戊膚病変
のようなその他の病賓からも得ることができる３ 未知のＤＮＡまたはＲＮＡ検体または未知のＤＮＡまた
はＲＮＡ検体混合物は・、例えば１−皮病変の生検、ま
たは子宮頚部の擦過または子宮頚部の綿棒拭き取りによ
って剥脱細胞を採取することができる。また未知のＤＮ
ＡまたはＲＮＡ検体または未知のＤＮＡまたはＲＮＡ検
体混合物は、病変から得られたＤＮＡまたはＲＮＡをマ
ニアティスらの報告した周知の手段を用いてクローン化
した細菌細胞から得ることができる［マニアティス、Ｔ
、ら、モレキュラー・バイオロジー、ア・ラボラトリ−
・マニュアル、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボ
ラトリ−、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨ
ーク（１９８２年）およびギスマン、Ｌｏ、キャンサー
・サーベイ、３巻、１６１〜１８１頁（１９８４年）参
照］。 この発明の方法において交差反応の検定は、２本鎖核酸
ハイブリッドと結合した放射性または非放射性マーカー
の存在を検定することによって実施できる。特異的なマ
ーカーが存在するかどうかを測定する方法は使用したマ
ーカーによって異なり、従来技術でよく知られている。 好ましい態様として、マークスの報告したポリメラーゼ
連鎖反応［マークス＋ Ｊ、Ｌ、、サイエンス、１４０
巻、１４０８〜１４１０頁（１９８８年）］に特異的な
ＨＰＶ５２オリゴヌクレオチドプライマーおよびＤＮＡ
ポリメラーゼを使用し、未知の検体のＨＰＶ ＤＮＡお
よび／またはＲＮＡ、またはＨＰＶ５２ＤＮＡおよび／
またはＲＮＡの存在を検定する。異なったＨＰＶ型に特
異的なリンカ−の混合物を従来技術周知の手法によって
合成し、緊縮条件下におけるこれらリンカ−のハイブリ
ッド形成によって未知の検体中のＨＰＶ型の任意の一つ
の存在を検出するのに使用できる。 別法として未知の検体中の任意のＨＰＶ ＤＮＡまたは
ＲＮＡの存在は、非緊縮条件下でプライマーを検体へハ
イブリッド形成させることによって検出できる。 もう一つの好ましい態様では、Ｊ（ＰＶ ＤＮＡおよび
／またｇｉＨＰＶ ＲＮＡ、特にＨＰＶ５２ＤＮＡおよ
び／またはＨＰ Ｖ ５２ ＲＮ Ａは、例えばＱ−ベ
ーターーレプリカーゼ系で用いられるような増幅可能な
ＨＰＶ５２ＲＮＡ配列を１０−ブとして使用して検出で
きる［チュー、Ｂ、Ｃ，Ｆ、ら、ヌクレイツク・アシッ
ズ・リサーチ、１４巻、５５９１〜５６０３頁（１９８
６年）］。 この発明のハイブリダイゼーションプローブとして使用
できるＨＰＶ５２ＤＮＡまｔ！ ＨＰ Ｖ ５２ＲＮＡ
断片の個々の大きさは決定的なものではない、）！ＰＶ
５２ＤＮＡまたはＨＰＶ５２ＲＮＡ断片の大きさは１本
鎖プローブまたは２本鎖プローブの何れを使用するかに
よって変わり１例えば約１５〜約５ｏｏｏ塩基または塩
基対、好ましくは約３００へ約ＳＯＯ＊基または塩基対
であることができる。インーサイチュでハイブリッド形
成を実施する場合は、ＨＰＶ５２ＤＮＡまたはＨＰＶ５
２ＲＮＡ断片の大きさは約５００塩基または塩基対より
小さい方が、それより大きいＨＰＶ ＤＮＡまたはＨＰ
Ｖ ＲＮＡよりもこの大きさの断片が一層効率的にイン
・サイチュ・ハイブリッド形成するので好ましい、１５
〜１００塩基と一層小さい側の断片でもポリメラーゼ連
鎖反応で使用するプライマーとして好ましい、２本Ｗ４
ＤＮＡまたはＲＮＡを使用する場合は、ハイブリッド形
成を実施する前にＤＮＡまたはＲＮＡを変性しなければ
ならない。 ＨＰＶ５２ＤＮＡ断片はＨＰＶ５２りＯ−７ｐＣＤ１５
の制限エンドヌクレアーゼ消化により、または商業的に
入手可能な任意のＤＮＡ合成装置を使用する合成的な製
造方法により、または周知の手段によって測定できるＨ
ＰＶ５２ＤＮＡ配列を使用する周知の化学的方法によっ
て得ることができる［サンガー、Ｓ、ら、プロシーデイ
ングズ・オプ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ
イエンシズ・オブ・ジ・ＬＩＳＡ、７４巻、５３６３頁
（１９７７年）］。 ［実施例］ 以下に実施例をあげてこの発明をさらに詳細に説明する
。実施例は単に発明を説明するためのものであって、発
明の範囲を限定する目的をもつものではない、説明中、
特に示さない限りすべての部、百分率および比率等は重
量単位で示す。 実施例Ｉ ＨＰＶ５２ＤＮＡのクローニング 使用した出発物質は数ミリグラムの組織からなる生検検
体から得られた子宮頚部上皮的新生物である。ＤＮＡ全
体をマニアティスの報告のように精製した［マニアティ
ス、Ｔ、ら、モレキュラー・バイオロジー、ア・ラボラ
トリ−・マニュアル、コールド・スプリング・ハーバ−
・ラボラトリ−コールド・スプリング・ハーバ−ニュー
ヨーク（１９８２年）］、具体的には組織を細く刻み、
これを０．６％（Ｗ／Ｖ）ドデシル硫酸ナトリウムおよ
び５０Ｍｇ／ｍ＋プロテイナーゼＫを含有する５ ０ｍ
Ｍ トリス−ＭＣＩ （ｐＨ８，０）１−Ｏｍ＋溶液で
３７℃で一夜消化した。得られた消化物をフェノール：
クロロポルム（１： １ （ｖ／ｖ）） １．０ｍｌで
２回抽出した。ついで９０％（ｖ／ｖ）エタノール２容
量を加えて水層からＤＮＡを沈殿させた。沈殿したＤＮ
Ａを１０ｍＭ＋・リス、１．ＯｍＭ ＥＤＴＡ縛ｌＦ
Ｉ液（ｐＨ８，０）（以下ｒＴＥ、緩街液という）に約
１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で再溶解した。 ＤＮＡをＰｓｔｆで完全に消化し、サザーンの報告のよ
うに１．０％（ｗ／ｖ ）アガロースゲルで電気泳動し
、ＤＮＡをニトロセルロースフィルターへ移した［サザ
ーン、Ｅ、Ｍ、、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ
イオロジー、９８巻、５０３頁（１９７５年）］、つい
でフィルターを非緊縮ハイブリッド形成条件下（Ｔｍ−
３５℃）および緊縮ハイブリッド形成条件下（Ｔｍ−１
０℃）でＨＰ Ｖ２Ｏ型から得たＤＮＡとプローブした
。ハイブリッド形成は１．０ＭＮａＣ１，５０ｍＭリン
酸ナトリウムｖｉ訴液（ｐＨ７，４）、１．０ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ。 ２％（Ｗ／Ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム、０．１％（ｗ
／ｖ）ゼラチン、５０Ｍｇ／ｍｌ ｔＲＮＡおよび３０
％（Ｖ ／Ｖ ）ホルムアミド中で一夜４３℃で実施し
た。１．２ＸＳＳＣ（ＩＸＳＳＣは０．１５Ｍ Ｎａ
Ｃｌおよび０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムからなる）
、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７，４）、１．０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡおよび０．５％（Ｗ／■）ドデシル硫酸ナ
トリウム溶液で５５℃で３０分閏ずつ４回洗浄を行った
。ハイブリッド形成は非緊縮形成条件下ではＨＰＶ１６
型で実現したが、緊縮ハイブリッド形成条件下では達成
しなかった。 得られた精製ＤＮＡおよびλＬ４７をＥｃｏＲＩ ｆ＋
ＩＩ限エンドヌクレアーゼで消化すると８ｋｂの断片が
生じた。この断片をλＬ４７の唯一つのＥｃｏＲ１部位
へクローン化した。具体的には総量５０μ！＋７）ＴＥ
！［１中、４％らｔｕ、：ｔｌＷＤＮＡ ２．０μｇ
およびλＬ４７ＤＮＡ ２．ＯｔｔｇをＥｅｏＲＩ １
０単位で３７℃で１時間切断した。ついで得られた反応
混合物をＴＥ！ＩＩ液４００μｌで希釈し、上記のよう
に等容量のフェノール：クロロホルムでフェノール抽出
した。ついで水層をクロロホルム：イソアミルアルコー
ル（２４： １ （ｖ／ｖ））で抽出し、８０％（Ｖ／
Ｖ）エタノールで水層がらＤＮＡを沈殿させ、乾燥した
。ついで乾燥したＤＮＡをそれぞれ６６ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｌ、６．６ｍＭ Ｍｇ ＣＩｔ １０ ｍ Ｍ Ｄ
Ｔ Ｔおよび１．ＯｍＭ ＡＴＰを含有する１×リガ一
ゼＭ！街液１０μｌに浮遊させ、４２℃で２時間インキ
ュベートしてλアームをアニーリングした。つぎに７４
ＤＮＡリガーゼ０ 、５ ｔｔ ｌ （ＰＪＪち約１
単位）および１０ｍＭＡＴＰ（ｐＨ７，０）０．５μｍ
を各反応液へ添加し、１２℃で一夜ライゲーションを進
行させた。 つぎにライゲーション生産物をパッケージして感染性の
あるファージを作成し、エシェリキアコリＬ４７の感染
に使用した。具体的には１リツ１１し当りトリプトン１
０ｇおよびＮａＣ１５，Ｏｇを含有するアガロースプレ
ート（以下ｒＴＮ培地Ｊという）Ｌで発育させたエシェ
リキア・コリＬ４７の単一コロニーを選び、ＴＮ培地２
０ｍ１で初期定常期となるまで振とう培Ｊ［上（２５０
ｒｐｍ）、３７℃で一夜発育させた。ついで細胞培養を
ＴＮ培地で４倍に希釈し、さらに３時間発育さセタ、ツ
ぎにツルポール（Ｓｏｒｖａｌｌ） ＨＲ−４０−ター
で５０００ｒｐｍ、５分間遠心することによって細胞を
回収し、得られた細胞ベレットを１０ ｍ Ｍ Ｍ ｇ
Ｓ Ｏａ溶液で初めの容量の０．２５に再浮遊し、４
℃で貯蔵した。 パッケージした感染性のあるファージは商業的に入手可
能なりＲＬラムダ・イン・ビトロ・パッケージング・シ
ステノ、（ＢＲＬ Ｌａｍｂｄａ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ
Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて調製した
［マニアテイス、Ｔ、ら、モレキュラー・バイオロジー
、ア・ラボラ！・リー・マニュアル、コールド・スプリ
ング・ハーバ−・ラボラ■−リー、コールド・スプリン
グハーバ−、ニューヨーク（１９８２年）］。 パッケージしたファージを０．５Ｍトリス−ＨＣＩ（ｐ
Ｈ８，０＞、０．１Ｍ ＮａＣＩ、０．０１ＭＭｇ５
０４および０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン（デイフコ（
Ｄｉｒｃｏ＞）含有ファージ貯蔵榎街液で希釈した好適
な希釈液（直径９ｃｍのグレート１枚当りプラーク１．
５Ｘ１０’を与える）１００μｌを、１０〜１５ｍ１の
試験管に前記のように調製したエシェリキア・コリＮＭ
５３８ １００μ！へ加えて静かに混合し、室温で１５
分間インキュベートした。ついでこの、Ｉｎ胞−ファー
ジ溶液を１リットル当りｌ・リブチカーゼ大豆ブロス１
０ｇ、ＮａＣ１５，０ｇおよび寒天１５ｇを含有する少
なくとも１日前に調製し、あらかじめ３７℃に加温した
トリ１チカーゼ大豆ブロス寒天プレートへ移植した。使
用前に電子レンジで溶液が沸騰するまで加熱し、４５℃
に冷却した１ ０ ｍ Ｍ Ｍ ｇ Ｓ Ｏａ溶液に溶
解した０、５％アガロース（超高純度品、電気泳動縁）
を含有するアガロースオーバーレイ３・〜５ｍｌ を移
植した細胞−ファージへかぶせた。 アガロースが固化した後、循環の良い３７℃空気吹き込
み式インキュベーターへプレートを移し、３０分間プレ
ートの蓋を開け、ついで蓋を閑じてプレートを裏返しに
した。８〜１２時間後、プラークが明瞭に現れた。 感染によってプレート上の細菌の全面溶菌が生じた。ベ
ントンらが報告した「プラーク釣り上げ（ｐｌａｑｕｅ
１ｉｆｔｓ）」を実施することによってＨＰＶＤＮＡ
を保有する組換えファージの位置をつきとめな［ベント
ン、Ｗ、Ｄ、ら、サイエンス、１９６巻、１８０頁（１
９７７年）］、具体的には全面溶菌したプレートを４℃
で１時間放置し、アガロースを固化させた。ついで好適
な大きさのニトロセルロースフィルター片を中央で曲げ
てプレート中心部に接触させ、接触点を端の方までひろ
げることによって各プレート上に配置した。ついで細い
ゲージの針でニトロセルロースフィルターおよび寒天に
４つの対称的な穴を開け、パーマネントマーカーで穴の
位置をプレートの底に印した。これによって二Ｉ・ロセ
ルロースフィルターおよび陽性の信号を含んでいる任意
の他の区域をプレートの対応する位置と照合することが
できる。１０分後にニトロセルロースフィルターをはが
し、プラーク側を上にして二１〜口セルロースフィルタ
ーを０．５Ｍ ＮａＯＨ１２，０Ｍ ＮａＣ＋溶液２０
０ｒｎ＋を含有する平皿へ１分間加えることによってＤ
ＮＡを変性した。ついでニトロセルロースフィルターを
０．５Ｍ）リス−ＭＣＩ、２．０Ｍ ＮａＣＩ（ｐ）１
７．５）５００ｍｌに５分間浸けることによって中和し
な、つぎにフィルターを０．９ＭＮａＣ１，０，０９Ｍ
クエン酸ナトリウムを含有する６ｘｓｓｃ溶液で１分間
すすぎ、ワットマン（１＃ｈａｔｍａｎ）３ＭＭペーパ
ー上で乾燥した後、真空下に３０分間８０℃で焼成した
。 その後、［ニックトランスレーション」によって ）２
Ｐ標識したＨＰＶＩ ６ＤＮＡをプローブとして使用す
る非緊縮ハイブリッド形成を、釣り上げたプラークから
単離したＤＮＡに実施し［リグビー、Ｐ、Ｊ、Ｗ、ら、
ジャーナル・サブ モレキュラー・バイオロジー、１１
３巻、２３７頁（１９７７年）およびマニアティス、Ｔ
、ら、モレキュラー・バイオロジー、ア・ラボラトリ−
マニュアル、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラ
Ｉ・リー、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨ
ーク（１９８２年）参照］、ついでこれを洗浄し、オー
トラジオグラフィーに掛けた。具体的には１．０Ｍ Ｎ
ａＣｌ、２８％（Ｖ／Ｖ）ホルムアミド、５０ｍＭＮ−
）リス（ヒドロキシメチル）メチル ２−アミノエタン
スルホン酸（以下［′「ＥＳＪと言う）、１０Ｘデンハ
ーマー溶液、０．１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１０ｍＭリン
酸ナトリウム（ｐＨ７，４＞を含有する溶液中で４１℃
でハイブリッド形成を実施した。ついで非緊縮条件下に
、］ＯｒｎＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７，４）、０．１
ＭＭ ＥＤＴＡ溶液中、１．Ｉ Ｘ５ＳＣ（０，１６５
ＭＮａＣ＋および０．０１６５Ｍ クエン酸ナトリウ
ムを含有）を使用して５２℃で洗浄を実施した。 放射線照射部位と対応させることによって、ｌ４ＰＶ１
６ＤＮＡへハイブリッド形成したＤＮＡを含んだファー
ジを含有するブレー１〜の領域を切り取り、前記と同様
にエシェリキア・コリの再感染に使用した。上記の方法
を縁り返すことによってＨＦ’ＶＤＮＡを含んだファー
ジ・１ラークの位置をつきとめた。Ｅｃｏ旧で消化した
ＤＮＡを使用したクローニングからスクリーニングした
１０％のプラークから１プラークを同定した。クローン
化した断片は８ｋｂの大きさを有し、これをクローンＣ
Ｄ１５と命名した。 ついでＨＰＶ５２クローンＣＤ１５のＨＰＶＤＮＡをＥ
ｃｏＲＩで消化し−ｐｕｃの唯一のＥｃｏＲ１部位でサ
ブクローン化した。得られた組換えＤＮＡをＨＰＶ５２
クローンｐＣＤ１５と命名した。 実施例２ ＨＰ Ｖ ５２ Ｄ Ｎ Ａ （７）確認１、ハイブリ
ッド形成研究 ＨＰ Ｖ ５２クローンｐＣＤ １５についてハイブリ
ッド形成研究を実施し、ＨＰＶ５２クローンｐＣＤ １
５が新しいＨＰＶ型であることを証明した。 具体的にはＨＰＶ５２クローンｐｃｏ １５から作成し
た３２Ｐ「ニックトランスレーション」したＤＮＡを緊
縮条件下にＨＰＶＩ〜５１型に由来するＤＮＡ５ｎｇヘ
サザーンブロツティングすることによりハイブリッド形
成した。ＨＰＶ１〜４２型のＤＮＡはインスティテユー
ト・パスツール（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｐａ５ｒｅｕｒ
） （パリ、フランス）のジェラール・オルト博士（Ｈ
ＰＶ型命名担当者）、ババビローマ・リファランス・セ
ンター（Ｐａｐｉ ｌ ｌｏｍａＲｅｆｅｒｅｎｃｅ
Ｃｅｎｔｅｒ）（ハイデルベルク、西ドイツ）のエセル
・ミシェル・デ・ヴイリエール博士およびライフ チク
ノロシーズ・インコーホレーテッド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ、）からニトロセルロースフィ
ルターへ固定化する前の形で入手した。具体的には１．
ＯｍＭ ＮａＣｌ、２８％（Ｖ／Ｖ）ホルムアミド、
５０ｍＭ Ｎ−トリス ＴＥＳ、１０×デンハート溶
液、０．５ｍＭ ＥＤＴＡおよび２０ｍＭリン酸ナトリ
ウム（ｐＨ７，４）を含有する溶液で４１℃でハイブリ
ッド形成を実施した。ついで緊縮条件下に１０ｍＭリン
酸ナトリウム（ｐＨ７，４）、０．１ｍＭＦ、ｒ）Ｔへ
溶液中、０．０３ＸＳＳＣ（０，００４５Ｍ ＮａＣｌ
および０．０００４５Ｍクエン酸ナトリウムを含有）を
使用して洗浄を６５℃で実施した。 標準的なハイブリッド形成条件（Ｔｍ−２５℃〉、飽和
ハイブリッド形成およびヒドロキシアパタイトクロマ１
へグラフィーによってρＣＤ１５および１１ Ｐ Ｖ
３３は２８％のＤＮＡ配列相同性を有することを示した
。型命名は標準的なハイブリッド形成条件下における５
０％またはそれ以下のＤＮＡ配列相同性に基づいている
から、この単離体は新しい型のＨＰ Ｖを表している。 ＨＰＶ５２クローンｐＣＤ１５の組換えＤＮＡとＨＰＶ
３３およびそのほか大多数のＨＰ Ｖ型との間で非緊縮
ハイブリッド形成条件下では著しい相同性が検出される
が、緊縮ハイブリッド形成条件下ではＨＰＶＩ〜・５１
型のいずれとも何ら相同性が認められない、したがって
ＨＰＶ５２クローンｐｃＤ１５は新規のＨＰＶ型を表し
ていることが証明された。 ２、核酸配列 Ｌ１転写読み取り枠の中央からＨＰＶ５２り１７−ンｐ
ＣＤ １５のための非コード領域の全域にまたがる部分
的ヌクレオチド配列を第１図に示す。 ３、ν１限酵素切断地図 ＨＰＶ５２のための制限酵素切断地図を第２図に示す、
下記の制限酵素、Ｂａｎ１ｌ 、 Ｂｃｌ Ｉ 、ｌ１
ｐａ ＋、）１ｉｎｄｌ 、Ｓａｃ Ｉ 、 ５ｐｈｌ
ｌ 、 Ｓｐｈ Ｉ 、ＸｈｏｌはＨＰＶ５２ＤＮＡを
切断しない。 ４、ゲノム構成 １−Ｉ Ｐ Ｖ ５２のゲノムがＨＰＶ３３と同一また
は類似の転写読み取り枠構成を有することを証明するた
め、下記のハイブリッド形成研究を実施した。 ＨＰＶ５２クローンｐＣＤ １５から精製したＤＮＡを
、ＨＰＶ３３ＤＮＡの”Ｐ ｒ二、、クトランスレーシ
ョン」した断片を１０−ブとして使用する前記のような
非ｙＡ縮条件下および緊縮条件下のサザーンブロッティ
ングに掛けた。これらの断片を各種の制限酵素で消化し
たＨＰＶ３３のサザーンブロツトヘハイブリッド形成さ
せた。大部分の１−１Ｆ’ Ｖ ５２ ノ断片はｔ（Ｐ
Ｖ ３３ （７）別／？（７１）断片へハイブリッド
形成した（第３図）、６個のｌ（Ｐ Ｖ ５２交差反応
断片のうちの５個はＨＰＶ３３断片と１” ｍ−１０で
安定な２．ｆｔｔ体を生成した。残りの断片だけはＴｍ
−３０でＨＰＶ３３とハイブリッド形成した。これらの
結果に基づき、ＨＰ Ｖ ５２ゲノノ、はＨＰ Ｖ ３
３ゲノムと共直線的であると思われる。 ＨＰ Ｖ ５２制限酵素断片はＨＰＶ３３のゲノムの２
つの領域と交差反応しない、１つの領域は早期領域の３
°末端を包含し、もう１つはＬ１転写読み取り枠（ＯＲ
Ｆ ）の３′末端からＥ６０ＲＦへ伸長している領域で
ある。 これらの非相同領域をさらに解析するため、発明者らは
ＨＰＶ５２ゲノムの３４６ヌクレオチドの５°の点から
５°Ｂａｍ１１部位を通ってＨＰＶ５２ゲノムの独自の
Ｋｐｎ １部位へ至る１９５０ヌクレオチドの配列を決
定した（第１図）、この領域はＬＩ ＯＲＦのアミノ酸
１５３からＩ−Ｉ Ｐ Ｖ ３３の非コード領域にわた
って等しい、ＨＰＶ３３とＨＰ Ｖ ５２のヌクレオチ
ド配列を比較するとＬｌＯＲＦで７５％の配列相同性お
よび非コード領域で５０％より小さい相同性が見られる
。このＬｌｏＲＦおよび非コード領域の間の相同性にお
ける突然の変化を第４図に示す、ＬＩＯＲＦの部分的ヌ
クレオチド配列のアミノ酸配列の比較からこれら２つの
ウィルス間では８２％のアミノ酸相同性があることが判
明した。 実施例３ 有病率の研究 米国における有病率の研究から、ＨＰＶ５２配列は子宮
頚部上皮肉新生物の１３７例中３例（２％）に、また子
宮頚部扁平上皮細胞癌の４８例３ｌ例（２％）に存在し
た。 この発明について詳細に特殊な実施態様を引用して説明
したが、この発明の精神および権利範囲から外れること
なくさまざまな変更および修飾を切断部位を図式的に示
した図、第３図は非緊縮ハイブリッド形成条件下の核酸
ハイブリッド形成によって測定したＨＰＶ３３とＨＰＶ
５２との閏の部分的相同領域、第４図はＬ１転写解読枠
とＨＰＶ５２およびＨＰＶ３３の非コード領域との相同
配列の比較を示した図である。 第１図は非コード領域、ｐＣＤｌ ５の１９５０特許出
願人 ジョージタウン・ユニバージティー化 理 人
弁理士 青 山 葆 ほか１名塩基配列、第２図はＨＰ
Ｖ ５２に対する制限酵素手続補正書 （方式） ％式％ 発明の名称 ３、補正をする者 事件との関係
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、クローニングベクターおよびヒト乳頭腫ウィルス５
２型（ＨＰＶ５２）ＤＮＡの実質上全体またはその断片
を含んでいるＨＰＶ５２の組換えＤＮＡ。 ２、クローニングベクターがｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１１
、λシャロン、λＬ４７、Ｍ１３誘導バクテリオファー
ジ、ｐＺ１Ｐ−ネオＳＶ［Ｘ１］、ｐＢＫＴＫ−１、ｐ
Ｔ７１２およびｐＴ７１３からなる群から選ばれた請求
項１記載のＨＰＶ５２の組換えＤＮＡ。 ３、ＨＰＶ５２の組換えＤＮＡが大きさ約１５〜約８０
００の塩基または塩基対からなるＨＰＶ５２ＤＮＡまた
はその断片を含んでいる請求項１記載のＨＰＶ５２の組
換えＤＮＡ。 ４、ＨＰＶ５２の組換えＤＮＡがＨＰＶ５２ＤＮＡの非
コード領域またはその断片を含んでいる請求項１記載の
ＨＰＶ５２の組換えＤＮＡ。 ５、ＨＰＶ５２の組換えＤＮＡをマーカーで標識した請
求項１記載のＨＰＶ５２の組換えＤＮＡ。 ６、本質的に純粋なＨＰＶ５２ＤＮＡまたはその断片。 ７、ＨＰＶ５２ＤＮＡまたはその断片が生物学的有機体
で生産されたものである請求項６記載の本質的に純粋な
ＨＰＶ５２ＤＮＡまたはその断片。 ８、ＨＰＶ５２ＤＮＡまたはその断片が原核生物体で生
産されたものである請求項７記載の本質的に純粋なＨＰ
Ｖ５２ＤＮＡまたはその断片。 ９、ＨＰＶ５２ＤＮＡまたはその断片が真核生物体で生
産されたものである請求項７記載の本質的に純粋なＨＰ
Ｖ５２ＤＮＡまたはその断片。 １０、ＨＰＶ５２ＤＮＡまたはその断片が酵母で生産さ
れたものである請求項９記載の本質的に純粋なＨＰＶ５
２ＤＮＡまたはその断片。 １１、ＨＰＶ５２ＤＮＡまたはその断片が培養培地中の
細胞で生産されたものである請求項９記載の本質的に純
粋なＨＰＶ５２ＤＮＡまたはその断片。 １２、ＨＰＶ５２ＤＮＡまたはその断片が多細胞生物体
の生殖細胞系細胞で生産されたものである請求項９記載
の本質的に純粋なＨＰＶ５２ＤＮＡまたはその断片。 １３、ＨＰＶ５２ＤＮＡまたはその断片が多細胞生物体
の体組織細胞で生産されたものである請求項９記載の本
質的に純粋なＨＰＶ５２ＤＮＡまたはその断片。 １４、ＨＰＶ５２ＤＮＡまたはその断片が化学反応によ
って生産されたものである請求項６記載の本質的に純粋
なＨＰＶ５２ＤＮＡまたはその断片。 １５、ＨＰＶ５２ＤＮＡまたはその断片が酵素によって
生産されたものである請求項１４記載の本質的に純粋な
ＨＰＶ５２ＤＮＡまたはその断片。 １６、ＨＰＶ５２ＤＮＡまたはその断片がＤＮＡポリメ
ラーゼによって生産されたものである請求項１５記載の
本質的に純粋なＨＰＶ５２ＤＮＡまたはその断片。 １７、ＨＰＶ５２ＤＮＡまたはその断片が大きさ約１５
〜８０００の塩基または塩基対である請求項６記載の本
質的に純粋なＨＰＶ５２ＤＮＡまたはその断片。 １８、ＨＰＶ５２ＤＮＡまたはその断片がＨＰＶ５２Ｄ
ＮＡの非コード領域から誘導された請求項１７記載の本
質的に純粋なＨＰＶ５２ＤＮＡまたはその断片。 １９、ＨＰＶ５２ＤＮＡまたはその断片をマーカーで標
識した請求項６記載の本質的に純粋なＨＰＶ５２ＤＮＡ
またはその断片。 ２０、本質的に純粋なＨＰＶ５２ＲＮＡまたはその断片
。 ２１、ＨＰＶ５２ＲＮＡまたはその断片が生物学的有機
体で生産されたものである請求項２０記載の本質的に純
粋なＨＰＶ５２ＲＮＡまたはその断片。 ２２、ＨＰＶ５２ＲＮＡまたはその断片が原核生物体で
生産されたものである請求項２１記載の本質的に純粋な
ＨＰＶ５２ＲＮＡまたはその断片。 ２３、ＨＰＶ５２ＲＮＡまたはその断片が真核生物体で
生産されたものである請求項２１記載の本質的に純粋な
ＨＰＶ５２ＲＮＡまたはその断片。 ２４、ＨＰＶ５２ＲＮＡまたはその断片が酵母で生産さ
れたものである請求項２３記載の本質的に純粋なＨＰＶ
５２ＲＮＡまたはその断片。 ２５、ＨＰＶ５２ＲＮＡまたはその断片が培養培地中の
細胞で生産されたものである請求項２３記載の本質的に
純粋なＨＰＶ５２ＲＮＡまたはその断片。 ２６、ＨＰＶ５２ＲＮＡまたはその断片が多細胞生物体
の生殖細胞系細胞で生産されたものである請求項２３記
載の本質的に純粋なＨＰＶ５２ＲＮＡまたはその断片。 ２７、ＨＰＶ５２ＲＮＡまたはその断片が多細胞生物体
の体組織細胞で生産されたものである請求項２３記載の
本質的に純粋なＨＰＶ５２ＲＮＡまたはその断片。 ２８、ＨＰＶ５２ＲＮＡまたはその断片が化学反応によ
って生産されたものである請求項２４記載の本質的に純
粋なＨＰＶ５２ＲＮＡまたはその断片。 ２９、ＨＰＶ５２ＲＮＡまたはその断片が酵素によって
生産されたものである請求項２８記載の本質的に純粋な
ＨＰＶ ＲＮＡまたはその断片。 ３０、ＨＰＶ５２ＲＮＡまたはその断片がポリメラーゼ
またはレプリカーゼによって生産されたものである請求
項２９記載の本質的に純粋なＨＰＶ ＲＮＡまたはその
断片。 ３１、ＨＰＶ５２ＲＮＡまたはその断片が大きさ約１５
〜約８０００の塩基または塩基対である請求項２０記載
の本質的に純粋なＨＰＶ５２ＲＮＡまたはその断片。 ３２、ＨＰＶ５２ＲＮＡまたはその断片の配列がＨＰＶ
５２ＲＮＡの非コード領域の配列または相補的配列であ
る請求項３１記載の本質的に純粋なＨＰＶ５２ＲＮＡま
たはその断片。 ３３、ＨＰＶ５２ＲＮＡまたはその断片をマーカーで標
識した請求項２０記載の本質的に純粋なＨＰＶ５２ＲＮ
Ａまたはその断片。 ３４、（ｉ）マーカーで標識したＨＰＶ５２ＤＮＡまた
はその断片および（ｉｉ）マーカーで標識したＨＰＶ５
２ＲＮＡまたはその断片からなる群から選ばれた構成成
分を含んでいるＨＰＶ５２ハイブリダイゼーションプロ
ーブ。 ３５、ハイブリダイゼーションプローブがＨＰＶ５２非
コード領域の配列を含んでいる請求項３４記載のＨＰＶ
５２ハイブリダイゼーションプローブ。 ３６、（ａ）（ｉ）マーカーで標識したＨＰＶ５２ＤＮ
Ａまたはその断片および（ｉｉ）マーカーで標識したＨ
ＰＶ５２ＲＮＡまたはその断片からなる群から選ばれた
構成成分、および（ｂ）マーカーで標識した少なくとも
一個の他のＨＰＶ型のＤＮＡまたはＲＮＡまたはそれら
の断片を含んでいるＨＰＶハイブリダイゼーションプロ
ーブ組成物。 ３７、ＨＰＶハイブリダイゼーションプローブ組成物が
ＨＰＶ５２非コード領域の配列を含んでいる請求項３６
記載のＨＰＶハイブリダイゼーションプローブ組成物。 ３８、（１）（ａ）（ｉ）マーカーで標識したＨＰＶ５
２ＤＮＡまたはその断片および （ｉｉ）マーカーで標識したＨＰＶ５２ ＲＮＡまたはその断片 からなる群から選ばれた構成成分と （ｂ）ＤＮＡまたはＲＮＡの未知の検体 とで非緊縮条件下にハイブリッド形成を実施し、（２）
その検体中のＨＰＶ ＤＮＡまたはＲＮＡを検出するた
めにハイブリッド形成の存在を検定することからなるＨ
ＰＶ ＤＮＡまたはＲＮＡの検出方法。 ３９、（１）（ａ）（ｉ）マーカーで標識したＨＰＶ５
２ＤＮＡまたはその断片および （ｉｉ）マーカーで標識したＨＰＶ５２ ＲＮＡまたはその断片 からなる群から選ばれた構成成分と （ｂ）ＤＮＡまたはＲＮＡの未知の検体 とで緊縮条件下にハイブリッド形成を実施し、（２）そ
の検体中のＨＰＶ５２ＤＮＡまたはＲＮＡを検出するた
めにハイブリッド形成の存在を検定することからなるＨ
ＰＶ５２ＤＮＡまたはＲＮＡの検出方法。 ４０、ハイブリッド形成が起こり得る条件下でＨＰＶセ
ンス鎖ＲＮＡをＨＰＶアンチセンス鎖ＲＮＡへ加えるこ
とからなるＨＰＶ発現を阻害する方法。 ４１、ＨＰＶがＨＰＶ５２である請求項４０記載の方法
。 ４２、ＨＰＶアンチセンス鎖ＲＮＡがＨＰＶ５２アンチ
センス鎖ＲＮＡである請求項４０記載の方法。
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