JPH0225920B2 - - Google Patents

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JPH0225920B2
JPH0225920B2 JP60234380A JP23438085A JPH0225920B2 JP H0225920 B2 JPH0225920 B2 JP H0225920B2 JP 60234380 A JP60234380 A JP 60234380A JP 23438085 A JP23438085 A JP 23438085A JP H0225920 B2 JPH0225920 B2 JP H0225920B2
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biopolymer
polymer
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Horaasu Ierukaa
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EKUSUPUROATERINGUSU TEE BEE EFU AB
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Publication date
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Description

【発明の詳細な説明】 ａ 産業上の利用分野 本発明は、生体高分子の吸着剤およびその製造
方法に関する。 ｂ 従来の技術 金属または不溶性金属化合物の表面を、単分子
の重合体層で被覆する新しい方法は、IMA−法
（Immobilized Ｍetal Ion Ａffinity）である。
この方法は相境界に金属イオンを含む金属と不溶
性無機化合物が、金属キレート基形成物と置換し
たポリマーと結合する能力に基づく。 可溶性多糖類を、金属と結合した糖−共役物
（glyco−conjugate）に変換することは可能であ
る。これらの糖−共役物は、各ポリマー分子に対
し複数の金属キレート基を含み、さらに生物学的
活性成分を結合するのに使用できる過剰のヒドロ
キシル基（またはアルデヒド官能基等）を含む。 糖−共役物を、表面に金属イオンを組み入れた
粒子、例えばマグネタイト（magnetite）、金属
イオンから派生したシリカーゲル粒子等に固定さ
せることができる。原則として分子から細胞まで
の生体物質の吸着を可能にする高浸透性の格子を
合成することが可能である。 ポリマー被覆した金属粒子と金属酸化物粒子
は、研究所、工場の両者における生物学的な巨大
分子と粒子（ビールス、細胞等）の分離、単離、
固定化に新しい道を開いた。これはクロマトグラ
フ法と比べて遜色のない技術であり、ある場合に
は、クロマトグラフ法よりも勝れており、またク
ロマトグラフ法が全然使用し得ない場合において
使用できる技術である。一般に金属核または殻に
ついては、高効率の流動床法が適用できる。粒子
が磁性を有するときは、これらの粒子は磁場にこ
れらをおくことにより溶液および非磁性の固体か
ら分離することができる。 金属表面をポリマーで被覆することのできる多
くの方法がある。通常、これはプラスチツク層で
金属表面を保護することを目的として行なわれ
る。ある事例では、代りに分子の厚さの極端に薄
い層を単に張りつけることが望ましい。例えば外
科手術において、血液をポンプで送る装置の内部
容器やチユーブ中にヘパリン（heparin）が結合
し、凝固するのを防止するために行う。 ｃ 発明が解決しようとする課題 重い内部浸透性と化学的抵抗のある核心をもつ
ゲル粒子は、生物工学において興味ある用途を有
する。クロマトグラフ処理は、非常に早い流速で
しばしば代りに流動床中で行い得る。このことは
固定相と移動相との間に偏在する物質分布がある
場合には真実である。このことは常に蛋白質、核
酸、多糖類の生物特異的吸着の場合に実用的であ
り、また前述の生体高分子の他の吸着処理にも利
用価値がある。 吸着過程は、ゲル粒子床における高流速の拡散
により支配される。従つて拡散通路を減ずること
が重要であり、その結果、この見地から層または
被覆はできるだけ薄くすべきである。床には低吸
着能力を補償するため、非常に高い比表面積を与
えねばならない。両者の必要条件は吸着をおこす
中心に結合した単分子重合体層または被覆によつ
て包囲されている極端に小さい、重い粒子で層を
構成することにより達成できる。 ｄ 課題を解決するための手段 本発明による我々の生成物は、上記問題点を解
決し、ポリマー、好ましくは水溶性ポリマーを、
固定化金属イオン、特に第１系列の遷移元素、好
ましくは鉄、コバルト、ニツケル、および銅ばか
りでなく、アルミニウム、亜鉛、カドミウム、
銀、金、プラチナ金属に属する重金属イオンを組
み入れた表面に固定化する技術に基づくものであ
る。もちろん原理的には他の重金属、例えば稀土
類金属、アルミニウム、タリウム、ジルコニウ
ム、トリウムおよびウラニウムも、本発明による
単分子重合体被覆で表面処理が可能である。結
局、主要条件は不溶性金属錯体が形成され、従つ
て酸化物および硫化物のような表面金属イオンを
もつすべての不溶性金属化合物が、本発明方法に
従つてポリマーで表面被覆され得ることである。 すなわち本発明は、その表面に強く固着された
金属イオンM1，M2を有する固体相が、共有結合
の金属キレート化置換基L1，L2，L3と特定の吸
着特性を有する共役物を付与する基Ｒとを含有す
る水溶性の多価親水性ポリマーＰで被覆されてお
り、その被覆が上記金属イオンにより行われて、
これにより、次の一般式： M1……L1――Ｒ―L2……M2……L3P で表されるように、上記固体相と上記多価親水性
ポリマー間に２つのキレート橋を形成することを
特徴とする生体高分子の吸着剤、および、その表
面に固着した金属イオンを有する固体相を、固体
相表面上において上記金属イオンをキレート化す
る少なくとも一種の基を含有する多価親水性ポリ
マーと反応させ、次いで、この多価親水性ポリマ
ーを、さらに前記共役物を吸着媒に転化する基で
置換することを特徴とする、前記生体高分子の吸
着剤の製造方法を提供するものである。 マグネタイトがイオン交換体に埋め込まれた
1950年以来、磁心を組み込んだゲル粒子の製造は
技術的に公知である。マグネタイトを含むポリマ
ー粒子もまたフイルターケーキを通る流れを増加
するために使用された。蛋白質の固定用の最初の
磁性ゲル粒子は、1973年に記載され、それ以来、
多くの論説や調査がこの問題に関して刊行され
た。我々による記載の発明もまた同じ目的のため
に使用されるものであることは明白である。 実施例１は、本発明が大腸菌細胞（Coli−
cells）からノイラミン酸の特殊パイラエ（pilae）
を如何にして精製できるかを示す。パイラエは
106Dalton程度の分子量を有する極めて長く、分
子量分布のせまい分子であるので、クロマトグラ
フ・ゲル物質は精製の目的には適していない。本
発明により形成された粒子は容易に貫通するポリ
マー層を提供し、このものは大小の分子両方につ
いて非常に高い吸着能力を達成することができ
る。 従来利用されたこれらの製法は、ゲル形成、ポ
リマー、例えばアガロースまたは適当なモノマ
ー、例えばアクロレインの重合に磁心を含有させ
ることによるものであり、これらの製法において
は、磁性粒子を懸濁させ、次に生成したゲル組成
物を粉砕せしめるものである。従つてこのような
方法によつて与えられた厚さの均一なゲル層を得
ることは、不可能とは言えないが困難である。し
かし、アクロレインの重合は、本問題に対して、
特にポリマーが“自動活性的”なものであり、直
接に蛋白質を結合するのに使用ができるので、非
常にすつきりした解決を与えることが認められ
る。一方生じたポリマーは完全に疎水性であり、
なかんずく限定された透過性を有する。 我々は非常に広い使用を得ることを期待し得る
親水性ポリマーで、金属面を被覆するための新技
術を促進する。分離と抽出を目的とするこの“親
水化技術”の我々の出願においては、金属表面を
非交差結合（non−cross−linked）ポリマーで被
覆する。このことは実際的には全ポリマーがすべ
ての分子と粒子、例えばウイルスや細胞にも利用
できることを意味する。この方法では、吸着に適
し、心粒子の表面積に関して非常に大きい吸着面
積を示すマクロ環境（macro−environment）が
得られる。この方法は、金属（または金属化合
物）の表面が、実際すべての卑金属のような金属
イオンで被覆されることが想像される。親水化し
た粒子は、金属または金属化合物の適切な選択に
より、重くまた磁性のあるようになし得る。第１
層または被覆は粒子を重合溶流中への“浸漬”す
ることにより形成され、その後、ポリマーを交差
結合することができる。より厚い被覆も得られる
ことも事実であるが、なお非常に高い透過性とし
“すりきれたような（frayed）”外表面を提供する
ことができる。浸漬はまた生物学的に興味ある細
胞や分子を吸着するための磁性粒子をつくるた
め、従来使用された方法よりもさらに均一なポリ
マー層を提供するであろう。さらに、異るポリマ
ーから層または被覆をつくることのできる利点が
ある。 本発明による生成物は、固体相の表面金属イオ
ン（以下Ｍと呼ぶ）とＭに強力に結合している基
とが反応することにより得ることができる。Ｌは
適切には金属イオンのキレート化物であるが、硫
化物形成硫黄、すなわちチオール基である。もし
Ｌがポリマーに結合しているときは、直ちに本発
明によつて表面被覆が得られる。従つて本発明の
この態様による生成物は、記号化してＭ−Ｌ−Ｐ
で示すことができる。 本発明のもう一つの態様によれば、ポリマーＰ
は他の方法でＭに結合される。すなわちＬとＰと
の間にある−Ｒ−Ｙ−を縮合または橋かけされ
る。この場合、物質Ｌ−Ｒ−Ｘは重合誘導体Ｚ−
Ｐと反応するようになつており、置換基ＸとＺは
還元に続いて、選択的付加または縮合によつて架
橋成分Ｙを形成する。 このような架橋生成反応は、以下に示される。 ２−アミノメチル−８−ヒドロキシキノリン においては、Ｌが であり、ＸはNH2であるＸ−Ｒ−Ｘ型物質の一
例であり、Ｒは残りの分子成分を表わす。Ｍとの
反応はキレート性の吸着錯体（被吸着物）をつく
り、このものは順番に反応性ポリマー、例えばア
ルデヒド澱粉、Ｚ＝−CHOをもつZPと反応する
ことができる。もし反応生成物が、例えば水素化
ボロンナトリウムで還元されると、澱粉誘導体と
８−ヒドロキシ・キノリンとの安定した結合物が
得られ、このものは順番にしつかりと金属に結合
する。 この反応は、またもう一つ続けて使用して、Ｉ
によつて生成物をつくることができる。もし
LRXが代りに８−ヒドロキシキノリン−２−ア
ルデヒドに基く場合には、ポリマーはＺ＝NH2、
例えばアミン・アルデヒド澱粉を含む。生成物Ｉ
は還元に続く金属イオンへのアルデヒドの吸着の
結果として得られる。 従つて生成物を合成したとき、ＸとＺは２つの
反応物質LRXとＺ−Ｐとの間で位置を変更し得
るようになつていることがわかるであろう。分子
鎖中の原子の方向はこのときに逆になるであろ
う。これは次の実施例から明らかである。 LPXは一般式 であり、Ｚ−Ｐは反応性ヒドロキシル基の存在を
示すHOCH−CH2（アガロース）として記号で示
されたカルボキシ−メチール化アガロースであ
る。次に生成物は次の記号式で得られる。 もし我々が、代りに、アミノアガロースと、β
−ジカルボキシ・メチル・プロピオン酸から出発
するときは、次の生成物が得られる。 結合Ｙは一つの場合は、【式】であ り、他の場合には、逆行型（retro−grade）連鎖
である【式】である。 本発明による生成物をつくるための２つの特に
有用な反応に対し、特に記載しなければならな
い。すなわち、オキシランおよびジビニル・スル
フオンと、Ｚ−ヒドロキシル−，アミノ基
（NH2，NHR、但しＲはアルキルまたはアリー
ル基である）、チオール基との各反応である。次
に、LRXはZPのＺがOH，NH2，NHRまたは−
SHであるとき、それぞれ と Ｌ−Ｒ−SO2−CH＝CH2 として記号で示すことができる。もしＸがOH，
NH2または−SHであるならば、ポリマーへの結
合は、ポリマーがオキシランまたはビニル−スル
ホニル基を含むときには効果的である。 純粋な化学物質としてのLRXの製造は複雑と
なる。この場合、本発明による生成物製造におい
てLRXに対する条件をみたす各成分の混合物を
使用することができる。実施例としては、我々は
テトラエチレン・ペンタミンから出発することが
できる。この物質は銅（）と強固な錯体を形成
する。このものは過剰のNH2基を含み、従つて
Ｍが銅であるときはLRXに対する条件を満すこ
とができる。Fe（）で形成される錯体は非常に
弱いので、鉄に対する条件はみたされない。この
場合、テトラエチレン・ペンタミンは、部分的に
カルボキシ−メチル化されることができる。これ
によつて別個に置換されたポリアミン、 例えば、 および の混合物を得ることができる。 誘導体の多くは、Fe（）その他の重金属イオ
ンと吸着錯体を形成することができ、同時に、
ZPに結合するためのＸとして、あるいは例えば
オキシランまたはビニル・スルホニール基を組入
れているＺ基との活性化のために、Ｘとして機能
することのできる基（−NH−またはNH2）をも
つ。このような場合の実際の適用は、以下の実施
例２に例示する。 純粋な形で反応物質LPXをつくることは難し
いかもしれない。しかし純粋な反応物質は、本発
明による生成物の合成には必要としない。例え
ば、もしテトラエチレン・ペンタミンとカルボキ
シ・メチレートから出発するならば、このアミン
はアルカリ液中の不十分なモノハロ酢酸（例えば
酢酸臭素）とともに誘導体の複雑な混合物を得
る。これについてはとに２つの実施例を例示
する。 本発明のさらに別の変形例を記載する。すなわ
ちこの場合Ｙもまた金属錯体である。次に実施例
を示すが、この場合LRXは である。但しＭはFeFe3+で示されるマグネタイ
トである。 生成物は次の式で示すことができる。 本発明による生成物の製造は、一般に次のよう
に記載することができる。 M1……L1――Ｒ――L2……M2……L3P 但しM1とM2とは同じかまたは異る金属イオン
であり、L1，L2とL3は同じかまたは異る金属結
合基である。 ｅ 実施例 実施例 １ 磁性粒子（直径約0.4μｍ）1.5ｇを0.5ｇのイミ
ノ・ジアセテートデキストラン（IDA−
dextran）で抱卵し、0.5MのNaHCO3−Na2CO3
PH11緩衝液中で一晩振盪した。ここでIDA−デキ
ストランは金属粒子に錯体結合された。上記緩衝
液につづく蒸留水による洗浄に続いて、デキスト
ランを緩衝液に溶解した１％のジビニール・スル
ホン（DVS）で活性化した。１時間40分後、過
剰のDVSを緩衝液で洗い流した。次に粒子を10
％のデキストランT500を含めて上記に従つて10
mlの緩衝液中でスラリーとし、室温で一晩放置し
た。次いで、さらに多くのデキストランを粒子の
表面に結合させた。この処理は粒子洗浄後もくり
返したが、この回は５％のDVSを用いた。最後
に粒子を２％DVSで活性化し、２等分した。一
方の分は、1.5mlの緩衝液（PH11）中で0.15ｇの
コロミン酸（colominic acid）と結合した。他の
部分は1.5mlの重炭酸塩のPH9.0緩衝液中で0.15ｇ
のトランスフエリンと結合させた。 トランスフエリン置換ゲルからの粒子１グラム
当たり、Ｅ−大腸菌細胞（E.Coli）からK99パイ
ラエ1.5mgの抽出が、そしてコロミン酸粒子から
は0.65mg／ｇの抽出が可能であつた。コロミン酸
粒子に関しては、得られた結果はコロミン置換
Sephadex G10で達成したものよりもさらに約20
倍も有望であつた。 マグネタイトが約３m2／ｇの比表面積をもつゲ
ルで被覆されたマグネタイトの製造について、理
論的最大吸着容量を算定してみると、容量をさら
に約10倍増加できることを示した。しかし、得ら
れた結果は既に非常に満足なものである。 実施例２ 寒天ゲルで被覆したマグネタイト粒子 原理：金属イオン親和性に基づく新技術による
アガロースの固定化 １ キレータ（chelater）＋２官能性活性剤→１
官能性活性化キレーターの誘導体 ２ ＋マグネタイト→粒子面を被覆した１官能性
活性化キレーター誘導体→“活性マグネタイ
ト” ３ ＋ポリマー→ポリマーで被覆されたマグネタ
イト（＝最終生成物） 通常の手順TEPAの部分的カルボキシ−メチル
化 ６mlのTEPA（テトラエチレンペンタミン）を
PH11，NaOH＋100ml、1MのNa2CO3／NaHCO3
で中和した28ｇの酢酸臭素に添加し、振盪しなが
ら室温で２時間反応させた。 粉末マグネタイト50ｇを添加し、２時間懸濁液
を振盪し、デカンテーシヨンによりPHが中性にな
るまで蒸留水で洗浄した。生成物を最後に0.1M
のNa2CO3で洗浄した。 マグネタイト（反応フラスコ中で）＋0.1Mの
Na2CO3＋５mlのジビニールスルフオン100mlを、
２時間振盪した。 蒸留水で洗浄（デカンテーシヨンによる）し、
EDA−アガール（1.25ｇの乾燥ゲルに相応する）
を添加し、振盪しながら一晩放置した。PHを
Na2CO3で9.8に調整した。 生成物を蒸留水中で中和PHになるまで洗浄し
た。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ その表面に強く固着された金属イオンM1，
    M2を有する固体相が、共有結合の金属キレート
    化置換基L1，L2，L3と特定の吸着特性を有する
    共役物を付与する基Ｒとを含有する水溶性の多価
    親水性ポリマーＰで被覆されており、その被覆が
    上記金属イオンにより行われて、これにより、一
    般式： M1……L1――Ｒ――L2……M2……L3P で表されるように、上記固体相と上記多価親水性
    ポリマー間に２つのキレート橋を形成することを
    特徴とする生体高分子の吸着剤。 ２ 固体相が粒子形であることを特徴とする特許
    請求の範囲第１項に記載の生体高分子の吸着剤。 ３ 上記多価ポリマーＰが、組成Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｐ
    を有し、〔Ｘは金属キレート形成置換物またはＳ
    を表し、Ｙが次の基、 −NH−COまたはOCO −NH2−CH2または−CH2−NH2 −NH−CH2−CHOHまたは−CHOH−CH2
    −NH− −NH−CH2−CH2−SO2または−SO2−CH2
    −CH2−NH− −Ｓ−CH2−CH2−SO2−または−SO2−CH2
    −CH2−Ｓ− 金属イオン−ＺまたはＺ−金属イオンの一つで
    ある、但しＺは金属キレート基、または硫黄原子
    Ｓであり、そしてＲとＰの各々あるいは両者がポ
    リマーである〕ことを特徴とする特許請求の範囲
    第１項に記載の生体高分子の吸着剤。 ４ 上記ポリマーが多価アルコール、ポリアミ
    ン、ポリアミド、ポリエーテルまたはポリエステ
    ルである特許請求の範囲第３項記載の生体高分子
    の吸着剤。 ５ 固体相が磁性物質よりなることを特徴とする
    特許請求の範囲第１項または第２項に記載の生体
    高分子の吸着剤。 ６ 多価アルコールＲまたはＰが多糖類であるこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第３項に記載の生
    体高分子の吸着剤。 ７ 上記多糖類がデキストリンまたはアガロース
    である特許請求の範囲第６項に記載の生体高分子
    の吸着剤。 ８ ポリアミドＲまたはＰがポリアクリルアミド
    であることを特徴とする特許請求の範囲第３項に
    記載の生体高分子の吸着剤。 ９ ポリアミドＲまたはＰが蛋白質またはペプチ
    ドであることを特徴とする特許請求の範囲第３項
    に記載の生体高分子の吸着剤。 １０ ポリエステルＲまたはＰがオリゴヌクチオ
    チドまたはポリヌクレオチドであることを特徴と
    する特許請求の範囲第３項に記載の生体高分子の
    吸着剤。 １１ ＲまたはＰが粒子表面中または分子集合中
    に組み入れられていることを特徴とする特許請求
    の範囲第３項に記載の生体高分子の吸着剤。 １２ 上記粒子がウイルスまたは細胞である特許
    請求の範囲第１１項に記載の生体高分子の吸着
    剤。 １３ その表面に固着した金属イオンを有する固
    体相を、固体相表面上において上記金属イオンを
    キレート化する少なくとも一種の基を含有する多
    価親水性ポリマーと反応させ、次いで、この多価
    親水性ポリマーを、さらに前記共役物を吸着媒に
    転化する基で置換することを特徴とする、その表
    面に強く固着された金属イオンM1，M2を有する
    固体相が、共有結合の金属キレート化置換基L1，
    L2，L3と特定の吸着特性を有する共役物を付与
    する基Ｒとを含有する水溶性の多価親水性ポリマ
    ーＰで被覆されており、その被覆が上記金属イオ
    ンにより行われて、これにより、次の一般式： M1……L1――Ｒ――L2……M2……L3P で表されるように、上記固体相と上記多価親水性
    ポリマー間に２つのキレート橋を形成しているこ
    とを特徴とする生体高分子の吸着剤の製造方法。 １４ 上記多価親水性ポリマーが多価アルコー
    ル、ポリアミンまたはポリアミドである特許請求
    の範囲第１３項に記載の方法。 １５ 多価アルコールが多糖類であることを特徴
    とする特許請求の範囲第１４項に記載の方法。 １６ 上記多糖類がアガロースのようなポリガラ
    クタンである特許請求の範囲第１５項に記載の方
    法。 １７ ポリアミドが蛋白質またはペプチドである
    ことを特徴とする特許請求の範囲第１４項に記載
    の方法。 １８ ポリアミドがポリアクリルアミドであるこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第１４項に記載の
    方法。 １９ 固体相が粒子の形であつて１mm以下の直径
    をもつ粒子からなることを特徴とする特許請求の
    範囲第１３〜１８項のいずれか１つに記載の方
    法。 ２０ 粒子が磁性を有することを特徴とする特許
    請求の範囲第１９項に記載の方法。 ２１ 上記粒子がマグネタイトである特許請求の
    範囲第２０項に記載の方法。 ２２ 上記水に可溶のポリマーが、ポリエチレン
    グリコール、デキストラン、あるいは他の多糖類
    である特許請求の範囲第２２項に記載の方法。 ２３ 共役物が、ビニールスルフオン基またはエ
    キポキシドを含むことを特徴とする特許請求の範
    囲第１３項に記載の方法。 ２４ 共役物が、アミノチオールまたはヒドロキ
    シル基を含むことを特徴とする特許請求の範囲第
    １３項に記載の方法。 ２５ 金属イオンをキレート化する基が、カルボ
    キシ−メチル化アミンであることを特徴とする特
    許請求の範囲第１３項に記載の方法。
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