CZ299349B6

CZ299349B6 - Magnetické cástice pokryté vybranými polysacharidy

Info

Publication number: CZ299349B6
Application number: CZ20040391A
Authority: CZ
Inventors: Beneš@Milan; Lenfeld@Jirí; Španová@Alena; Rittich@Bohuslav; Bílková@Zuzana
Original assignee: Ústav Makromolekulární Chemie Akademie Ved Ceské Republiky; Masarykova univerzita v Brne, Prírodovedecká fakulta; Univerzita Pardubice, Fakulta chemicko-technologická
Priority date: 2004-03-18
Filing date: 2004-03-18
Publication date: 2008-06-25
Also published as: CZ2004391A3

Abstract

Predmetem vynálezu jsou magnetické cástice tvorené oxidy železa, zejména magnetitem (Fe.sub.3.n.O.sub.4.n.), maghemitem (.gama. modifikace Fe.sub.2.n.O.sub.3.n.) nebo smesnými oxidy železa, zejména CoO.Fe.sub.2.n.O.sub.3.n., CuO.Fe.sub.2.n.O.sub.3.n., MnO.Fe.sub.2.n.O.sub.3.n., pokryté vrstvou prírodních polysacharidu nebo jejich derivátu obsahujících podél retezce postranní funkcní skupiny, které zároven podminují rozpustnost polysacharidu v reakcním systému a soucasne interagují s povrchem oxidu železa. Pro modifikaci je použit polysacharid,obsahující funkcní skupinu -O-CS-S, tedy xantáty celulózy, dextranu a amylózy, nebo funkcní skupinu-COO.sup.-.n., tedy látky ze skupiny prírodních polysacharidu, a to kyselinu alginovou, pektinovou,hyaluronovou, heparin nebo polysacharidy s karboxylovými skupinami zavedenými modifikací, zahrnující karboxymethylcelulózu a karboxymethyldextran.

Description

Předmětem vynálezu jsou magnetické částice tvořené oxidy železa, zejména magnetitem (Fe₃O₄), maghemitem (γ modifikace Fe₂O₃) nebo směsnými oxidy železa, zejména CoO.Fe₂O₃, Cu0.Fe₂O₃, MnO.Fe₂O₃, pokryté vrstvou přírodních polysacharidů nebo jejich derivátů obsahujících podél řetězce postranní funkční skupiny, které zároveň podmiňují rozpustnost polysacharidů v reakčním systému a současně interagují s povrchem oxidů železa. Pro modifikaci je použit polysacharid, obsahující funkční skupinu -O-CS-S, tedy xantáty celulózy, dextranu a amylózy, nebo funkční skupinu -COO’, tedy látky ze skupiny přírodních polysacharidů, a to kyselinu alginovou, pektinovou, hyaluronovou, heparin nebo polysacharidy s karboxylovými skupinami zavedenými modifikací, zahrnující karboxymethylcelulózu a karboxymethyldextran.

Magnetické částice pokryté vybranými polysacharidy

Oblast techniky

Vynález se týká nových magnetických částic tvořených magnetickým oxidem pokrytým vrstvou vybraných přírodních polysacharidů nebo jejich derivátů, které obsahují skupiny interagující s povrchem těchto oxidů.

Dosavadní stav techniky

Magnetické mikro a nano částice mají dnes rozsáhlé použití pro vědecké i technické účely. Zahrnují dosti odlišné oblasti počínaje tradičním použitím v zařízeních mechanických (těsnění, ložiska, tlumiče), elektromechanických (reproduktory, krokové motory) až po modernější sofistikované biologické a lékařské aplikace (separace a manipulace s biopolymery, buňkami a mikroorganizmy a jejich značení, zobrazování jadernou magnetickou rezonancí - magnetic resonance imaging - MRI) a další diagnostické postupy, dávkování či směrování léčiv a genů (drug and gen delivery and targeting), nebo léčení hyperthermií atd. Podle chemického složení patří magnetické materiály většinou mezi kovy (hlavně železo, a další) nebo oxidy těchto kovů (hlavně oxidy železa). Magnetické oxidy železa zahrnují magnetit (Fe₃O₄), maghemit (γ modifikace Fe₂O₃) nebo ferrity obecného vzorce (MeO, Fe₂O₃, kde Me může být Mn, Mg, Ni, Zn, Cu, Co, V, Cd, Cr, Ba, Sr, Mg, Ca, Pt).

Je popsána velká řada postupů na přípravu magnetických oxidů s velikostí částic v řádu nanometrů a jejich modifikací pro konkrétní použití. Klasický postup - dlouhodobé mletí oxidů v přítomnosti stabilizátoru - ztratil dnes již na významu. Převládá tzv. chemická cesta, kde se roztokem alkalického činidla sráží roztok směsi solí Fe(IIl) a Fe(II) (pro magnetit) nebo Fe(Ill) a Me(II) (pro ferrity), kde Me(II) má výše uvedený význam. Pro optimální magnetické vlastnosti musí být soli Fe(III) a Fe(II), resp. Me(ll) v molárním poměru blízkém 2:1. Průběh srážení (zejména velikosti částic) a magnetické vlastnosti ovlivňuje dále velká řada parametrů. K nim patří druh protiiontu, výchozí koncentrace solí, typ báze pro srážení (většinou amoniak nebo alkalický hydroxid), její množství, teplota při srážení a dalším zpracování, atd.. V neposlední řadě také přítomnost dalších látek při srážení, zejména látek komplexujících nebo chelatujících kationty přítomné v systému. Maghemit se připravuje vhodnou oxidací magnetitu, protože přímým srážením Fe(lll) soli alkalickým činidlem vzniká nemagnetická modifikace oxidu železitého.

Malé částice (řádově v nanometrech) je třeba stabilizovat, aby tvořily stabilní koloidní roztoky a v podmínkách použití neagregovaly. Je popsána řada způsobů stabilizace působením nízko nebo vysokomolekulárních látek. Relativně koloidně stabilní „kationtový“ neboli „kyselý“ magnetit vzniká působením kyseliny chloristé nebo dusičné. „Aniontový“ neboli „zásaditý“ vzniká působením tetramethylamonium hydroxidu.

Pro nepolární organické prostředí se stabilizuje koloidní systém působením vyšších alifatických karboxylových kyselin. Zlepšení stability koloidních roztoků spojené většinou se zmenšením veliDkosti částic se dosahuje také účinkem řady nízkomolekulárních látek, jako jsou kyselina citrónová, dimerkaptojantarová, ethylendiamintetraoctová (EDTA), fosfáty, difosfáty, fosfonáty.

Pro medicínská a biologická použití je potřeba magnetické částice na povrchu upravit nebo modifikovat ke zlepšení užitných vlastností. Jedná se zejména o zabránění nespecifických sorpcí, minimalizaci agregace částic nebo zavedení funkčních skupin. Pro klinické použití je nutné modifikací povrchu zabránit kontaktu případných toxických imunogenních povrchů nosiče s buňkami organismu. Reaktivní funkční skupiny na nosiči je možné využít ke kovalentní imobilizaci např. farmakologický (např. cytostatika, imunosupresiva, chemoterapeutika) nebo katalyticky aktivních látek (např. enzymy ze skupiny hydroláz, proteáz, oxidáz a pod.). Takto modifi- 1 CZ 299349 B6 kované nosiče lze cíleně směrovat do určeného místa v organismu - tzv. targeting drug delivery systém.

Enzymy díky své vysoké aktivitě a specifitě spolu s dalšími biologicky aktivními látkami, jako jsou např. protilátky definované specifity, se podílejí významně na rozvoji vysoce perspektivní oblasti diagnostiky a terapie. Při léčbě některých metabolických, nádorových nebo autoimunitních chorob lze s výhodou použít bioaktivní nosiče, kde již pouhým zvýšením molekulové hmotnosti komplexu se výrazně zvyšuje odolnost proti buněčným lysozomálním enzymům a endogenním proteinázám. Tento depotní efekt tak výrazně prodlužuje efekt terapeutický. Nároky na konečné množství podané látky se tak nepřímo snižují. Cíleným zaváděním nosiče lze současně minimalizovat vedlejší pyrogenní, toxické a antigenní účinky.

Imobilizací biologicky aktivních látek zasahujících do rozvoje imunitní odpovědi lze úspěšně potlačit imunitní reakci a snižovat lokální nebo systémové alergické reakce. Bioaktivní proteiny nebo peptidy s malou molekulovou hmotností (kofaktory, inhibitory, modulátory mnoha enzymových reakci a metabolických cyklů) jsou za normálních okolností velice rychle odbourávány a vylučovány z organismu. Jejich imobilizací na nosiče a cíleným transportem do místa zásahu se výrazně prodlužuje jejich retenční čas a účinnost. Takové bioaktivní komplexy lze použít pro léčbu chorob, kde patogeneze vzniku choroby je spjata s účinky proteolytických chorob. Jsou to např. traumatická poškození tkání, septické stavy, alergické reakce, poruchy spjaté se srážením krve a tvorbou fibrinu.

Cíleným magnetickým transportem bioaktivních látek do místa, kde je terapeutický efekt nejžádanější, lze minimalizovat vedlejší nežádoucí účinky. Nadbytečnou saturací zdravých buněk terapeutikem dochází za normálních okolností ke zbytečnému zatěžování organismu. Transport bioaktivních látek do místa zásahu lze dosáhnout několika způsoby: a) přímou implantací látek do místa zásahu; b) aplikací terapeutika per os nebo intravenózně nebo intramuskulámě a pomocí vnějších sil (např. magnetického pole) látku zakoncentrovat v místě, kde má působit; c) aplikací terapeutika per os nebo intravenózně nebo intramuskulámě a zajistit aktivací léčebný efekt tera30 peutika až v místě s patologicky změněným prostředím; d) transportem bioaktivních látek do místa zásahu pomocí nosiče s kovalentně vázaným afinitním ligandem.

Nosiče s kovalentně vázanými afinitními ligandy lze s úspěchem použít i pro odstraňování patologicky změněných látek z krevního oběhu a dalších tělních tekutin. Jako příklad je nutné uvést účinné odstraňování specifických autoimunitních protilátek ze séra pacientů se závažnými druhy autoimunitních chorob, které jsou provázené vysokými titry patologických protilátek, které vyvolávají závažné zánětlivé změny a ztrátu funkce napadeného orgánu, tkáně.

Nosiče, kde je kovalentně vázaným ligandem enzym (IMERs), antigen, specifická protilátka (IMARs), jsou také široce používány v oboru diagnostiky, v oblasti výzkumu v oboru genomiky a proteomiky při studiu struktury a konformace mnoha fyziologických a patologických forem proteinů (např. technika peptidového mapování a sekvenování, techniky „peptide excision a peptide extraction“ při vyhledávání imunogenních a protektivních epitopů pro vývoj nové generace vakcín a pod.). Afinitní reaktory jsou také vhodným nástrojem pro specifickou izolaci, purifikaci a zakoncentrování látek, vyskytujících se v biologickém materiálu v extrémně nízkých koncentracích, při specifické separaci a izolaci patologicky změněných proteinů. Specifické IMERs a IMARs reaktory lze použít jako integrovanou součást mikroanalyzátorů, vyrobených mikrofluidní technologií.

Povrchová modifikace magnetických a dalších oxidů se provádí v zásadě dvojím způsobem. Buď je činidlo přítomné již při srážení oxidu, nebo se jím modifikuje až hotová sraženina oxidu získaného srážením nebo jinak. K tomu, aby byla modifikace povrchu pro podmínky použití dostatečně pevná, je potřeba, aby činidla obsahovala funkční skupiny, které s povrchem oxidu interagují chemickou nebo fyzikální vazbou. Vyšší stability povrchové vrstvy může být dosaženo také zesí55 ťováním původně málo stabilní polymemí vrstvy nebo dalšími fyzikálními interakcemi řetězců

-2CZ 299349 B6 nízkomolekulámích činidel. Z čistě formálního hlediska mohou být modifikační činidla nízkomolekulámí nebo vysokomolekulámí. V zásadě platí, že interagující funkční skupina nízkomolekulámích činidel, zvláště pokud obsahují jen jednu, musí tvořit s povrchem oxidu pevnou vazbu.

U činidel výšemolekulámích a polymerů, které obsahují slaběji interagující skupiny, se dosahuje stabilního pokrytí násobným účinkem slabé interakce.

Pro biologické a medicínské aplikace se pro pokrytí magnetických oxidů dosud nejčastěji používají hydrofilní, přírodní nebo syntetické polymery. Z přírodních polymerů to jsou hlavně biodegradovatelné polysacharidy (např. dextran, agaróza, celulóza, škrob atd.) a jejich deriváty, ale také monomemí, případně oligomemí polypeptidy, proteiny (např. albumin) a nukleové kyseliny s nízkou imunogenicitou. Ze syntetických polymerů pak polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon, » polyHEMA a další. Předností polysacharidů jsou vesměs jen nepatrné nespecifické interakce s biopolymery. Z polysacharidů má pro pokrytí dominantní postavení dextran. Materiály tohoto t typu se připravují koprecipitací příslušných solí Fe(III) a Me(II) v přítomnosti relativně vysoké koncentrace dextranu, respektive jeho derivátu (např. karboxyalkylovaným dextranem). Na této bázi je k dispozici řada komerčních produktů. Interakce ve vodě rozpustných polysacharidů bez směrujících skupin na oxidy je však poměrně slabá. Pokud se polysacharid po počátečním pokrytí nefixuje (např. síťováním nebo samovolně pomocí vodíkových vazeb), dochází při použití k postupnému uvolňování dextranu a odkrývání povrchu oxidu.

Magnetická celulóza větší než 10 pm byla připravena regenerací celulózy z částic vytvořených dispergováním suspenze magnetického oxidu v roztoku vhodného derivátu celulózy (např. xantátu, acetátu) v rozpouštědle, které se nemísí s disperzním prostředím (vodný roztok aniontového polyelektrolytu).

K. výraznému posílení vazby polysacharidů na magnetické oxidy dochází zavedením směrujících skupin do jejich molekuly. Tak je tomu např. u dextranu s chelatujícími iminodioctovými nebo karboxyalkylovými skupinami podél řetězce. Slabší interakce je u dextranu s koncovými karboxylovými skupinami. Jsou popsány také magnetické oxidy, pokryté dalšími polysacharidy: agarózou, chitosanem.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou magnetické oxidy železa pokryté vrstvou přírodních polysacharidů nebo jejich vybraných derivátů. Použité magnetické oxidy patří do skupiny oxidů železa tvořené magnetitem (Fe₃O₄) nebo maghemitem (γ modifikace Fe₂O₃) nebo do skupiny směsných oxidů železa (ferritů) tvořené MeO.Fe₂O₃, kde Me je Co, Cu, Mn. Vybrané přírodní polysacharidy nebo jejich deriváty obsahují na řetězci funkční skupiny, které interagují s povrchem magnetických oxidů železa a opakovanou vazbou tak způsobují pevné navázání na povrchu oxidu. Jako směrující skupiny jsou použity xantát (-O-CS-S”) a karboxyl (-CO-O“). Polysacharidy s dithiokarbonátovou skupinou se získají působením sirouhlíku na polysacharidy v přítomnosti hydroxidu alkalického kovu. Polysacharidem je v této souvislosti celulóza nebo dextran. Polysacharid s postranními karboxylovými skupinami podél řetězce je - na rozdíl od dosud popsaných polysacharidů s koncovými karboxylovými skupinami - kyselina alginová, pektinová, hyaluronová, heparin, karboxymethyl celulóza a karboxymethyl dextran.

Násobná interakce směrujících skupin polysacharidů s volnými vazebnými místy iontů kovu v krystalové mřížce oxidů způsobuje pokrytí povrchu oxidu relativně stálou vrstvou polysacharidu. Při pokrývání pomocí xantátů polysacharidů je potřeba po oddělení podílu, který s oxidem nereagoval, regenerovat polysacharid okyselením nebo zahřátím. Pokud je v tomto případě samotný polysacharid ve vodě rozpustný, je výhodné fixovat polysacharid ještě před regenerací síťováním.

Nosiče neuvolňují látky inhibující řetězovou polymerázovou reakci (polymerase chain reaction PCR), případně samy v PCR neinterferují.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Ke 93,8 ml vodného roztoku, který obsahuje 1,319 g FeCl₃ a 0,515 g FeCl₂, vyhřátého na 70 °C, se přidá v temperovaném reaktoru za intenzivního míchání turbinovým míchadlem najednou roztok 0,095 g kyseliny alginové v 6,17 ml 25 % vodného roztoku amoniaku. Teplota se během 15 min zvýší na 90 °C a při této teplotě se míchá 1 hodinu. Po ochlazení na teplotu místnosti se suspenze převede do válcové nádoby, ve které se sraženina oddělí pomocí silného permanentního magnetu. Pro odstranění nízkomolekulámích solí se sraženina promyje pětkrát 100 ml vody (rozmíchání, magnetické oddělení a odlití roztoku). Střední velikost částic je 13 pm. Vysušený analytický vzorek obsahuje 1,48 % C. To po přepočtení odpovídá 7,1 % kyseliny alginové v sušině.

Příklad 2

Ke 88,8 ml vodného roztoku, který obsahuje 1,319 g FeCl₃ a 0,528 g CoCl₂, vyhřátému na 70 °C, se přidá v temperovaném reaktoru za intenzivního míchání turbinovým míchadlem najednou roztok 0,095 g kyseliny alginové v 11 ml 6 mol/l NaOH. Teplota se během 15 min zvýší na 90 °C a při této teplotě se míchá 1 hodinu. Po ochlazení na teplotu místnosti se ze suspenze ve válcové nádobě oddělí sraženina pomocí silného permanentního magnetu a pětkrát promyje 100 ml vody. Střední velikost částic je 2 pm. Vysušený analytický vzorek obsahuje 2,31 % C. To po přepočtení odpovídá 5,6 % kyseliny alginové v sušině.

Příklad 3

Ke 88,8 ml vodného roztoku, který obsahuje 1,319 g FeCl₃ a 0,547 g CoCl₂, vyhřátému na 70 °C, se přidá v temperovaném reaktoru za intenzivního míchání turbinovým míchadlem najednou roztok 0,095 g kyseliny alginové v 11 ml 6 mol/l NaOH. Teplota se během 15 min zvýší na 90 °C a při této teplotě se míchá 1 hodinu. Po ochlazení na teplotu místnosti se suspenze převede do válcové nádoby, ve které se sraženina oddělí pomocí silného permanentního magnetu a pětkrát promyje 100 ml vody. Vysušený analytický vzorek obsahuje 1,15 % C. To po přepočtení odpovídá 3,3 % kyseliny alginové v sušině.

Příklad 4

Ke 88,8 ml vodného roztoku, který obsahuje 1,319 g FeCl₃ a 0,703 g Mg(CH₃COO)₂, vyhřátého na 70 °C, se přidá v temperovaném reaktoru za intenzivního míchání turbinovým míchadlem najednou roztok 0,190 g kyseliny alginové v 11 ml 6 mol/l NaOH. Teplota se během 15 min zvýší na 90 °C a při této teplotě se míchá 1 hodinu. Po ochlazení na teplotu místnosti se suspenze převede do válcové nádoby, ve které se sraženina oddělí pomocí silného permanentního magnetu a pětkrát promyje 100 ml vody. Vysušený analytický vzorek obsahuje 1,0 % C. To po přepočtení odpovídá 2,9 % kyseliny alginové v sušině.

-4CZ 299349 B6

Příklad 5

Ke 93,8 ml vodného roztoku, který obsahuje 1,319 g FeCI₃ a 0,515 g FeCl?, vyhřátého na 70 °C se přidá v temperovaném reaktoru za intenzivního míchání turbinovým míchadlem najednou 6,17 ml 25 % vodného roztoku amoniaku. Teplota se během 15 min zvýší na 90 °C a při této teplotě se míchá 1 hodinu. Po ochlazení na teplotu místnosti se suspenze nechá usadit a odtáhne se čirá vrchní vrstva a promyje dvakrát 80 ml vody. Sraženina se znovu rozmíchá v 80 ml vody, zahřeje se na 80 °C a za míchání se přidá roztok 0,500 g kyseliny alginové v 10 ml 0,4 mol/l amoniaku. Pak se směs míchá 1 h při 90 °C. Po ochlazení na teplotu místnosti se ze suspenze ve válcové nádobě oddělí sraženina pomocí silného permanentního magnetu a pětkrát promyje 100 ml vody. Vysušený analytický vzorek obsahuje 2,55 % C. To po přepočtení odpovídá 6,2 % kyseliny alginové v sušině.

Příklad 6

Ke 93,8 ml vodného roztoku, který obsahuje 1,319 g FeCl₃ a 0,528 g CoCl₂, vyhřátého na 70 °C, se přidá v temperovaném reaktoru za intenzivního míchání turbinovým míchadlem najednou 6,17 ml 25 % vodného roztoku amoniaku. Teplota se během 15 min zvýší na 90 °C a při této teplotě se míchá 1 hodinu. Po ochlazení na teplotu místnosti se suspenze nechá usadit a odtáhne se čirá vrchní vrstva. Pak se přidá 80 ml vody, suspenze se rozmíchá míchadlem a zahřeje se na 80 °C. Za míchání se přidá roztok 0,500 g kyseliny alginové v 10 ml 0,4 mol/l NaOH. Pak se směs míchá 1 h při 90 °C. Po ochlazení na teplotu místnosti se ze suspenze ve válcové nádobě oddělí sraženina pomocí silného permanentního magnetu a pětkrát promyje 100 ml vody. Střední velikost částic je 2 pm. Vysušený analytický vzorek obsahuje 0,92 % C. To po přepočtení odpovídá 2,2 % kyseliny alginové v sušině.

Příklad 7

0,395 g xantátu celulózy (obsah a celulózy 6,6 % 5 % NaOH) se rozpustí v 66 ml 1,24 mol/l vodného roztoku amoniaku a za intenzivního míchání se přidá rychle 40 ml roztoku, který obsahuje 1,319 g FeCl₃ a 0,515 g FeCl₂. Vzniklá suspenze se pak zahřívá 1 h při 90 °C. Po ochlazení na teplotu místnosti se sraženina oddělí magnetem, promyje 80 ml vody. Pak se okyselí 80 ml 0,01 mol/HCl a nakonec třikrát promyje 100 ml vody. Produkt obsahuje v sušině 1,70 % C, to odpovídá 3,9 % celulózy.

Příklad 8

Ke 93,8 ml vodného roztoku, který obsahuje 1,319 g FeCl₃ a 0,515 g FeCl₂, vyhřátého na 70 °C se přidá v temperovaném reaktoru za intenzivního míchání turbinovým míchadlem najednou roztok 0,095 g heparinu v 6,17 ml 25 % vodného roztoku amoniaku. Teplota se během 15 min zvýší na 90 °C a při této teplotě se míchá 1 hodinu. Po ochlazení na teplotu místnosti se suspenze převede do válcové nádoby, ve které se sraženina oddělí pomocí silného permanentního magnetu a pětkrát promyje 100 ml vody. Vysušený analytický vzorek obsahuje 2,79 % C. To po přepočtení odpovídá 10,1 % heparinu v sušině.

Příklad 9

Ke 93,8 ml vodného roztoku, který obsahuje 1,319 g FeCl₃ a 0,528 g CoCl₂, vyhřátému na 70 °C se přidá v temperovaném reaktoru za intenzivního míchání turbinovým míchadlem najednou roztok 0,095 g heparinu v 6,17 ml 25 % vodného roztoku amoniaku. Teplota se během 15 min

-5CZ 299349 B6 zvýší na 90 °C a při této teplotě se míchá 1 hodinu. Po ochlazení na teplotu místnosti se suspenze převede do válcové nádoby, ve které se sraženina oddělí pomocí silného permanentního magnetu a pětkrát promyje 100 ml vody. Vysušený analytický vzorek obsahuje 0,72 % C. To po přepočtení odpovídá 7,1 % heparinu v sušině.

Příklad 10

Ke 93,8 ml vodného roztoku, který obsahuje 1,319 g FeCfi a 0,515 g FeCE, vyhřátému na 70 °C se přidá v temperovaném reaktoru za intenzivního míchání turbinovým míchadlem najednou roztok 0,095 g kyseliny hyaluronové v 6,17 ml 25% vodného roztoku amoniaku. Teplota se během 15 min zvýší na 90 °C a při této teplotě se míchá 1 hodinu. Po ochlazení na teplotu místnosti se suspenze převede do válcové nádoby, ve které se sraženina oddělí pomocí silného permanentního magnetu a pětkrát promyje 100 ml vody. Vysušený analytický vzorek obsahuje 3,53 % C. To po přepočtení odpovídá 8,3 % heparinu v sušině.

Příklad 11 mg nosiče připraveného podle příkladu 10, ekvilibrovaného 0,1 mol/1 fosfátovým pufrem pH

7,3 byl aktivován 0,1 mol/1 jod i stanem sodným 90 minut při laboratorní teplotě. Promytý aktivovaný nosič byl inkubován s roztokem trypsinu (3 mg) v lml uvedeného pufru s přídavkem kyanoborhydridu sodného při mírném otáčení 12 h při 4 °C. Nosič byl opakovaně promyt ekvilibračním pufrem nebo stejným pufrem s přídavkem 0,5 mol/1 NaCl a byl skladován v ekvilibračním pufru s přídavkem benzamidu a azidu sodného při 4 °C. Při opakovaném použití (minimálně 10 krát) v enzymovém reaktoru pro specifické štěpení (např. peptidové mapování) nedošlo k výraznému poklesu aktivity.

Příklad 12

K 1 mg nosiče připraveného podle příkladu 1, ekvilibrovaného 0,1 mol/1 fosfátovým pufrem pH

7,3 byl přidán roztok 3 až 5 mg trypsinu v 500 μΐ pufru a pak 7,5 mg l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimidu(EDAC) a 1,25 mg N-hydroxysulfosuccinimide (S-NHS). Směs (celkový objem lml) byla inkubována za mírného otáčení 12 h při 4 °C nebo 6 hodin při laboratorní teplotě. Po inkubaci byl nosič promyt ekvilibračním pufrem a stejným pufrem s přídavkem 0,5 mol/1 NaCl a byl skladován v ekvilibračním pufru s přídavkem benzamidinu a azidu sodného při 4 °C. Enzymový reaktor lze použít pro specifické štěpení (např. peptidové mapování) opakovaně minimálně 1 Ox bez výrazného poklesu aktivity.

Příklad 13

K 1 mg nosiče připraveného podle příkladu 1 a ekvilibrovaného 0,1 mol/1 fosfátovým pufrem pH

7,3 byl přidán roztok 5 mg thermolyzinu (Bacillus thermoproteolyticus) v 500 μΐ pufru, 7,5 mg EDAC a 1,25 mg S-NHS. Směs (celkový objem 1 ml) byla inkubována za mírného otáčení 12 hodin při 4 °C nebo 6 hodin při laboratorní teplotě. Po inkubaci byl nosič promyt ekvilibračním pufrem a stejným pufrem s přídavkem 0,5 mol/1 NaCl a byl skladován v ekvilibračním pufru spolu s Ca²⁺ a Zn²⁺ a s přídavkem azidu sodného při 4 °C. Enzymový reaktor byl použit opakovaně pro techniky peptide excision a peptide extraction.

-6CZ 299349 B6

Příklad 14

K 1 mg nosiče připraveného podle příkladu 1 a ekvilibrovaného 0,1 mol/1 fosfátovým pufrem pH 7,3, byl přidán roztok 500 l.U. endoproteinázy Glu-C (Staphylococcus aureus V8) v 500 μΐ pufru a po 2 min. 7,5 mg EDAC a 1,25 mg S-NHS. Směs (celkový objem 1 ml) byla inkubována za mírného otáčení 12 hodin při 4 °C nebo 6 hodin při laboratorní teplotě. Po inkubaci byl nosič promyt ekvilibračním pufrem a stejným pufrem s přídavkem 0,5 mol/1 NaCl a byl skladován v ekvilibračním pufru s přídavkem azidu sodného při 4 °C. Enzymový reaktor byl použit pro specifické štěpení (např. peptidové mapování, epitope extraction) opakovaně.

Příklad 15

K 5 mg nosiče připraveného podle příkladu 1, ekvilibrovaného 0,1 mol/1 fosfátovým pufrem pH 7,3, byly přidány protilátky třídy IgG (lidské nebo myší: např. myší monoklonální anti-prionové protilátky 5B2, 9H7) v množství 100 až 250 pg/500 μΙ pufru. Po 2 min. bylo přidáno 30 mg EDAC a 5 mg S-NHS. Směs (celkový objem 1 ml) byla inkubována za mírného otáčení 12 hodin při 4 °C nebo 6 hodin při laboratorní teplotě. Po inkubaci byl nosič promyt ekvilibračním pufrem a stejným pufrem s přídavkem 0,5 mol/1 NaCl. Nosič byl skladován v ekvilibračním pufru s přídavkem azidu sodného při 4 °C.

Stabilita reaktoru je odvozena od hodnoty konstanty stability Ka páru antigen-protilátka imobilizovaná na magnetickém nosiči. Pokud jsou imobilizovány vysokoafinitní protilátky (Ka přibližně v rozsahu 109 až 1011), lze imunoreaktor použít pro imobilizaci specifického antigenu. Reaktor s protilátkami středně a nízkoafinitními (přibližně v rozsahu 106 až 109) lze použít pro specifickou izolaci, purifikaci a zakoncentrování hledaného analytu - specifického antigenu, např. PrPc nebo PrPsc z mozkového homogenátu a dalších tělních tekutin.

Příklad 16

K 10 μΐ bakteriální DNA (o koncentraci 0,4; 4; 40 resp-400 pg/pl) se přidá 10 μΐ suspenze nosiče, která obsahuje 670 pg nosiče podle příkladu 1 nebo 0,6 pg nosiče podle příkladu 9 nebo 165 pg nosiče podle příkladu 10. Částice se separují magnetem. DNA v supematantu (1 pl) se amplifikuje v 25 μΐ PCR směsi. Vzniká amplikon bez snížení citlivosti reakce.

Příklad 17

K 10 μΐ bakteriální DNA (o koncentraci 0,4; 4; 40 resp-400 pg/μΙ) se přidá 10 pl suspenze nosiče obsahující 67 pg nosiče podle příkladu 1. DNA v supematantu (1 pl) se bez separace magnetických částic amplifikuje v 25 pl PCR směsi. Vzniká amplikon bez snížení citlivosti reakce.

Příklad 21

K 50 pl hrubých lyzátů bakteriálních buněk (získaných 10 minutovým povařením 1 ml přes noc narostlé bakteriální kultury) bylo přidáno 10 pl suspenze nosiče s karboxylovými skupinami podle příkladu 1, který obsahuje 670 pg nebo 130 pg nosiče a 50 pl hybridizačního pufru (8 % PEG, 3mol/l NaCl). Po 10 min inkubace při laboratorní teplotě byl nosič s navázanou DNA magneticky oddělen a promyt 500 pl 70% ethanolu. Po krátkém oschnutí byla DNA z nosiče uvolněna do TE pufru (10mmol/l Tris.Cl, lmmol/1 EDTA) (10 min / LT). DNA v eluátu potvrzena pomocí gelové elektroforézy na agaróze (0,8 % agaróza, 0,5 x TBE pufr, 60 V/2 h).

-7CZ 299349 B6

Průmyslová využitelnost

Magnetické částice podle vynálezu jsou využitelné v biologii, biochemii a medicíně při separaci a manipulaci s biopolymery, buňkami a mikroorganizmy a pro jejich značení, při zobrazování jadernou magnetickou rezonancí a dalších diagnostických postupech, pro dávkování či směrování léčiv a genů nebo léčení hyperthermií.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Magnetické částice tvořené oxidy železa, zejména magnetitem (Fe₃O₄), maghemitem (γ modifikace Fe₂O₃) nebo směsnými oxidy železa, zejména CoO.Fe₂O₃, CuO.Fe₂O₃, MnO.Fe₂O₃, vyznačující se tím, že jsou pokryté vrstvou polysacharidů nebo jejich derivátů obsahujících podél řetězce funkční skupiny -O-CS-S (xantát) nebo funkční skupiny -COO- (karboxylová skupina).

2. Magnetické částice tvořené oxidy železa podle nároku 1, vyznačující se tím, že derivát polysacharidu obsahující podél řetězce funkční skupiny -O-CS-S je xantát celulózy nebo xantát dextranu nebo xantát amylózy.

3. Magnetické částice tvořené oxidy železa podle nároku 1,vyznačuj ící se tím, že polysacharid je přírodní a jedná se o kyselinu alginovou nebo kyselinu pektinovou nebo kyselinu hyaluronovou nebo heparin.

4. Magnetické částice tvořené oxidy železa podle nároku 1, vyznačující se t i m , že derivát polysacharidu obsahující podél řetězce funkční skupiny-COO“ je karboxymethylcelulóza nebo karboxymethyldextran.

Konec dokumentu