CZ2004391A3 - Magnetické částice pokryté vybranými polysacharidy - Google Patents

Description

Magnetické částice pokryté vybranými polysacharidy

Oblast techniky

Vynález se týká nových magnetických částic tvořených magnetickým oxidem pokrytým vrstvou vybraných přírodních polysacharidů nebo jejich derivátů, které obsahují skupiny interagující s povrchem těchto oxidů.

Dosavadní stav techniky

Magnetické mikro a nano částice mají dnes rozsáhlé použití pro vědecké i technické účely. Zahrnuje dosti odlišné oblasti počínaje tradičním použitím v zařízeních mechanických (těsnění, ložiska, tlumiče), elektromechanických (reproduktory, krokové motory) až po modernější sofistikované biologické a lékařské aplikace (separace a manipulace s biopolymery, buňkami a mikroorganizmy a jejich značení, zobrazování jadernou magnetickou rezonancí - magnetic resonance imaging - MRI ), a další diagnostické postupy, dávkování či směrování léčiv a genů (drug and gen delivery and targeting), nebo léčení hyperthermií atd) [Magnetic Fluids and Applications Handbook and Database, (editoři: Bashtovoi V. G. and Berkovsky Β. M.) Begell House Publishers, Incorporated, (1996) ISBN: 1567000622, Scientific and Clinical Applications of Magnetic Carriers: (Proceedings of an International Conference Held in Rostock, Germany, September 5-7-, 1996), (editoři: Hafeli U., Schutt W., Teller J., Zborowski M.) Kluwer Academie Publishers (1997),1st edition, ISBN: 0306456877, Radiolabeled and Magnetic Particulates in Medicine & Biology, (editor Arshady R.) Citus Books, London, England (2001) ISBN:0953218732j.

Podle chemického složení patří magnetické materiály většinou mezi kovy (hlavně železo, a další) nebo oxidy těchto kovů (hlavně oxidy železa). Magnetické oxidy železa zahrnují magnetit (Fe₃O4), maghemit (γ modifikace Fe₂O3) nebo ferrity obecného vzorce (MeO. Fe2O3, kde Me může být Mn, Mg, Ni, Zn, Cu, Co, V, Cd, Cr; Ba, Sr, Mg, Ca, Pt). [v patentové literatuře: Czerlinski,G., US Pat.4454234 (1984); Czerlinski G , US Pat.6133047 (2000); Elaissari A., et al., US Pat.4827945 (1989) a US Pat.6599498 (2003); Groman E.V., et al, US Pat. 4101435 (1978); Hasegawa M., US Pat.4329241 (1982); Massart R„ et al, US Pat. 4795698 (1989); Owen C.S., et al, DE3709852 A1 (1988); Pilgrimm H., US Pat. 4554088 (1985); Whitehead R.A., et al.; i odborné literatuře: Bacri J.C., et al., J. Magn.Magn.Mat. 85, 27-32 (1990); Bee A., et al., J.Magn.Magn.Mat. 149, 6-9 (1995); Fauconnier N., et al., J.Colloid and Interface Sci.194, 427-433 (1997); Kang H., et al., Bull.Korean Chem.Soc.19, 408-411 (1998); Khng H.P., et al., Biotech.Bioeng. 60, 419• ··

424 (1998); Kim D.K., et al., J.Magn.Magn.Mat. 225, 30-36 (2001); Massart R„ Trans. Magnet.17, 1247-1248 (1981); Massart R., et al., J.Magn.Magn.Mat. 149, 1-5 (1995); Sousa M.H., et al., J.Magn.Magn.Mat. 225, 67-72 (2001); Tourinho F.A., et al., Progr. Colloid Polymer Sci. 79, 128-134 (1989)]. Je popsána velká řada postupů na přípravu magnetických oxidů s velikostí částic v řádu nanometrů a jejich modifikací pro konkrétní použití. Klasický postup - dlouhodobé mletí oxidů v přítomnosti stabilizátoru - ztratil dnes již na významu. Převládá tzv. chemická cesta, kde se roztokem alkalického činidla sráží roztok směsi solí Fe(lll) a Fe(ll) (pro magnetit) nebo Fe(lll) a M(ll) (pro ferrity), kde M(ll) má svrchu uvedený význam. Pro optimální magnetické vlastnosti musí být sole Fe(lll) a Fe(ll), resp. M(ll) v molárním poměru blízkém 2:1. Průběh srážení (zejména velikost částic) a magnetické vlastnosti ovlivňuje dále velká řada parametrů [Bee A., et al., J.Magn. Magn.Mat. 149, 6-9 (1995); Massart R., Compt.Rend. Hebdomadaires des Seances de I Academie des Sciences Serie C 291, 1-3 (1980); Massart R., et al., Journal de Chimie Physique et de Physico-Chimie Biologique 84, 967-973 (1987)]. Knim patří druh protiiontu, výchozí koncentrace solí, typ báze pro srážení (většinou amoniak nebo alkalický hydroxid) á její množství, teplota při srážení a při dalším zpracování, a další. V neposlední řadě také přítomnost dalších látek při srážení, zejména látek komplexujících nebo chelatujících kationty přítomné v systému. Maghemit se připravuje vhodnou oxidací magnetitu [Massart R., Trans. Magnet.17, 1247-1248 (1981); Massart R., et al., J.Magn. Magn. Mat. 149, 1-5 (1995); Sousa M.H, et al., J.Magn.Magn.Mat. 225, 67-72 (2001)], protože přímým srážením Fe(lll) soli alkalickým činidlem vzniká nemagnetická modifikace oxidu železitého.

Malé částice (řádově nanometrové) je třeba stabilizovat, aby tvořily stabilní koloidní roztoky a v podmínkách použití neagregovaly. Je popsána řada způsobů stabilizace působením nízko nebo vysokomolekulárních látek. Relativně koloidně stabilní kationtový neboli kyselý magnetit vzniká působením kyseliny chloristé nebo dusičné. Aniontový neboli zásaditý vzniká působením tetramethyl amonium hydroxidu [Massart R., Trans. Magnet .17, 1247-1248(1981)].

Pro nepolární organické prostředí se stabilizuje koloidní systém působením vyšších alifatických karboxylových kyselin [Rocchiccioli-Deltcheff C., et al., Journal of Chemical Research-S 126(1987)]. Zlepšení stability koloidních roztoků spojené většinou se zmenšením velikosti částic se dosahuje také účinkem řady nízkomolekulárních látek, jako jsou kyselina citrónová, dimerkaptojantarová, ethylendiamintetraoctová (EDTA), fosfáty, difosfáty, fosfo2 • 4 ·· · háty, fosfáty [Bee A., et al., J.Magn.Magn.Mat. 149, 6-9 (1995); Blesa M.A., et al., J. Colloid Interface Sci. 98, 295-305 (1984); Fauconnier N., et al., J.Mol.Liq. 83, 233-242 (1999); Fauconnier N., et al., J.Colloid and Interface Sci.194, 427-433 (1997); Halbreich A., et al., Biochimie 80, 379-390 (1998); Massart R., Trans. Magnet.17, 1247-1248 (1981); Massart R., et al., J.Magn.Magn.Mat. 149, 1-5 (1995); Pilgrimm H., US Pat. 5160725 (1992); Pilgrimm H., US Pat.5916539 (1999); Pilgrimm H., US Pat.6274121 (2001)].

Pro medicínská a biologická použití je potřeba magnetické částice na povrchu upravit nebo modifikovat ke zlepšení užitných vlastnosti. Jedná se zejména o zabránění nespecifických sorpcí, minimalizaci agregace částic nebo zavedení funkčních skupin. Pro klinické použití je nutné modifikací povrchu zabránit kontaktu případných toxických - Hafeli U.O., et al., J.Magn.Magn.Mat. 194, 76-82 (1999); Hasegawa M., et al., Japan, JP51151320A2 (1976); Lacava Z.G.M., et al., J.Magn.Magn.Mat. 201, 431-434 (1999) - imunogenních povrchů nosiče s buňkami organismu. Reaktivní funkční skupiny na nosiči je možné využít ke kovalentní imobilizaci např. farmakologicky (např. cytostatika, imunosupresiva, chemoterapeutika) nebo katalyticky aktivních látek (např. enzymy ze skupiny hydroláz, proteáz, oxidáz a pod.). Takto modifikované nosiče lze cíleně směrovat do určeného místa v organismu - tzv. targeting drug delivery systém.

Enzymy díky své vysoké aktivitě a specifitě spolu s dalšími biologicky aktivními látkami, jako jsou např. protilátky definované specifity, se podílejí významně na rozvoji vysoce perspektivní oblasti diagnostiky a terapie. Při léčbě některých metabolických, nádorových nebo autoimunitních chorob lze s výhodou použít bioaktivní nosiče, kde již pouhým zvýšením molekulové hmotnosti komplexu se výrazně zvyšuje odolnost proti buněčným lysozomálním enzymům a endogenním proteinázám. Tento depotní efekt tak výrazně prodlužuje efekt terapeutický. Nároky na konečné množství podané látky se tak nepřímo snižují. Cíleným zaváděním nosiče lze současně minimalizovat vedlejší pyrogenní, toxické a antigenní účinky.

Imobilizaci biologicky aktivních látek zasahujících do rozvoje imunitní odpovědi lze úspěšně potlačit imunitní reakci a snižovat lokální nebo systémové alergické reakce. Bioaktivní proteiny nebo peptidy s malou molekulovou hmotností (kofaktory, inhibitory, modulátory mnoha enzymových reakcí a metabolických cyklů) jsou za normálních okolností velice rychle odbourávány a vylučovány z organismu. Jejich imobilizaci na nosiče a cíleným transportem do místa zásahu se výrazně prodlužuje jejich retenční čas a účinnost. Takové ·♦·· bíoaktivní komplexy lze použít pro léčbu chorob, kde patogeneze vzniku choroby je spjata s účinky proteolytických chorob. Jsou to např. traumatická poškození tkání, septické stavy, alergické reakce, poruchy spjaté se srážením krve a tvorbou fibrinu.

Cíleným magnetickým transportem bioaktivních látek do místa, kde je terapeutický efekt nejžádanější, lze minimalizovat vedlejší nežádoucí účinky. Nadbytečnou saturací zdravých buněk terapeutikem dochází za normálních okolností ke zbytečnému zatěžování organismu. Transport bioaktivních látek do místa zásahu lze dosáhnout několika způsoby: a) přímou implantací látek do místa zásahu; b) aplikací terapeutika per os nebo intravenózně nebo intramuskulárně a pomocí vnějších sil (např. magnetického pole) látku zakoncentrovat v místě, kde má působit; c) aplikací terapeutika per os nebo intravenózně nebo intramuskulárně a zajistit aktivací léčebný efekt terapeutika až v místě s patologicky změněným prostředím; d) transportem bioaktivních látek do místa zásahu pomocí nosiče s kovalentně vázaným afinitním ligandem.

Nosiče s kovalentně vázanými afinitními ligandy lze s úspěchem použít i pro odstraňování patologicky změněných látek z krevního oběhu a dalších tělních tekutin. Jako příklad je nutné uvést účinné odstraňování specifických autoimunitních protilátek ze séra pacientů se závažnými druhy autoimunitních chorob, které jsou provázené vysokými titry patologických protilátek, které vyvolávají závažné zánětlivé změny a ztrátu funkce napadeného orgánu, tkáně.

Nosiče, kde je kovalentně vázaným ligandem enzym (IMERs), antigen, specifická protilátka (IMARs), jsou také široce používány v oboru diagnostiky, v oblasti výzkumu v oboru genomiky a proteomiky při studiu struktury a konformace mnoha fyziologických a patologických forem proteinů (např. technika peptidového mapování a sekvenování, techniky peptide excision a peptide extraction při vyhledávání imunogenních a protektivních epitopů pro vývoj nové generace vakcín a pod.). Afinitní reaktory jsou také vhodným nástrojem pro specifickou izolaci, purifikaci a zakoncentrování látek, vyskytujících se v biologickém materiálu v extrémně nízkých koncentracích, při specifické separaci a izolaci patologicky změněných proteinů. Specifické IMERs a IMARs reaktory lze použít jako integrovanou součást mikroanalyzátorů, vyrobených mikrofluidní technologií.

Povrchová modifikace magnetických a dalších oxidů se provádí v zásadě dvojím způsobem. Buď je činidlo přítomné již při srážení oxidu nebo se jím modifikuje až hotová sraženina oxidu získaného srážením nebo jinak. K tomu, aby byla modifikace povrchu pro pod4 ·· ·»·· ·· · • * * • » · * • · · · · · · • · · ·* · minky použití dostatečně pevná, je potřeba, aby činidla obsahovala funkční skupiny, které s povrchem oxidu interagují chemickou nebo fyzikální vazbou. Vyšší stability povrchové vrstvy může být dosaženo také sesítěním původně málo stabilní polymerní vrstvy nebo dalšími fyzikálními interakcemi řetězců nízkomolekulárních činidel. Z čistě formálního hlediska mohou být modifikační činidla nízkomolekulární nebo vysokomolekulární. V zásadě platí, že interagující funkční skupina nízkomolekulárních činidel - zvláště pokud obsahují jen jednu - musí tvořit s povrchem oxidu pevnou vazbu. U činidel výšemolekulárních a polymerů, které obsahují více nebo mnoho slaběji interagujících skupin, se dosahuje stabilního pokrytí násobným účinkem slabé interakce.

Pro biologické a medicínské aplikace se pro pokrytí magnetických oxidů dosud nejčastěji používají hydrofilní přírodní nebo syntetické polymery. Z přírodních polymerů to jsou hlavně biodegradovatelné polysacharidy (např. dextran, agaróza, celulóza, škrob atd.) a jejich deriváty, ale také monomerní, případně oligomerní polypeptidy, proteiny (např. albumin) [Scientific and Clinical Applications of Magnetic Carriers: (Proceedings of an International Conference Held in Rostock, Germany, 1996); (editoři:Hafeli U., Schutt W, Teller J., Zborowski M.) Kluwer Academie Publishers (1997);1st edition, ISBN:0306456877; Chatterje J., et al., C.olloid Polym.Sci. 279, 1073-1081 (2001); Chatterjee J., et al., Colloid and Polymer Science 279, 1073-1081 (2001); Mehta R.V., et al., Biotechnology Techniques 11, 493-496 (1997); Owen C.S., et al, US Pat.4795698 (1989); Pouliquen D, Chouly C, Magnetic microcarriers for medical applications (in: Microspheres, Microcapsules and Liposomes (1999), str. 343- 382; Tiefenauer L.X, et al, Magnetic Resonance Imaging 14, 391-402 (1996)], a nukleové kyseliny s nízkou imunogenicitou. Ze syntetických polymerů pak polyvinylalkohol [Bee A, et al, J.Magn.Magn.Mat. 149, 6-9 (1995)], polyvinylpyrrolidon, polyHEMA, PEG [Pilgrimm H, US Pat.5916539 (1999)] a další. Předností polysacharidů jsou vesměs jen nepatrné nespecifické interakce s biopolymery. Z polysacharidů má pro pokrytí dominantní postavení dextran. Materiály tohoto typu se připravují koprecipitací příslušných solí Fe(lll) a Me(ll) v přítomnosti relativně vysoké koncentrace dextranu [Hasegawa M, et al, US Pat.4101435 (1978)], respektive jeho derivátu (např. karboxyalkylovaným dextranem [Groman E.V, et al, US Pat6599498 (2003)]). Na této bázi je k dispozici řada komerčních produktů. Interakce ve vodě rozpustných polysacharidů bez směrujících skupin na oxidy je však poměrně slabá. Pokud se polysacharid po počátečním pokrytí nefixuje (např. síťováním [Palmacci S, et al, US Pat.5262176 (1993)] nebo samovolně pomocí vodíkových vazeb), dochází při použití k postupnému uvolňování dextranu a odkrývání povrchu oxidu. Magnetická celulóza větší než 10 pm byla připravena regene5 ·· · * · · • · · · • · ···· * · 9 ·· 9 raci celulózy z částic vytvořených dispergováním suspenze magnetického oxidu v roztoku vhodného derivátu celulózy (např. xantátu, acetátu) v rozpouštědle, které se nemísí s disperzním prostředím (vodný roztok aniontového polyelektrolytu) [Yamagishi K., et al., JP Japan, JP4089834A2 (1992); Lenfeld J., Angew.Makromol.Chem. 212, 147-155 (1993)].

K výraznému posílení vazby polysacharidů na magnetické oxidy dochází zavedením směrujících skupin do jejich molekuly. Tak je tomu např. u dextranu s chelatujícími iminodioctovými [Porath J., et al., US Pat4677027 (1987)]-nebo karboxyalkylovými [Groman E.V., et al., US Pat.6599498 (2003)]-skupinami podél řetězce. Slabší interakce je u dextranu s koncovými karboxylovými skupinami [Hasegawa M., et al., US Pat.5424419 (1995)]. Jsou popsány také magnetické oxidy, pokryté dalšími polysacharidy: agarózou [Levison P.R., et al., J. Chromatogr.A 816, 107-111 (1998)], chitosanem [Glasser W.G., et al., US Pat.5864025 (1999)].

Podstata vynálezu

Předmětefvyynálezu jsou magnetické oxidy železa pokryté vrstvou přírodních polysacharidů nebo jejich vybraných derivátů. Použité magnetické oxidy patří do skupiny oxidů železa tvořené magnetitem (Fe3O4) nebo maghemitem (γ modifikace Fe₂O3) nebo do skupiny směsných oxidů železa (ferritů) tvořené MeO.Fe₂O3, kde Me je Co, Cu, Mn. Vybrané přírodní polysacharidy nebo jejich deriváty obsahují na řetězci funkční skupiny, které interagují s povrchem magnetických oxidů železa a opakovanou vazbou tak způsobují pevné navázání na povrchu oxidu. Jako směrující skupiny jsou použity xantát (-O-CS-S^-) a karboxyl (-CO-O^-). Polysacharidy s dithiokarbonátovou skupinou se získají působením sirouhlíku ρθ polysacharidy v přítomnosti hydroxidu alkalického kovu. Polysacharidem je v této souvislosti celulóza nebo dextran. Polysacharid s postranními karboxylovými skupinami podél řetězce je - na rozdíl od dosud popsaných polysacharidů s koncovými karboxylovými skupinami - kyselina alginová, pektinová, hyaluronová, heparin a karboxymethyl celulóza.

Násobná interakce směrujících skupin polysacharidů s volnými vazebnými místy iontů kovu v krystalové mřížce oxidů způsobuje pokrytí povrchu oxidu relativně stálou vrstvou polysacharidu. Při pokrývání pomocí xantátů polysacharidů je potřeba po oddělení podílu, který s oxidem nereagoval, regenerovat polysacharid okyselením nebo zahřátím. Pokud je ·» ···· ·· · « · · • · · >

• * *··· • · · ·· · v tomto případě samotný polysacharid ve vodě rozpustný, je výhodné fixovat polysacharid ještě před regenerací síťováním.

Nosiče neuvolňují látky inhibující řetězovou polymerázovou reakci (polymerase chain reaction - PCR), případně samy v PCR neinterferují.

K působení polysacharidu podle vynálezu může docházet během srážení oxidu nebo působením činidla na již vysrážený oxid. Pro dosažení optimálních magnetických vlastností je poměr Fe(lll)/Fe(ll) resp. Fe(lll)/Me(ll) v rozmezí 1,9 až 2,1.

Magnetické částice podle vynálezu se používají při imobilizaci enzymů a dalších proteinů pro enzymové reaktory a senzory. Nosič s karboxylovými skupinami byl použit pro separaci DNA.

Příklady provedení

Příklad 1

Ke 93,8 ml vodného roztoku, který obsahuje 1,319 g FeCb a 0,515 g FeCb, a vyhřátému na 70 °C, se přidá v temperovaném reaktoru za intenzivního míchání turbinovým míchadlem najednou roztok 0,095 g kyseliny alginové v 6,17 ml 25 % vodného roztoku amoniaku. Teplota se během 15 min zvýší na 90 °C a při této teplotě se míchá 1 hodinu. Po ochlazení na teplotu místnosti se suspenze převede do válcové nádoby, ve které se sraženina oddělí pomocí silného permanentního magnetu. Na odstranění nízkomolekulárních solí se sraženina promyje pětkrát 100 ml vody (rozmíchání, magnetické oddělení a odlití roztoku). Střední velikost částic je 13 pm podle scanning electron microscopy (SEM). Vysušený analytický vzorek obsahuje 1,48 % C. To po přepočtení odpovídá 7,1 % kyseliny alginové v sušině.

Příklad 2

Postup jako v příkladu 1 s tím, že se v roztoku amoniaku pro srážení oxidů přidá 0,190 g kyseliny alginové. Produkt zpracovaný stejným způsobem obsahuje v sušině 3,45 % C, to odpovídá 8,4 % kyseliny alginové.

Příklad 3

Ke 88,8 ml vodného roztoku, který obsahuje 1,319 g FeCL a 0,528 g C0CI2, vyhřátému na 70 °C, se přidá v temperovaném reaktoru za intenzivního míchání turbinovým míchadlem najednou roztok 0,095 g kyseliny alginové v 11 ml 6 M NaOH. Teplota se během 15 min

• · · • · ·· ···· • · ·· ·· • · · · • · · · ···· • · · · ·* · zvýší na 90 °C a při této teplotě se míchá 1 hodinu. Po ochlazení na teplotu místnosti se ze suspenze ve válcové nádobě oddělí sraženina pomocí silného permanentního magnetu a pětkrát promyje 100 ml vody. Střední velikost částic je 2 pm (SEM). Vysušený analytický vzorek obsahuje 2,31 % C. To po přepočtení odpovídá 5,6 % kyseliny alginové v sušině.

Příklad 4

Postup jako v příkladu 1 s tím, že se k roztoku amoniaku pro srážení oxidů přidá 0,190 g kyseliny alginové. Produkt zpracovaný stejným způsobem. Střední velikost částic je 3 pm (SEM). Obsahuje v sušině 3,46 % C, to odpovídá 8,4 % kyseliny alginové.

Příklad 5

Ke 88,8 ml vodného roztoku, který obsahuje 1,319 g FeCI₃ a 0,547 g CuCI₂, vyhřátému na 70 °C, se přidá v temperovaném reaktoru za intenzivního míchání turbinovým míchadlem najednou roztok 0,095 g kyseliny alginové v 11 ml 6 M NaOH. Teplota se během 15 min zvýší na 90 °C a při této teplotě se míchá 1 hodinu. Po ochlazení na teplotu místnosti se suspenze převede do válcové nádoby, ve které se sraženina oddělí pomocí silného permanentního magnetu a pětkrát promyje 100 ml vody. Vysušený analytický vzorek obsahuje 1,15 % C. To po přepočtení odpovídá 3,3 % kyseliny alginové v sušině.

Příklad 6

Ke 88,8 ml vodného roztoku, který obsahuje 1,319 g FeCI₃ a 0,703 g octanu manganatého, vyhřátému na 70 °C, se přidá v temperovaném reaktoru za intenzivního míchání turbinovým míchadlem najednou roztok 0,190 g kyseliny alginové v 11 ml 6 M NaOH. Teplota se během 15 min zvýší na 90 °C a při této teplotě se míchá 1 hodinu. Po ochlazení na teplotu místnosti se suspenze převede do válcové nádoby, ve které se sraženina oddělí pomocí silného permanentního magnetu a pětkrát promyje 100 ml vody. Vysušený analytický vzorek obsahuje 1,0 % C. To po přepočtení odpovídá 2,9 % kyseliny alginové v sušině.

Příklad 7

Ke 93,8 ml vodného roztoku, který obsahuje 1,319 g FeCI₃ a 0,515 g FeCI₂, vyhřátému na 70 °C se přidá v temperovaném reaktoru za intenzivního míchání turbinovým míchadlem najednou 6,17 ml 25 % vodného roztoku amoniaku. Teplota se během 15 min zvýší na 90 °C a při této teplotě se míchá 1 hodinu. Po ochlazení na teplotu místnosti se suspenze nechá usadit a odtáhne se čirá vrchní vrstva a promyje dvakrát 80 ml vody. Sraženina se znovu rozmíchá v 80 ml vody, zahřeje se na 80 °C a za míchání se přidá roztok 0,500 g kyseliny alginové v 10 ml 0,4 M amoniaku. Pak se směs míchá 1 hod při 90 °C. Po ochla8

žení na teplotu místnosti se ze suspenze ve válcové nádobě oddělí sraženina pomocí silného permanentního magnetu a třikrát promyje 100 ml vody. Vysušený analytický vzorek obsahuje 2,55 % C. To po přepočtení odpovídá 6,2 % kyseliny alginové v sušině.

Příklad 8

Ke 93,8 ml vodného roztoku, který obsahuje 1,319 g FeCb a 0,528 g CoCb, vyhřátému na 70 °C, se přidá v temperovaném reaktoru za intenzivního míchání turbinovým míchadlem najednou 6,17 ml 25 % vodného roztoku amoniaku. Teplota se během 15 min zvýší na 90 °C a při této teplotě se míchá 1 hodinu. Po ochlazení na teplotu místnosti se suspenze nechá usadit a odtáhne se čirá vrchní vrstva. Pak se přidá 80 ml vody, suspenze se rozmíchá míchadlem a zahřeje se na 80 °C. Za míchání se přidá roztok 0,500 g kyseliny alginové v 10 ml 0,4 M NaOH. Pak se směs míchá 1 hod při 90 °C. Po ochlazení na teplotu místnosti se ze suspenze ve válcové nádobě oddělí sraženina pomocí silného permanentního magnetu a třikrát promyje 100 ml vody. Střední velikost částic je 2 pm (SEM). Vysušený analytický vzorek obsahuje 0,92 % C. To po přepočtení odpovídá 2,2 % kyseliny alginové v sušině.

Příklad 9

0,395 g xantátu celulózy (obsah a celulózy 6,6 %, 5 % NaOH) se rozpustí v 66 ml 1,24 M vodného amoniaku a za intenzivního míchání se přidá rychle 40 ml roztoku, který obsahuje 1,319 g FeCb a 0,515 g FeCb. Vzniklá suspenze se pak zahřívá 1 hod. na 90 °C. Po ochlazení na teplotu místnosti se sraženina oddělí magnetem, promyje 80 ml vody. Pak seokyšelí 80 ml 0,01 M HCI a nakonec třikrát promyje 100 ml vody. Produkt obsahuje v sušině 1,70 % C, to odpovídá 3,9 % celulózy.

Příklad 10

Analogický postup jako v příkladu 9 kromě toho, že ve směsi iontů kovu pro srážení je místo FeCb 0,528 g CoCb- Produkt obsahuje v sušině 1,33 % C, to odpovídá 3,0 % celulózy.

Příklad 11

Ke 93,8 ml vodného roztoku, který obsahuje 1,319 g FeCb a 0,515 g FeCb, vyhřátému na °C se přidá v temperovaném reaktoru za intenzivního míchání turbinovým míchadlem najednou roztok 0,095 g heparinu v 6,17 ml 25 % vodného roztoku amoniaku. Teplota se g

během 15 min zvýší na 90 °C a při této teplotě se míchá 1 hodinu. Po ochlazení na teplotu místnosti se suspenze převede do válcové nádoby, ve které se sraženina oddělí pomocí silného permanentního magnetu a pětkrát promyje 100 ml vody. Vysušený analytický vzorek obsahuje 2,79 % C. To po přepočtení odpovídá 10,1 % heparinu v sušině.

Příklad 12

Ke 93,8 ml vodného roztoku, který obsahuje 1,319 g FeCI₃ a 0,528 g C0CI2, vyhřátému na 70 °C se přidá v temperovaném reaktoru za intenzivního míchání turbinovým míchadlem najednou roztok 0,095 g heparinu v 6,17 ml 25 % vodného roztoku amoniaku. Teplota se během 15 min zvýší na 90 °C a při této teplotě se míchá 1 hodinu. Po ochlazení na teplotu místnosti se suspenze převede do válcové nádoby, ve které se sraženina oddělí pomocí silného permanentního magnetu a pětkrát promyje 100 ml vody. Vysušený analytický vzorek obsahuje 0,72 % C. To po přepočtení odpovídá 7,1 % heparinu v sušině.

Příklad 13

Ke 93,8 ml vodného roztoku, který obsahuje 1,319 g FeCb a 0,515 g FeCb, vyhřátému na 70 °C se přidá v temperovaném reaktoru za intenzivního míchání turbinovým míchadlem najednou roztok 0,095 g kyseliny hyaluronové v 6,17 ml 25 % vodného roztoku amoniaku. Teplota se během 15 min zvýší na 90 °C a při této teplotě se míchá 1 hodinu. Po ochlazení na teplotu místnosti se suspenze převede do válcové nádoby, ve které se sraženina oddělí pomocí silného permanentního magnetu a pětkrát promyje 100 ml vody. Vysušený analytický vzorek obsahuje 3,53 % C. To po přepočtení odpovídá 8,3 % kyseliny hyaluronové v sušině.

Příklad 14 mg nosiče připraveného podle příkladu 10, ekvilibrovaného 0,1 M fosfátovým pufrem pH 7,3 byl aktivován 0,1 M jodistanem sodným 90 minut při laboratorní teplotě. Promytý aktivovaný nosič byl inkubován s roztokem trypsinu (3 mg) v 1ml uvedeného pufru s přídavkem kyanoborhydridu sodného při mírném otáčení 12 hod při 4 °C. Nosič byl opakovaně promyt ekvilibračním pufrem nebo stejným pufrem s přídavkem 0,5 M NaCI a byl skladován v ekvilibračním pufru s přídavkem benzamidinu a azidu sodného při 4 °C. Při opakovaném použití (minimálně 10 krát) v enzymovém reaktoru pro specifické štěpení (např. peptidové mapování) nedošlo k výraznému poklesu aktivity.

·· ·«

Příklad 15

K 1 mg nosiče připraveného podle příkladu 1, ekvilibrovaného 0,1 M fosfátovým pufřem pH 7,3, byl přidán roztok 3 - 5 mg trypsinu (Bos taurus, pancreas) v 500 pl pufru a pak 7,5 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimidu (EDAC) a 1,25 mg N-hydroxysulfosuccinimide (S-NHS). Směs (celkový objem 1ml) byla inkubována za mírného otáčení 12 hodin při 4 °C nebo 6 hodin při laboratorní teplotě. Po inkubaci byl nosič promyt ekvilibračním pufřem a stejným pufřem s přídavkem 0,5 M NaCl a byl skladován v ekvilibračním pufru s přídavkem benzamidinu a azidu sodného při 4 °C. Enzymový reaktor lze použít pro specifické štěpení (např. peptidové mapování) opakovaně minimálně 10x bez výrazného poklesu aktivity.

Příklad 16

K 1 mg nosiče připraveného podle příkladu 1 a ekvilibrovaného 0,1 M fosfátovým pufřem pH 7,3 byl přidán roztok 5 mg thermolyzinu (Bacillus thermoproteolyticus) v 500 pl pufru, 7,5 mg EDAC a 1,25 mg S-NHS. Směs (celkový objem 1 ml) byla inkubována za mírného otáčení 12 hodin při 4 °C nebo 6 hodin při laboratorní teplotě. Po inkubaci byl nosič promyt ekvilibračním pufřem a stejným pufřem s přídavkem 0,5 M NaCl a byl skladován v ekvilibračním pufru spolu s Ca²⁺ a Zn²⁺ a s přídavkem azidu sodného při 4 °C. Enzymový reaktor byl použit opakovaně pro techniky peptide excision a peptide extraction.

Příklad 17

K 1 mg nosiče připraveného podle příkladu 1 a ekvilibrovaného 0,1 M fosfátovým pufřem pH 7,3, byl přidán roztok 500 I.U. endoproteinázy Glu-C (Staphylococcus aureus V8) v 500 μΙ pufru a po 2 min. 7,5 mg EDAC a 1,25 mg S-NHS. Směs (celkový objem 1 ml) byla inkubována za mírného otáčení 12 hodin při 4 °C nebo 6 hodin při laboratorní teplotě. Po inkubaci byl nosič promyt ekvilibračním pufřem a stejným pufřem s přídavkem 0,5 M NaCl a byl skladován v ekvilibračním pufru s přídavkem azidu sodného při 4 °C. Enzymový reaktor byl použít pro specifické štěpení (např. peptidové mapování, epitope extraction) opakovaně.

Příklad 18

K 5 mg nosiče připraveného podle příkladu 1, ekvilibrovného 0,1 M fosfátovým pufřem pH

7,3, byly přidány protilátky třídy IgG (lidské nebo myší: např. myší monoklonální antiprionové protilátky 5B2, 9H7) v množství 100 - 250 pg/500 μΙ pufru. Po 2 min. bylo přidáno 30 mg EDAC a 5 mg S-NHS. Směs (celkový objem 1 ml) byla inkubována za mírného • · · · · · · · · • · · · · · • · · · · · · • · ··· · · · · otáčení 12 hodin při 4 ’C nebo 6 hodin při laboratorní teplotě. Po inkubaci byl nosič opakovaně promyt ekvilibračním pufrem a stejným pufrem s přídavkem 0,5 M NaCl. Nosič byl skladován v ekvilibračním pufru s přídavkem azidu sodného při 4 °C.

Stabilita reaktoru je odvozena od hodnoty konstanty stability Kg páru antigen-protilátka imobilizovaná na magnetickém nosiči. Pokud jsou imobilizovány vysokoafinitní protilátky (K_a přibližně v rozsahu 10⁹-10¹¹), lze imunoreaktor použít pro imobilizaci specifického antigenu. Reaktor s protilátkami středně a nízkoafinitními (přibližně v rozsahu 10⁶—10⁹) lze použít pro specifickou izolaci, purifikaci a zakoncentrování hledaného analytu - specifického antigenu, např. PrPc nebo PrPsc z mozkového homogenátu a dalších tělních tekutin.

Příklad 19

K 10 pl bakteriální DNA (o koncentraci 0,4, 4, 40 resp-400 pg/μΙ) se přidá 10 μΙ suspenze nosiče, která obsahuje 670 pg nosiče podle příkladu 1 nebo 0,6 pg nosiče podle příkladu 9 nebo 165 pg nosiče podle příkladu 10. Částice se separují magnetem. DNA v supernatantu (1 pl) se amplifikuje v 25 μΙ PCR směsi. Vzniká specifický amplikon bez snížení citlivosti reakce.

Příklad 20

K 10 pl bakteriální DNA (o koncentracích 0,4, 4, 40 resp-400 pg/μΙ) se přidá 10 μΙ suspenze nosiče obsahující 67 pg nosiče podle příkladu 1. DNA v supernatantu (1 pl) se bez separace magnetických částic amplifikuje v 25 pl PCR směsi. Vzniká specifický amplikon bez snížení citlivosti reakce.

Příklad 21

K 50 pl hrubých lyzátů bakteriálních buněk (získaných 10 minutovým povařením 1 ml přes noc narostlé bakteriální kultury) bylo přidáno 10 pl suspenze nosiče s karboxylovými skupinami podle příkladu 1, který obsahuje 670 pg nebo 130 pg nosiče a 50 pl hybridizačního pufru (8 % PEG, 3 M NaCl). Po 10 min inkubace při laboratorní teplotě byl nosič s navázanou DNA magneticky oddělen a promyt 500 pl 70 % ethanolu. Po krátkém oschnutí byla DNA z nosiče uvolněna do TE pufru (10 mM Tris.CI, 1 mM EDTA) (10 min / LT). DNA v eluátu potvrzena pomocí gelové elektroforézy na agaróze (0,8 % agaroza, 0,5 x TBE pufr, 60 V/2 hod.).

• · · · ···· ·· · * · ·· · · · · ·* · · · ···· • ··· · ··· · · · · • · · · · · · · · ·· 99 9 9 9 9 ·

Průmyslová využitelnost

Magnetické částice podle vynálezu jsou využitelné v biologii biochemii a medicíně při separaci a manipulaci s biopolymery, buňkami a mikroorganizmy a pro jejich značení, při zobrazování jadernou magnetickou rezonancí a dalších diagnostických postupech, pro dávkování či směrování léčiv a genů nebo léčení hyperthermií.

Claims (10)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Magnetické částice tvořené oxidy železa, zejména magnetitem (Fe₃O4), maghemitem (γ modifikace Fe2O₃) nebo směsnými oxidy železa , zejména CoO.Fe2O₃, CuO.Fe₂O₃, MnO.Fe₂O_3| vyznačující se tím, že jsou pokryté vrstvou přírodních polysacharidů nebo jejich derivátů obsahujících podél řetězce postranní funkční skupiny, které zároveň podmiňují rozpustnost polysacharidů v reakčním systému a současně interagují s povrchem oxidů železa, přičemž se obsah modifikujícího polysacharidů pohybuje v rozmezí 0,1 až 30 %.
2. 2. Magnetické oxidy železa podle nároku 1. vyznačené tím, že pro modifikaci se použije polysacharid .obsahující funkční skupinu -O-CS-S
3. 3. Magnetické oxidy železa podle nároku 1. vyznačené tím, že polysacharid, použitý pro modifikaci, obsahuje funkční skupinu -COO^-,
4. 4. Magnetické oxidy železa podle nároku 2, vyznačující se tím , že polysacharid použitý pro modifikavci je vybrán ze skupiny látek zahrnující xantáty celulózy, dextranu a amylosy.
5. 5. Magnetické oxidy železa podle nároku 3 vyznačující se tím , že polysacharid použitý pro modifikaci je vybrán ze skupiny přírodních polysacharidů zahrnující kyselinu alginovou, pektinovou, hyaluronovou, heparin.
6. 6. Magnetické oxidy železa podle nároku 3 vyznačující se tím „ že polysacharid použitý pro modifikaci je polysacharid s karboxylovými skupinami zavedenými modifikací zahrnující karboxymethyl celulózu a karboxymethyl dextran.
7. 7. Způsob přípravy magnetických oxidů podle bodu 1 vyznačený tím, že oxidy se sráží přebytkem báze, zejména amoniaku nebo NaOH -modifikace oxidů polysacharidem podle bodu 4 se provádí během srážení oxidů z roztoku obsahujícím Fe(lll) a M(ll), kde Me je Fe, Co, Cu, Mn v molárním poměru Fe(lll)/Me(ll) rovném 1,9 až 2,1 nebo modifikací hotové sraženiny magnetických oxidů roztokem polysacharidů podle bodu 4.
8. 8. Použití magnetických oxidů železa podle nároků 1. až 6. pro imobilizaci enzymů a dalších proteinů, zejména protilátek.
9. 9. Použití magnetických oxidů železa podle nároků 1.až 6. pro polymerázovou řetězovou reakci
10. 10. Použití magnetických oxidů železa podle nároků 1. až 6. pro izolaci DNA.