JPH02218691A - タンパク質の濃縮方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、一般に、所望のタンパク質を流体から濃縮す
る改良方法に関し、さらに詳しくは、金属膜を用いた限
外濾過により免疫グロブリンを流体から得る方法に関す
る。

（従来の技術および発明が解決しようとする課題）必要
な物質を必要でない物質から分離するための方法として
、濾過はよく用いられる方法である。

供給流がフィルターと接する場合に、通常２つのやり方
：デッドエンド（ｄｅａｄ　−ｅｎｄ）濾過およびクロ
スフロー（ｃｒｏｓｓ　Ｈｏｗ）濾過がある。デッドエ
ンド濾過においては、供給流はフィルター表面に垂直に
流れる。一方、クロスフロー濾過においては、供給流は
フィルターと平行に流れ、濾液はフィルターを通して拡
散していく。濾過に用いるフィルターは、しばしば、保
持されている粒子サイズにより分類される。たとえば、
膜マイクロフィルターは、一般に直径が０．１〜ｌＯミ
クロンの粒子を保持しており、限外濾過膜は、一般に１
．０００〜５００，０００ダルトン（直径約０．００１
〜０．０２ミクロン）の粒子および巨大分子を保持して
おり、超濾過フィルターは、一般に２００〜３００ダル
トンの分子を保持している。実験室においてはフィルタ
ーの選択は簡単であるが、工業的な応用にまでスケール
アップすると、しばしば数多くの困難が生じる。

理論上は、限外濾過によりタンパク質成分の選択的分離
、濃縮および精製かできなければならない。膜を通過し
た生成物は限外濾過液または［透過ｉｆｆｌ（ｐｅｒｍ
ｅａｔｅ）　Ｊとして知られ、保持され濃縮された生成
物は［保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）　Ｊとして知られ
ている。

実際上は、限外濾過は理想的な仮説に従って行えるわけ
ではない。たとえば、ホエーの限外濾過において、保持
液には比較的多くの食潰の脂肪、細菌および無機成分が
残留するため、理想的な限外濾過工程は込み入ったしの
となる。加えて、現在用いられている限外濾過膜のほと
んどは孔径が不定である。それらのカットオフ能は絶対
的に正確なわけではなく、理想的な等多孔質（１Ｓｏｐ
ｏｒｏｕｓ）膜に対応するわけでもない。さらに、限外
濾過膜の透過液流！（単位フィルター面積当たり、単位
時間当たりの生成物の容量）は、分極層の存在または膜
の汚損（ｆｏｕｌ　ｉｎｇ）により大きく影響される。

分極層は限外濾過の過程で形成され、膜を通した溶質の
移動を変化させて装置の透過速度を低下させ、分離特性
を変化させてしまう。分極は、膜を通過した対流により
引き起こされる。流体が膜を通って流れる速度の方が、
保持された物質が大量の流体中へ逆に拡散していく速度
よりも大きいときには、膜の隣に飽和層が形成される。

この層の深さおよび流れに対するその抵抗は、保持液が
循環している速度に依存する。操作中での膜の全透過率
は分極層の厚さに依存し、また分極層の構成成分の性質
にも依存する。汚損による抵抗は、化学的に膜に結合し
た析出物によるものである。

汚損は分極とは明らかに区別されるものであり、後者は
流体力学的（化学的でなく）力により膜に対して保持さ
れるものである。

濃縮物をさらに高度に精製するために、濾過の後かまた
は濾過とともに透析濾過（ｄｉａｒｉｌｔｒａｔｉｏｎ
）を行ってよい。この透析濾過は、タンパク質濃縮物を
洗浄し、さらに他の濾過に供するものである。

たとえば、透析濾過の間にタンパク質濃縮物を限外濾過
膜に接触させると同時に洗浄溶液（たとえば水溶液）と
も接触さける。透析濾過により保持液からの濾過し得る
成分が減少する。バッチ法（希釈した後に連続的に濃縮
する）であっても連続法（透過液が除かれるのと同じ速
度で水を加える）であってもよい。一般には精製度の高
いタンパク質濃縮物は透析濾過により得られる。

ロジ＋−（Ｒｏｇｅｒ）らの米国特許第４，４８５，０
４０号明細書は、ホエーからα−ラクトアルブミンに富
んだ生成物を得る方法に関する。該特許に開示された方
法では、まず６．３〜７のｐ　Ｉ−（，３０℃から６０
℃の温度にて分子量カットオフ値が５゜０００ダルトン
以上の膜を用い、低温殺菌していない未処理のホエーを
限外濾過することによりホエータンパク質を保持してい
る。ついで、この透過液に、α−ラクトアルブミンを保
持することかできカットオフ値が好ましくは５，０００
ダルトン未満の膜を用いた第二の限外濾過（好ましくは
透析濾過）を行い、第二の限外濾過の保持液を回収する
。この保持液は、所望のα−ラクトアルブミンに富んだ
生成物からなる。そのような方法はホエーからα−ラク
トアルブミンを分画すると報告されているが、ｐＨシフ
トを使用することなく、容易に汚損される中空糸膜によ
りそのようになると報告されているだけである。

コース（Ｋｏｔｈｅ）らの米国特許第４，６４４，０５
６号明細古は、乳汁免疫グロブリンまたは初乳免疫グロ
ブリンまたは両免疫グロブリンの溶液の調製方法に関す
る。開示された方法によれば、乳または初乳をｐＨ４，
０〜５．５の酸性にし、この流体を希釈し、希釈し酸性
にｊ７た流体を平均孔逢が０゜１〜１．２μ肩の濾過ユ
ニット中でのクロスフロー透析濾過に供する。この流体
の容量を、塩化ナトリウム溶液を加えることによりこの
最初の濾過を通じて一定に維持する。この最初の透析濾
過によりカゼインが保持され、透過液はすべてのホエー
タンパク質と低分子量成分を含有する透明な溶液である
。この低分子量成分は、ついで、平均孔径が５，０００
〜８０，０００ダルトン、好ましくはｉ　ｏ、ｏ　ｏ　
ｏダルトンの濾過ユニット中での第二のクロスフロー透
析濾過により第一の透過液から除かれる。この流体のｌ
）Ｈは４．０〜５．５に維持する。この第二のクロスフ
ロー透析濾過の保持液が、所望の免疫グロブリン生成物
を含む。そのような方法では、初乳または高度免疫孔か
ら免疫グロブリンが得られると報告されているが、この
結果は容易に汚損される中空糸膜により達成されたもの
であると報告されており、しかも得られた免疫グロブリ
ンは他のタンパク質成分と比べて富んではいない。中空
糸の欠点を克服するために透析濾過を大規模に使用する
試みがなされているか、そのために大規模な工業的応用
には実際的でなくなっている。

特開昭６０−２４８１５２は、強化用カルシウム塩の製
法およびその使用に関する。開示された方法によれば、
濃縮し酸性にした（５．０またはそれ以下にＩ）　Ｈを
調節）チーズホエーを限外濾過膜や電気透析膜のような
膜を通して濾過することにより、カル７ウムを溶液中の
イオン状態のままでリン酸イオンやクエン酸イオンとと
もに膜を通過させている。こうして得られた濾液にアル
カリ溶液を添加してｐ）（を６０〜９．０に調節するこ
とによりリン酸カルシウムおよびクエン酸カルシウムの
沈澱を生成させ、生成した沈澱は遠心分離に上り弔離す
る。しかしながら、この特許は流体中のタンパク質を富
まＵ゛濃縮る手段は開示していない トーマス（Ｔ　ｈｏｍａｓ）らの米国特許第４，７１６
゜０４４号明細市は、フルーツからジュースを得る改良
法に関する。開示された方法では、フルーツの流体ピユ
ーレおよびジュースを、食品グレード限外濾過膜、好ま
しくは内部表面に金属酸化物を析出させた金属酸化物膜
を有する剛性の多孔質管状ハウジングによる限外濾過に
一回供する。報告されているところによれば、−回の通
過の間に水溶性の糖分、有機酸、香味成分などが開示の
膜を通過するが、不溶性の固形分、分子ｍが約１４゜０
００以上のタンパク質、およびすべての微生物はフルー
ツ保持液中に保持される。この特許は流体中でタンパク
質の濃縮を起こさせる手段を開示しているが、限外濾過
およびｐ１■シフトにより流体中の特定のタンパク質画
分を富ませることは示唆していない。

トラルソン（Ｔ　ｒｕｌｓｏｎ）らの米国特許第３，９
７７．９’６７号明細書は、液体中に含まれる成分の濃
縮および分離のために使用する限外ＩＩＪ！過装置に関
する。報告されているところによれば、この開示された
装置は、複数の軸方向に配置された中空管状成分を含む
モジュールからなり、該管状成分は所定の多孔性を有し
、その内部表面または外部表面に前辺て生成した凝集無
機金属酸化物粒子の実質的に均一で連続的な付着性多孔
質コーティングを有している。開示された方法では、低
分子−爪溶解相は管壁を透過するか、直径の一層大きな
分子は液体中に保持されると報告されている。開示の好
ましい態様において、限外濾過装置」二にコーティング
される金属酸化物は酸化ジルコニウノ１、である。トラ
ルソンらは、大量の水、乳糖および溶解塩からコテージ
チーズのタンパク質画分を濃縮および分離するためにこ
の限外濾過装置を使用することができると報告している
。しかしながら、トラルソンらは、このタンパク質画分
の構成タンパク質を彼等の装置？こより濃縮および分離
できること、およびそのような濃縮および分離が流体を
限外濾過に供するときのＰＨを変えることにより達成で
きることについては示唆していない。

ジョンソン（Ｊ　ｏｈｎｓｏｎ）らの米国特許第３．４
３１．２０１号明細書は、水溶液中の溶質の濃度を減少
させるための改良された超濾過法に関する。

この改良方法では、供給水溶液を含水金属酸化物イオン
交換試薬と接触させ、供給溶液を含水金属酸化物の形態
の膜による超濾過に供する前に該含水金属酸化物膜に有
害なイオンを供給溶液から除く。このような妨害イオン
を除去することにより、この方法は膜の有用な耐用期間
を増加させ、供給溶液のｐＨを調節する方法を提供し、
膜形成物質を膜に加える方法を提供すると報告されてい
る。

ジョンソンらは、超濾過の間の含水性酸化ジルコニウム
による溶質の排除か、供給溶液のｐＨを変えて動的膜の
アニオン交換性能を増加することにより増加すると報告
している。ジョンソンら−は、ｐＨを変えることにより
荷電に基づいて分子を分離している。しかしながら、ジ
ョンソンらはサイズに基づいて成分を分離することは示
唆しておらず、そのような方法によれば流体のｐ）（を
変えることにより成分の何効な「透過率サイズ（ｐｅｒ
ｍｅａｂｉｌｉｔｙ　５ｉｚｅ）Ｊが調節されるのであ
る。

（課題を解決するための手段） 本発明は、流体から所望のタンパク質を濃縮し、異なる
サイズおよび／または等電点を有するタンパク質の濃度
に関して該所望のタンパク質を富ませる方法であって、 （ａ）選択したタンパク質の等電点未満のｐＨにて流体
を第一の金属酸化物限外濾過膜に導入することにより該
選択したタンパク質を含有する保持液を生成させ、 （ｂ）該選択したタンパク質の等電点以上のｐＨにて該
保持液を第二の限外濾過に供することにより該選択した
タンパク質を含有する透過液を生成させ、ついで （ｃ）該選択したタンパク質を含有する透過を回収する ことを特徴とする方法； 流体から所望のタンパク質を濃縮し、異なるサイズおよ
び／または等電点を有するタンパク質の濃度に関して該
所望のタンパク質を富ませる方法々あって、 （ａ）選択したタンパク質の等電点以上のｐＨにて流体
を第一の金属酸化物限外濾過膜に導入することにより該
選択したタンパク質を含有する透過液を生成させ、 （ｂ）該選択したタンパク質の等電点未満のｐＨにて該
浸透液を第二の限外濾過に供することにより該選択した
タンパク質を含有する保持液を生成させ、ついで （ｃ）該選択したタンパク質を含有する保持液を回収す
る ことを特徴とする方法： 流体から免疫グロブリンを濃縮し、異なるサイズおよび
／または等電点を有するタンパク質の濃度に関して該免
疫グロブリンを富ませる方法であって、 （ａ）選択した免疫グロブリンの等電点未満のｐ）Ｉに
て流体を第一の金属酸化物限外濾過膜に導入することに
より該免疫グロブリンを含有する保持液を生成させ、 （ｂ）該選択した免疫グロブリンの等電点以上のｐｌ−
１にて該保持液を第二の限外濾過に供することにより該
選択した免疫グロブリンを含有する透過液を生成させ、
ついで （ｃ）該選択した免疫グロブリンを含有する透過液を回
収する ことを特徴とする方法； 流体から免疫グロブリンを濃縮し、異なるサイズおよび
／または等電点を有するタンパク質の濃度に関して該免
疫グロブリンを富ませる方法であって、 （ａ）免疫グロブリンの等電点以上のｐＨにて流体を第
一の金属酸化物限外濾過膜に導入することにより該免疫
グロブリンを含有する透過液を生成させ、 （ｂ）該免疫グロブリンの等電点未満のｐ）Ｉにて該浸
透液を第二〇限外濾過に供することにより該免疫グロブ
リンを含有する保持液を生成させ、ついで （ｃ）該免疫グロブリンを含有する保持液を回収する ことを特徴とする方法； ホエーから免疫グロブリンを濃縮し、異なるサイズおよ
び／または等電点を有する他のタンパク質の濃度に関し
て該免疫グロブリンを富ませる方法であって、 （ａ）免疫グロブリンの等電点未満のＰＨである５゜０
のｐＨにて供給ホエーを、金属酸化物を剛性の多孔質表
面上に析出させな第一の金属酸化物限外濾過膜に導入す
ることにより該免疫グロブリンを含有する第一の保持液
を生成させ、 （ｂ）該第一の限外濾過のパラメーターにて該第一の保
持液を一定容爪の水を用いた限外濾過透析濾過し、その
際、該透析濾過に使用する水の容量は初期タンパク質溶
液の容量の約１　／　５であり、（ｃ）ｐＨが７．０に
等しい他は該第一の限外濾過のパラメーターにて該第一
の保持液を第二の限外濾過に供することにより該免疫グ
ロブリンを含有する透過液を生成させ、ついで （ｄ）該免疫グロブリンを含有する透過液を回収する ことを特徴とする方法を提供するものである。

本発明は、一般に、金属酸化物限外濾過膜およびｐｔ−
ｔシフトを用いることにより、種々のタンパク質を含有
する流体から所望のタンパク質を富ませ濃縮するための
限外濾過法に関する。本発明の方法では、２回の連続し
た限外濾過のために同じ限外濾過膜を用い、荷電ならび
にサイズに基づいて所望のタンパク質よりも低分子量ま
たは高分子量の物質を取り除くために、２回の連続した
限外濾過の間にｐＨをシフトさ口・る。第二の限外濾過
による分離を高めるために、所望のタンパク質を含有ケ
る画分の透析濾過を行って該両分を富ませることができ
る。さらに、第二の限外濾過のｐＨとは異なるｐＨにて
第三の限外濾過を行って所望のタンパク質をさらに富ま
せることらできる。

金属酸化物を剛性の多孔質表面上に析出させて金属酸化
物限外濾過膜を形成させ、水に対する膜の初期透過率（
Ｐ）が約０２４〜約３．６になるようにする。初期透過
率（Ｐ）は、下記式により決定される。

入り口圧力 （式中、透過液流量は、１時間当たりに１．ｔの膜を通
過した水のリットル数であり、入り口圧力は、キロパル
カルの単位で測定している）。水に対する膜の初期透過
液は、好ましくは約２．４である。

限外濾過膜によるタンパク質の濾過の間において、膜を
通過する生成物は限外濾過液または「透過液」として知
られる。保持された成分は、「保持液」またはタンパク
質濃縮液として知られる。

流体中の低分子爪成分または高分子量成分からタンパク
質を分画するために、約３４．５〜約１２．４２０キロ
パルカル、好ましくは約２０７〜約２７６キロパルカル
の入り口圧力、約２５．５〜約５０１２／１″／時、好
ましくは約３４Ｑ、７１８７時の剛性多孔質管の透過液
流量、４５Ｉ／秒に等しいかまたはそれ以上の循環流速
にて、該タンパク質を含有する保持液を生成するために
は該タンパク質の等電点未満のｐＨで、該タンパク質を
含有する透過液を生成するためには該タンパク質の等電
点以上のｐＨで流体を第一の金属酸化物限外濾過膜に導
入する。ここで等電点とは、溶液中での分子上の正味の
荷電が０になるｐｔｔを意味する。

第一の限外濾過の保持液が該タンパク質を含有している
ときは、このタンパク質含有保持液を、水溶液を一定容
積でまたは漸増添加して用いた透析濾過に供してらよく
、その際、透析濾過に用いる水溶液の容量は一般に最初
のタンパク質溶液の容量の約５％〜約１００％であって
、透析濾過保持液を得る。水ととらに生理食塩水および
５％ショ糖溶液が、透析濾過に使用するのに好ましい水
溶液である。透析濾過が望ましくないときは、ｐＨが所
望のタンパク質の等電点以上となるように調節されてい
る以外は第一の限外濾過と同じパラメーターにてこのタ
ンパク質含有保持液を第二の限外濾過に供し、該タンパ
ク質を含有する透過液を得る。ついで、このタンパク質
含有透過液を回収する。

第一の限外濾過の透過液が該タンパク質を含有している
ときは、このタンパク質含有透過液を、ｐＨが所望のタ
ンパク質の等電点未満となるように調節されている以外
は第一の限外濾過と同じパラメーターにてこのタンパク
質含有透過液を第二の限外濾過に供し、該タンパク質を
含有する保持液を得る。このタンパク質含有保持液を、
水溶液を一定容量またはバッチで用いた透析濾過に供し
てもよく、その際、透析濾過に用いる水溶液の容量は一
般に最初のタンパク質溶液の容量の約５％〜約１００％
であって、透析濾過保持液を得る。

水とともに生理食塩水および５％シジ糖溶液が、透析濾
過に使用するのに好ましい水溶液である。

ついで、このタンパク質含育保持液を回収する。

透析濾過が望ましくないときは、該タンパク質を含有す
る保持液を直接回収する。

本発明は、荷電およびサイズに基づき、流体を金属酸化
物膜で限外濾過し、ｐＨをシフトさせて所望のタンパク
質よりも低分子量および高分子量の成分を分画すること
により、特定のタンパク質に富んだ生成物を得る方法を
提供するらのである。

本発明の方法は、免疫グロブリン、特にＩｇＧを、乳、
チーズホエーまたは他の免疫グロブリン含ａ流体中に含
まれる他のタンパク質の大部分から分画することを可能
にするものであり、２つの因子すなわち、 り金属膜が、５４８またはそれ未満のｐＨではＩｇＧに
対する排除が大きいか、６．５またはそれ以上のｐＨで
はＩｇＧに対する排除がはるかに小さいこと、および ２）金属膜が、低分子量のタンパク質に対しては、たと
え非常に高濃度でもあらゆるｐＨにおいて継続的に通過
させるものであること が関与している。

以下、図面を参照しながら本発明をさらに詳しく説明す
る。

第１図は、本発明による装置の具体例を示す模式図であ
る。貯蔵器１０の排出口は、ライン１１によりコントロ
ールバルブ１２の導入口に接続されている。コントロー
ルバルブ１２の排出口は、ライン１３により１字型連接
部１４の導入口に接続されている。１字型連接部１４の
排出口は、ライン１６によりコントａ−ルバルブＩ７の
導入口に接続されている。コントロールバルブ１７の排
出口は、ライン１８により保持液回収貯蔵器１９の導入
口に接続されている。１字型貯蔵器１４の排出口は、ラ
イン１５によりポンプ２０の導入口に接続されている。

ポンプ２０の排出口は、ライン２１により１字型連接部
２２の導入口に接続されている。１字型連接部２２の排
出口は、ライン２３によりポンプ２４に接続されている
。ポンプ２４の排出口は、ライン２６によりモジュール
２７の導入口に接続されている。ライン２６には圧力計
２５が付いている。モジュール２７からの保持液排出口
は、ライン２８によりモジュール２９の入力口に接続さ
れている。モノニール２９からの保持液排出口は、ライ
ン３１により′ｒ字型連接部に接続されている。ライン
３１には圧力計３０が付いている。１字型連接部３２の
排出口は、ライン３４によりコントロールバルブ３５の
導入口に接続されている。１字型連接部３２の排出口は
、ライン３３により′ｒ字型連接部２２の導入口に接続
されている。コントロールバルブ３５の排出口は、ライ
ン３６により貯蔵器ＩＯの導入口に接続されている。貯
蔵器ＩＯへの流体の添加は、エントリーポート３７によ
り調節される。モジュール２９からの透過液排出口は、
ライン３８によりモジュール２７の外殻に接続されてい
る。モジュール２７からの透過液排出口は、ライン３９
によりコントロールバルブ４０に接続されている。コン
トロールバルブ４０の排出口は、ライン４１により透過
液貯蔵器４２に接続されている。

富ませ濃縮すべきタンパク質を含有する流体を、エント
リーボート３７を通して貯蔵器ＩＯに加える。一般に、
食品グレード酸、たとえばリン酸または酢酸をエントリ
ーボート３７を通して加えることにより、流体を該タン
パク質の等電点のＰＨ未満まで適当に酸性にする。酸性
化した後、隔膜陽性置換ポンプ（ｄｉａｐｈｒａｇｍ　
ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ｐｕｍ
ｐ）であるポンプ２０により、流体を貯蔵器ｌＯからラ
イン１１．コントロールバルブ１２およびライン１３．
１５を通してポンプで押し出す。

ポンプ２０は、限外濾過のための入り口圧力を生じさせ
る。流体はライン２１によりポンプ２０から出てゆき、
ライン２３を通ってＣ−１１４遠心分離ポンプであるポ
ンプ２４に入る。ポンプ２４は、ライン２６により限外
濾過モジュール２７゜２９まで流体を駆動する。流体の
入り口圧力は、圧力計２５により測定する。限外濾過モ
ジュール２７．２９（ライン２８により接続されている
）は、流体を保持液および透過液に分離する。モジュー
ル２９からの透過液は、透過液ライン３８を過つてモジ
ュール２７の外殻へ流れてゆく。この透過液は、ライン
３９によりモジュール２７からコントロールバルブ４０
を通って透過液回収貯蔵器４２中へ排出される。保持液
は、ライン３１を通ってモジュール２９を出てゆく。出
口圧力は、圧力計３０により測定される。保持液の一部
は、ライン３３により限外濾過モジュールまで直接戻さ
れて再循環する。保持液の残りは、ライン３４を通つり
、濃度調節バルブ３５を通って貯蔵器１０中へ流れてゆ
き、保持液の所望の濃度が達成されるまで再循環される
。濃縮後、保持液は貯蔵器ｌＯからライン１１を通り、
コントロールバルブ１２を通り過ぎてライン１３を通り
、Ｔ字型接続部１４へ流れてゆく。保Ｐｆ液は、この′
ｒ字型連接部１４を通ってライン１６へ流れてゆき、つ
いでコントロールバルブ１７を通って保持液回収貯蔵器
１９中へ流れてゆく。

つぎに実施例に基づいて本発明をさらに詳しく説明する
が、本発明はこれらに限られるものではない。

実施例１ チーズ製造工場から入手したチェダーチーズホエー出発
物質のタンパク質濃度およびタンパク質比（ＩｇＧに基
づいて）を第１表に示す。

ＬＣプロフィルを示す。１５倍濃縮後のタンパク質濃度
および比を第２表に示す。

第２図は、ホエー出発物質のＨＰ　Ｌ　Ｃプロフィルを
示す。食品グレードの酸を加えることによりホエーのＰ
）（を５．０に調節し、水に対する初期透過率２．５．
３６．７℃にてホエーをＣＡＲＲＥＢＩＯ−Ｉ　　Ｃｌ
−２００膜（カール（ＣＡＲＲＥ。

Ｉｎｃ、、）、セネカ、サウスカロライナ、から人手可
能）に通すことにより１５倍に濃縮した。透過液流量ハ
、最初＋１５０　、９　（１／Ｒ”／時、１５倍濃縮後
は３４Ｑ／ｘ″／時であった。入り口圧力は２０７キロ
パルカル、流体の循環速度は６　、１　ｘ／秒であった
。第３図は、１５倍濃縮後のホエーのＨＰ第一の層線に
よりタンパク質比はＩｇＧに資料なように有意に改善さ
れ、ＩｇＧの保持液中への回収は１００％近かった。Ｉ
ｇＧとβ−ラクトグ〔１プリンとの比は、ｌ：９．ｏか
ら１：５．Ｌにシフトシた。プロフィルからはまた、ペ
プチドがほとんと除去され、［ｇＧに対するα−ラクト
アルブミンの比も非常に大きく減少したことがわかった
。

ついで、最初のホエーの重量の１１５の量の水（４°な
わち１８．９ｋｇ）を用い、パラメーターはすべて同じ
ままに保持しながらｐＨ５，０にてＣＡ　ＲＲＥ　ＢＩ
Ｏ−Ｉ　　Ｃｌ−２００膜で濃縮物を透析濾過すること
により、ＩｇＧをさらに富ませた。

透析濾過し最初のホエーに比べて２．２倍の濃度に希釈
した後のタンパク質濃度および比を第３表に示す。

第４図のＨＰＬＣは、透析濾過後のＩｇＧｍ縮物におい
て最初のホエーからの全１ｇＧの回収が９６％であった
（すなわち、０．６１肩９／酎を２゜２で除すると０　
、２８　＊９／ｘ（ｌになる）ことを示している。Ｉｇ
Ｇよりも分子量の大きい化合物も同様に濃縮されたので
、ボイド容量ピークは第２図から第４図へ大きく増加し
た。

ＩｇＧを他のホエータンパク質から分画した後に残留し
ている分子量の大きい化合物の除去は、Ｎ　ａ　ＯＨの
ような食品グレード塩基を加えることによりホエー濃縮
物のｐＨを７．０に調節し、たとえばｐＨ１ｌの次亜塩
素酸アルカリついでｐＨ２の硝酸／リン酸溶液を用いて
管を清浄にし水で濯いだ後、すべて同じパラメーターに
て最初の工程に用いたのと同じＣＡ１１ｒｌＥ　ＢＩＯ
−Ｉ　　Ｃｌ−２００膜に上記ホエー濃縮物を通すこと
により行った。この限外濾過により、カゼインミセル、
脂肪小球および細菌のような大きな粒状物質が除かれた
が、ＩｇＧの９０％は透過液中に通過した。こうして得
られた透過液は、Ｉｇｃに富んだ無色透明でほとんど滅
菌された溶液であった。第二の透過液のタンパク質濃度
および比を第４表に示す。

第５図は最後の透過液のＨＰＬＣプロフィルである。細
菌細胞数は７　、３　ｌｏｇｓまで減少し、標争細菌フ
ィルターを用いてａＩ＆を容易かつ効果的に洗練させて
（ｐｏｔ　１ｓｈｅｄ）最終的な滅菌生成物とすること
ができた。

重量濃度比（ｗｅｉｇｈｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏ
ｎ　ｒａｔｉｏ；ＷＣＲ）は、収率の計算方法である。

これは、限外濾過膜に１回通した後の物質の重量に対す
る出発物質の重量の比を計算することにより決定される
。

タンパク質濃度係数（ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｎｃｅｎｔ
ｒａｔｉｏｎ　ｒａｃｔｏｒ；ＰＣＦ）は、特定のタン
パク質の濃度を決定し、その数字を供給ホエー中の最初
の濃度で除することにより計算される。タンパク質の１
００％保持は、タンパク質鼎度係数が重量６度比と等し
いときに得られる。第８図、第９図および第１Ｏ図は、
種々のｐＨにおける重量濃度比（ＷＣＩｌ値）に対して
ホエー中の４種のタンパク質のタンパク質蟲度係数（Ｐ
ＣＦ値）を示すグラフである。αラクトアルブミンはＯ
で、β−ラクトグロブリンは口で、ウシ血清アルブミン
（Ｂ　Ｓ　Ａ）は◇で、ＩｇＧは△で表しである。

第８図および第１θ図を分析すると、それぞれｐＨ５，
０およびｐ）１６　、５においてＩｇＧとｌ３ＳＡとは
同じＰＣＦ’値を有することがわかる。このことは、こ
れらのｐＨ値においては、本発明により開示した限外濾
過法により１回だけ通過させてもＩｇＧをＢＳＡから分
離することはできないことを示している。しかしながら
、第９図を分析すると、ＩｇＧのＰＣＦ’値が約７．５
であるのに対しＢＳＡのＰＣＦ値は約６．５であるのが
わかる。このことは、ｐＨ＝５．５にて本発明により開
示された限外濾過法により１回通過させろことによって
ＩｇＧを［３Ｓ八から分離することができることを示し
ている。

透過液流量に関して最大の性能を維持するために膜を清
浄にして最初の水透過性に戻しておくことは、あらゆる
膜力法において重要なことである。

本明細書に開示した方法においても、清浄にしてお（こ
とは分離能を維持するために同様に重要である。このこ
とは、大部分、分離するために荷電に依存していること
によるものである。

Ｒ＃１ｆ；漬物（主としてタンパクｌＲ）および無機汚
損物の両方とも乳およびホエー中に豊富に存在し、膜透
過率を有意に変え得る。高速度および低圧力という作動
パラメーターは、非常に高い容量回収または濃縮におい
ても、定常流量および連続的なタンパク質の通過により
示されるようにタンパク質の汚損を最小にする。しかし
ながら、膜をしかるべく清浄にしないと充分な分離がで
きなくなる。

酸洗浄は、分離能を維持するとともに膜透過性を回復す
ることがわかっている。好ましい市販の洗浄液は、ヘン
ケル社（１−Ｉｅｎｋｅｌ　Ｃｏｒｐ、、；バーリント
ン、アイオワ）から入手可能なＵＲＡＣＩ　Ｌ７５であ
る。この酸洗浄液は、限外濾過膜の作動パラメーターに
て膜に暴露しなければならない。

他の重要な清浄方法は、酸および塩基の両方の清浄の間
にバックフロー（ｂａｃｋ　ｆｌｏｗ）を用いることで
ある。典型的なホエー操作の後、酸および塩基の両清浄
の間にバックフローを用いることにより水に対する透過
性が８〜６９％増加することが清浄の研究においてわか
っている。他の清浄研究において、バックフローするこ
となく先に塩基／酸清浄サイクルを何回か行った後であ
ってもバックフローを行うと水透過性に直ちに改善がみ
られｔこ。

それゆえ、塩基および酸の両清浄工程においてバックフ
ローを行うことが推奨される。

実施例２ 卵黄を水で希釈して重量−重量ベースで水と比較して５
％の卵黄を含有する溶液を得た。第６図は、卵黄出発物
質のＨＰ　Ｌ　Ｃプロフィルを示す。

ビーク３は、保持時間に基づいてＩｇＧと同定された。

ビーク２と３は充分に分離されないので、ビーク２もま
たＩｇＧであるかもしれない。リン酸を加えることによ
り卵黄溶液のｐＨを５．０に調節し、この卵黄溶液（７
５，５ρ）を初期水透過率２゜５で３６．７℃にてＣＡ
ＲＲＥ　Ｃ１−２００膜に通ずことにより１０倍に濃縮
した。入り口圧力は２０７キロパルカル、流体の循環速
度は６　、　Ｉ　ＩＩ／秒であった。第７図は、１０倍
濃縮後の卵黄溶液のＩ−Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃプロフィルを示
す。ビーク１，２および３はビーク４〜８に比べて増加
しており、ｔｇＧが濃縮されたことを示しているが、一
方、低分子飛のタンパク質の濃度は急激に減少した。本
実施例は、本発明により開示された方法により他の流体
も濃縮し富ませることができることを示唆している。

実施例３ 血清を水で希釈して２Ｘ希釈液を得た。リン酸を加える
ことによりこの血清溶液のｐｉ−（を５，０に調節し、
この血清溶液（７５，５１２）を初期水透過率２．５に
て３６．７℃でＣＡＲＲＥ　Ｃｌ−２，００膜に通すこ
とにより２０倍に濃縮した。透過液流攬は３２．２℃で
３０．５であり、入り口圧力は２０７キロパスカル、流
体の循環速度は６　、、　ｌ　ｍ／秒であった。上記限
外濾過装置を用いてもＢＳＡはＩｇＧから分離されなか
ったが、ｐＨ７，０でＩｇＧとＢＳＡのあるフラクショ
ンが観察された。加えて、第８図、第９図および第１θ
図に示した結果は、ｐＨ５，５での限外濾過によりＢＳ
ＡとＩｇＧの分離がなされたことを示している。

上記のように驚くべき結果をらたらすことかわかった限
外濾過システムは、ガディス（Ｇａｄｄｉｓ）らの米国
特許第４，２００，５３３号明細書に一般的に記載され
ており、ガディスらの米国特許第４゜７６２．６１９号
明細書にさらに詳しく記載されている。しかしながら、
本発明の目的のために必要な、システムのある種の特定
のパラメーター自体に関しては特に記載はない。特に、
本発明によれば、食品グレードの二酸化チタンを析出さ
せる支持体は、ある種の工程条件（たとえば、温度や圧
力のような、通常は悪影響を与えるかまたは全く適さな
いものとする条件）またはある種の清浄条件（たとえば
、酸または塩基洗浄）についての懸念を軽減させるため
に、焼結ステンレス鋼のような剛性の多孔質表面である
のが好ましい。本発明に使用する二酸化チタンコーティ
ングＣｌ−２００膜およびＢＩＯ−Ｉ　　Ｃｌ−２００
膜は、カール社（セネカ、サウスカロライナ）から入手
可能である。未だ試験していない修飾Ｂ１０−Ｉ　　Ｃ
１−２００膜もまた、溶液中の他のタンパク質から所望
のタンパク質を濃縮し富ませるのに有用であることがわ
かるであろう。カール社から人手できるような、この膜
をさらに修飾したものも本発明の範囲に含まれる。セラ
ミック物質からなる多孔質表面もまた、食品グレードの
金属酸化物膜の支持体として機能し得ることが期待され
る。

上記以外の他の生物学的流体、たとえば脱脂乳、全乳、
初乳、初乳ホエー、全血、組織培養液または発酵ブロー
スからのタンパク質もまた、本発明の方法を用いること
により濃縮し富ませることができることが期待される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の方法を行うのに有用な装置の具体例
を示す模式図、 第２図は、最初の供給ホエーのタンパク質プロフィルを
示す高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の結果を
示すグラフ、 第３図は、ｐＨｓ、ｏで限外濾過することにより１５倍
に濃縮した後の供給ホエーの保持液のタンパク質プロフ
ィルを示すｔ−ｉ　ｐ　ｔ、　ｃの結果を示すグラフ、 第４図は、最初のホエー容量の１１５に等しい容量の水
で透析濾過した後の供給ホエーの保持液のタンパク質プ
ロフィルを示すＨＰＬＣの結果を示すグラフ、 第５図は、ｐＨ７、０で限外濾過した後の供給ホエーの
透過液のタンパク質プロフィルを示すＨＰＬＣの結果を
示すグラフ、 第６図は、最初の供給卵黄のタンパク質プロフィルを示
す）［Ｐ　Ｌ　Ｃの結果を示すグラフ、第７図は、Ｐ）
１５　、０にて限外濾過により１０倍に濃縮した後の供
給卵黄の保持液のタンパク質プロフィルを示すＨＰＬＣ
の結果を示すグラフ、第８図は、ｐｉ−Ｉ５．０におけ
るホエー中の４つのタンパク質（免疫グロブリン、ウシ
血清アルブミン、β−ラクトグロブリンおよびα−ラク
トアルブミン）の重量濃度比に対するタンパク質濃度係
数を示すグラフ、 第９図は、ｐＨ５，５におけるホエー中の４つのタンパ
ク質（免疫グロブリン、ウシ血清アルブミン、β−ラク
トグロブリンおよびα−ラクトアルブミン）の重量濃度
比に対するタンパク質濃度係数を示すグラフ、 第１Ｏ図は、ｐＨ６，５におけるホエー中の４つのタン
パク質（免疫グロブリン、ウシ血清アルブミン、β−ラ
クトグロブリンおよびα−ラクトアルブミン）の重量濃
度比に対するタンパク質濃度係数を示すグラフである。 図面の浄書（内容に変更なり

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）流体から所望のタンパク質を濃縮し、異なるサイ
   ズおよび／または等電点を有するタンパク質の濃度に関
   して該所望のタンパク質を富ませる方法であって、 （ａ）選択したタンパク質の等電点未満のｐＨにて流体
   を第一の金属酸化物限外濾過膜に導入することにより該
   選択したタンパク質を含有する保持液を生成させ、 （ｂ）該選択したタンパク質の等電点以上のｐＨにて該
   保持液を第二の限外濾過に供することにより該選択した
   タンパク質を含有する透過液を生成させ、ついで （ｃ）該選択したタンパク質を含有する透過液を回収す
   る ことを特徴とする方法。
2. （２）流体から所望のタンパク質を濃縮し、異なるサイ
   ズおよび／または等電点を有するタンパク質の濃度に関
   して該所望のタンパク質を富ませる方法であって、 （ａ）選択したタンパク質の等電点以上のｐＨにて流体
   を第一の金属酸化物限外濾過膜に導入することにより該
   選択したタンパク質を含有する透過液を生成させ、 （ｂ）該選択したタンパク質の等電点未満のｐＨにて該
   浸透液を第二の限外濾過に供することにより該選択した
   タンパク質を含有する保持液を生成させ、ついで （ｃ）該選択したタンパク質を含有する保持液を回収す
   る ことを特徴とする方法。
3. （３）流体から免疫グロブリンを濃縮し、異なるサイズ
   および／または等電点を有するタンパク質の濃度に関し
   て該免疫グロブリンを富ませる方法であって、 （ａ）選択した免疫グロブリンの等電点未満のｐＨにて
   流体を第一の金属酸化物限外濾過膜に導入することによ
   り該免疫グロブリンを含有する保持液を生成させ、 （ｂ）該選択した免疫グロブリンの等電点以上のｐＨに
   て該保持液を第二の限外濾過に供することにより該選択
   した免疫グロブリンを含有する透過液を生成させ、つい
   で （ｃ）該選択した免疫グロブリンを含有する透過液を回
   収する ことを特徴とする方法。
4. （４）導入工程（ａ）が、約０．２４〜約３．６の水に
   対する初期透過率、約３４．５〜約１２，２４０キロパ
   スカルの入り口圧力、約２５．５〜約５１ｌ／ｍ＾２／
   時の透過液流量、および４．５ｍ／秒に等しいかまたは
   それ以上の循環流速にて流体を金属酸化物限外濾過膜に
   さらす工程からなり、供する工程（ｂ）が、約０．２４
   〜約３．６の水に対する初期透過率、約３４．５〜約１
   ２，２４０キロパスカルの入り口圧力、約２５．５〜約
   ５１ｌ／ｍ＾２／時の透過液流量、および４．５ｍ／秒
   に等しいかまたはそれ以上の循環流速にて流体を金属酸
   化物限外濾過膜により濾過する工程からなる請求項（１
   ）記載の方法。
5. （５）流体から免疫グロブリンを濃縮し、異なるサイズ
   および／または等電点を有するタンパク質の濃度に関し
   て該免疫グロブリンを富ませる方法であって、 （ａ）免疫グロブリンの等電点以上のｐＨにて流体を第
   一の金属酸化物限外濾過膜に導入することにより該免疫
   グロブリンを含有する透過液を生成させ、 （ｂ）該免疫グロブリンの等電点未満のｐＨにて該浸透
   液を第二の限外濾過に供することにより該免疫グロブリ
   ンを含有する保持液を生成させ、ついで （ｃ）該免疫グロブリンを含有する保持液を回収する ことを特徴とする方法。
6. （６）導入工程（ａ）が、約０．２４〜約３．６の水に
   対する初期透過率、約３４．５〜約１２，２４０キロパ
   スカルの入り口圧力、約２５．５〜約５１ｌ／ｍ＾２／
   時の透過液流量、および４．５ｍ／秒に等しいかまたは
   それ以上の循環流速にて流体を金属酸化物限外濾過膜に
   さらす工程からなり、供する工程（ｂ）が、約０．２４
   〜約３．６の水に対する初期透過率、約３４．５〜約１
   ２，２４０キロパスカルの入り口圧力、約２５．５〜約
   ５１ｌ／ｍ＾２／時の透過液流量、および４．５ｍ／秒
   に等しいかまたはそれ以上の循環流速にて流体を金属酸
   化物限外濾過膜により濾過する工程からなる請求項（５
   ）記載の方法。
7. （７）ホエーから免疫グロブリンを濃縮し、異なるサイ
   ズおよび／または等電点を有する他のタンパク質の濃度
   に関して該免疫グロブリンを富ませる方法であって、 （ａ）免疫グロブリンの等電点未満のｐＨである５．０
   のｐＨにて供給ホエーを、金属酸化物を剛性の多孔質表
   面上に析出させた第一の金属酸化物限外濾過膜に導入す
   ることにより該免疫グロブリンを含有する第一の保持液
   を生成させ、 （ｂ）該第一の限外濾過のパラメーターにて該第一の保
   持液を一定容量の水を用いた限外濾過透析濾過し、その
   際、該透析濾過に使用する水の容量は初期タンパク質溶
   液の容量の約１／５であり、（ｃ）ｐＨが７．０に等し
   い他は該第一の限外濾過のパラメーターにて該第一の保
   持液を第二の限外濾過に供することにより該免疫グロブ
   リンを含有する透過液を生成させ、ついで （ｄ）該免疫グロブリンを含有する透過液を回収する ことを特徴とする方法。
8. （８）金属酸化物の析出前の剛性の多孔質表面が、約２
   〜約５ミクロンの孔径を有する請求項（７）記載の方法
   。
9. （９）導入工程（ａ）が、水に対する初期透過率２．５
   、入り口圧力２０７キロパスカル、透過液流量５０．９
   〜３４ｌ／ｍ＾２／時、および循環流速６．１ｍ／秒に
   てホエーを金属酸化物限外濾過膜にさらす工程からなる
   請求項（８）記載の方法。