JPH02186999A - 膵リパーゼの活性測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、主として臨床検査の分野における膵リパーゼ
の活性測定法に関する。

膵リパーゼは、トリグリセライドのα−グリセライド結
合を加水分解する酵素（ＥＣ，３，１，１３、）である
ことが知られている。

膵リパーゼは、膵臓の腺房細胞から分泌され、膵管を通
り十二指腸に排せつされて、脂肪消化作用を示す。臨床
的には、膵炎や膵癌等の膵疾患が起こると、膵腺房細胞
の破壊、膵管の狭窄や閉塞などによって膵リパーゼが血
中に逸脱し、血清中のリパーゼ活性値の上昇がみられる
。膵疾患により血中のアミラーゼ活性も上昇するが、膵
に特異性の高いリパーゼの活性の測定が、膵疾患の診断
にはより有用な指標になると言われている。

［従来の技術］ 従来よりリパーゼの活性測定法には種々の方法が知られ
ている。例えば、乳化オリーブ油を基質とし、リパーゼ
の作用により遊離する脂肪酸をアルカリ滴定する方法や
、ｐｆ−１’−５ｔａｔを用いる方法、銅錯塩抽出法な
どがあるが、これらの方法はいずれら感度が低く、操作
ら困難である。

現在では、乳化オリーブ油を基質として、リパーゼの作
用によって減少する基質の濁度を測定する比濁法がよく
用いられている。この方法は、比較的簡単な操作で測定
ができるが、吸光度の差がわずかなため、充分な感度が
得られない。また、濁度の低下は、リパーゼ活性によっ
てのみもたらされるとも限らない。更に、均一で安定し
た粒子の乳化オリーブ油の調製が困難であるという問題
も解消されていない。

種々の合成基質を用いるリパーゼ活性測定法も報告され
ているが、血清中の各種エステラーゼの影響を少なから
ず受けるため、特異性に問題がある。

基質としてジグリセライドを用い、生成するモノグリセ
ラードにモノグリセラードリパーゼを作用させて膵リパ
ーゼ活性を測定する方法が、特開昭６３−２４５６７２
号に報告されている。しかしながら、基質としては、膵
リパーゼの本来の基質であるトリグリセライドを使用す
ることが望ましいと考えられる。

［発明か解決しようとする課題］ 本発明の目的は、従来の膵リパーゼの活性測定法の問題
点を解決し、臨床検査の分野で有用な膵リパーゼの活性
測定法を提供することにある。具体的には、膵リパーゼ
の最適の基質である長鎖脂肪酸トリグリセライドを基質
として用い、加水分解により生成するグリセロールを例
えば発色反応により検出することによって、各種エステ
ラーゼの妨害を受けることなく、高感度かつ簡便に膵リ
パーゼ活性を／Ａ１１定する方法を提供することである
。

し課題を解決するための手段］ 本発明者らは、基質としてトリグリセライドを用いて、
これに膵リパーゼを作用させ、加水分解により生成する
ジグリセライドを、ジグリセライドリパーゼによりモノ
グリセラードを経てグリセロールにまで加水分解し、グ
リセロールを従来の検出系で測定することによって前述
の目的が達成されることを見い出した。

従って、本発明は、試料中の膵リパーゼの活性を測定す
る方法であって、 基質としてのトリグリセライド、 ジグリセライドおよびモノグリセラードに作用し、トリ
グリセライドには作用しないジグリセライドリパーゼ、
並びに グリセロールの検出系 を含有する試薬と試料とを反応させることを含んで成る
方法に関する。

本発明において基質として使用するトリグリセライドは
、好ましくは膵リパーゼの本来の基質である長鎖脂肪酸
トリグリセライド、例えばリルン酸、リノー・ル酸、オ
レイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸
、ラウリン酸、カプリン酸、カプロン酸等の長鎖脂肪酸
のグリセライドか挙げられる。

本発明に用いる、ジグリセライドおよびモノグリセラー
ドに作用し、トリグリセライドには作用しないジグリセ
ライドリパーゼについては、本発明の目的が達成できる
ものであれば、特に制限されることばない。

一例として次のようなエステル化反応における性質を有
するジグリセライドリパーゼをあげることができる。

■生産菌：ベニシリウム（Ｐ　ｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）
ＳＰ。

■分子ｆｆミニ４０，０００±４，０００■至適ｐト１
　：　＋）Ｔ（５付近 ■至ＪＩ！温度：３０℃付近 ■Ｉ）Ｈ安定性：ｐＨ５，０〜７．０（３５℃で３０分
間処理） ■熱安定性：４０°Ｃまで安定（ｐＨ５，６で５分間処
理） ■等電点：ｐ８４．４±０．４ グリセロールの定量は、水元°明の目的が達成できるも
のであればどのような方法で行ってもよい。

例えば、グリセロールキナーゼ（ＧＫ）、グリセロール
ホスフェートオキシダーゼ（Ｇ　Ｐ　Ｏ）、パーオキシ
ダーゼ（ＰＯＤ）の各酵素を共役させた検出系を用い、
生成するキノン色素を比色定量することができる。グリ
セロール脱水素酵素（ＧＤＨ）を用いた反応系を用いる
こともできる。

本発明の一態様においては、次のように表される反応原
理に基づいて測定を行う ジグリセライド＋脂肪酸 モノグリセラード＋脂肪酸 グリセロール＋脂肪酸 グリセロール−３リン酸＋ＡＤＰ ジヒドロキシアセトンリン酸十Ｈｔ　Ｏｔ２ＨｔＯ，＋
４アミノアンチピリン＋ＴＯＯ８［ＴＯＯ８：Ｎ−エチ
ル−Ｎ−（２−ヒドロキシ３−スルホプロピル）１「ア
ニシジン］［作用コ 本発明の膵リパーゼ活性測定方法によれば、膵リパーゼ
の本来の基質であるトリグリセライドを基質として使用
し、既知の発色反応を検出系として利用して、簡便に感
度良く測定でき、自動分析ら可能であるので、本発明方
法は臨床検査の分野において非常に有用である。

［実施例Ｊ 実施例１ 次の組成の試薬液を調製したニ トリグリセライド　　　　　　　　０．４ｍＭジグリセ
ライドリパーゼ　　　　１単位／ｍＱＡＴＰ　　　　　
　　　　　　　　　１ｍＭＧ　Ｋ　　　　　　　　　　
　　　　０　、５　Ｑｉ位／ｍＱＧＰ０　　　　　　　
　　　　　３０単位／ｆｆ＆４−アミノアンチピリン　
　　　２ｍＭＴＯＯ８１ｍＭ ＰＯＤ　　　　　　　　　　　　　２単位／ｍＱ塩化マ
グネシウム　　　　　　　　１ｍＭ非イオン界面活性剤
　　　　　　０．１５％コリパーゼ　　　　　　　　　
　６００単位／Ｍ（ＩＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７，５）
　　　５０ｍＭ［ＰＩＰＥＳ−ピベラノンーＮ　、Ｎ　
’−ビス（２−エタンスルホン酸）］ 上記試薬液３．０　ｍＱを３７°Ｃに予備加温し、これ
に人血清試料２０μｇを加えて混合し、波長５５０ｎｍ
での吸光度を連続的に測定し、吸光度変化亀を求めた。

そして標準液の測定値から膵リパーゼの活性値を算出し
た。人血清試料１０例についての測定結果を次長に示す
。

実施例２ 人血ｌ＃試料３０例について、本発明の実施例１に従っ
て測定を行った。更に同じ試料について、国際試薬（株
）製「リパーゼ測定用試薬」を用い、トリオレインを基
質として従来の比濁法による測定をも行った。これらの
方法により得られた結果の相関係数はγ−０，９４８と
なり、よく相関することがわかった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、試料中の膵リパーゼの活性を測定する方法であって
   、 基質としてのトリグリセライド、 ジグリセライドおよびモノグリセラードに作用し、トリ
   グリセライドには作用しないジグリセライドリパーゼ、
   並びに グリセロールの検出系 を含有する試薬と試料とを反応させることを含んで成る
   方法。