JPH021807B2 - - Google Patents
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Description
狂犬病に対して免疫化するための不活化ワクチ
ンおよび生ワクチンは既に知られている。不活化
狂犬病ワクチンは感染動物（例えば兎および羊）
のビールス含有中枢神経組織懸濁液または感染家
鴨胚懸濁液よりなる。この種のワクチンには、異
種蛋白を多量に含有するために注射部位にのみな
らず全身的に望ましくない副反応を生じるという
欠点が伴なう。中枢神経組織よりなる狂犬病ワク
チンを人に用いる場合は、それ以外に残留障害を
伴なう神経合併症を生じることがあり、特に充分
な狂犬病防護処置には数多くの注射が必要であ
る。人の場合と同様な副反応は動物の場合にもみ
とめられている。 幼若ハムスター腎臓の細胞系統、例えば
BHK21−細胞よりなる細胞培養、NIL−細胞、
ハムスター腎臓の原始細胞（Primary cell）、ま
たは鶏胚線維芽細胞中で狂犬病ビールスを増殖さ
せ、それよりその動物のための不活化ワクチンを
調製する試みも既に行われている。動物用狂犬病
生ワクチンの調製には豚またはハムスターの腎臓
の原始細胞または犬または牛腎細胞の細胞系統が
用いられた。しかしながらその場合には、中枢神
経材料を用いた場合に得られるようなビールス濃
度は得られなかつた。しかしながら有効な狂犬病
ワクチン、特に不活化ワクチンにとつてビールス
力価が十分高いことは前提要件である。更にま
た、使用した細胞によつては悪性腫瘍を生じると
いう欠点を伴なう。 細胞培養でビールスを増殖させる際に血清を用
いると高濃度のビールスが得られるが、その異種
血清のために望ましくない抗体が形成されてしま
うのでその使用は禁止されている。従つて製造方
法にビールス含有液濃縮工程、例えば沈殿、遠心
分離または限外過などの工程を設ける手段を講
じているが、これらの手段は製造方法をより困難
でよりコスト高にするものである。 鶏胚線維芽細胞を用いた場合、動物用試験ワク
チンのピーク力価は105.0〜106.0PFU／ml（プラ
ーク形成単位／ml）また6.1×106幼若マウス
LD50／ml（LD＝致死量）であることが記載され
ており、この大きさの力価では十分な免疫の保証
は全く得られない。 本発明者は、狂犬病ビールスを原始鶏胚線維芽
細胞に適応せしめ且つ該適応後原始鶏胚線維芽細
胞中で増殖させることによる狂犬病ワクチンの製
造にあたり、狂犬病ビールスを前記適応化時には
10-1〜10-5の範囲で段階的に増大する希釈度で、
そして前記増殖時には10-2〜10-5の希釈度で増殖
培養物の接種に用いることを特徴とする製造方法
を見出した。 好ましい一実施形式では30〜38℃、好ましくは
32〜37℃の温度で操作が行われる。 この方法には、狂犬病ビールスワクチン製造に
通常用いられるあらゆる狂犬病種が適しており、
例えば狂犬病ビールス株Fluly、LEPおよび
Flury HEP、狂犬病ビールス固定（fixe）株パ
スツールおよびPM株（PM＝Pitman−Moore）
などが挙げられる。 線維芽細胞用鶏胚は低廉且つ容易に入手でき、
また良好な細胞収率を与える。人に用いるための
狂犬病ワクチンにはいわゆるSPF卵からの鶏胚を
用いるのが好ましい。SPF卵とは、特にこの目的
に適合した養鶏場で特異的に病原体不含に飼育さ
れ且つ保存されている鶏の卵である。SPF卵の組
識培養は、通常の養鶏の卵にみられた望ましくな
い汚染ビールス例えば感染性滑液嚢炎のビール
ス、感染性喉頭気管炎のビールス、Ａ型インフル
エンザのビールス、鳥痘瘡のビールス、鳥脳脊髄
炎のビールス、封入小体肝炎のビールス、感染性
気管支カタルのビールス、鳥白血球病のビール
ス、マレツク病のビールス、ニユーカツスル病の
ビールス、鳥レオビールス、鳥アデノビールス、
ミコプラスマ・ガリセプチクム（Mycoplasma
galliseptioum）、ミコプラズマ・シノビアエ
（Mycoplasma synoviae）およびサルモネラ・プ
ロルム（Salmonella pullorum）を含有していな
い。人に適用するための狂犬病ワクチンの製造に
鶏胚線維芽細胞を利用することは新規であり、ま
たこれまで報告された例はない。 本発明による狂犬病ワクチン製造においては、
狂犬病ビールスを原始鶏胚線維芽細胞に適応さ
せ、その適応させたビールスを原始鶏胚線維芽細
胞中で増殖させ、そしてビールス含有懸濁液を、
場合により既知の方法により不活化した後、ワク
チンに仕上げる。本発明により適応させた狂犬病
ビールスによつてのみ、ビールス増殖の際、有用
な狂犬病ワクチンを調製し得るに十分なビールス
濃度を達成することができる。 出発材料としては、ビールスを含有する哺乳動
物の脳、例えばVP11株またはパスツール株また
はPM株、または鶏胚ホモジエネート、例えば
Flury LEP株またはFlury HEP株などを用いる
のが好ましく、そしてそれを単層状態の原始鶏胚
線維芽細胞に載置する。 従来技術に従い、なるべく多数の細胞を感染す
るために未希釈のビールス材料を感染させた場合
には少数の細胞しか定着せず、次の継代接種では
感染した細胞の数は不変であるかまたは低下さえ
もする。その細胞へのビールスの適応は起らず、
この方法では達成することはできない。 これに対して、継代接種に用いられるビールス
含有懸濁液を10-1〜10-4に希釈した場合には狂犬
病ワクチンの製造に適した狂犬病ビールスを得る
ことができる。ある一つの希釈度から次に高い希
釈度への移行にとつて決定的なのは、前の代にお
けるビールスの増殖動力学（カイネチツク）であ
る。ビールス株は10-2の希釈度において既に十分
増殖し得るので、まず継代接種は希釈度10-1およ
び10-2の出発材料を用いて行われる。 ビールス増殖を制御するために、同様に処理し
且つ感染させたカバーガラス培養をLeighton小
管中で並行して行う。そのカバーガラス培養物を
螢光標識した抗狂犬病ガンマグロブリンで染色す
ればその染色標本を螢光顕微鏡で観察評価するこ
とができ、そして狂犬病ビールスに感染した細胞
の百分率から増殖動力学を推論することができ
る。細胞のビールス定着を毎日追跡できるように
十分な数の対照を調製する。各々の読取りには１
〜２個の小管が必要である。 最初はビールスが細胞になかなか定着しなくて
も、本発明により処理すれば継代接種の過程で定
着は増大する。 継代接種の際３〜４日で100％の細胞がビール
スに感染したら、10-2または10-3の希釈度、次い
で（必要ならば）10-4の希釈度に移す。より高い
希釈率に移すに伴ない、100％ビールス定着細胞
層におけるビールス力価も継代接種の過程で増大
する。 最後の継代接種のビールス含有懸濁液をワクチ
ン製造におけるビールス増殖用種材料として用い
る。種材料の力価は高く、また本発明による適応
により細胞への定着が迅速であるために、前記製
造時には極めて少量の種材料を必要とするに過ぎ
ず、従つてこの有用な材料は極めて経済的に用い
られる。公的規制の要求する詳細な試験により、
この種材料は極めて高価なものとなる。 ワクチン製造時に十分高いビールス力価を得る
には、約20000の細胞に対して1LD50の前記種材
料が必要であるが、これに対して従来技術による
場合には、一つの細胞の接種に約１〜10LD50ま
たはPFU（プラーク形成単位）が必要である。 マウスにおけるLD50と組識におけるPFUはほ
ぼ比較可能である。 適応は確実且つ迅速である。従来技術による方
法の場合の10倍またはそれ以上のビールス力価が
得られる。従つて濃縮工程は不要となる。それに
もかかわらずそれを、例えば人に適用するワクチ
ンに対して併用すれば、ビールス力価を更に100
倍にまで増大させることができる。 実施例 １ 狂犬病ビールスの適応、および人および動物に
適用するための不活化ワクチンの製造 フランス国パリ在パスツール研究所（Institut
Pasteur）の狂犬病のためのWHOレフアレン
ス・センター（WHO Reference Centre for
Rabies）から兎脳からの凍結乾燥物質の形で入
手できる狂犬病ビールスfixe株VP11を出発材料
として用いる。 体重11〜15ｇのNMRI系白マウスに脳内注射
することによりビールス力価は105.2LD50／mlと
測定される。 アンプル内容物を１mlの蒸留水に溶解し、そし
て10-2の希釈度で原始鶏胚線維芽細胞（HEFZ）
に適用する。 Leighton小管中の７個のカバーガラス培養
（同じ細胞調製物を有する）を同様に10-2.0の希釈
度で接種する（継代接種I1）。＋37℃で５日間イン
キユベーシヨンした後、25％よりも低率のHEFZ
が感染していた。 ビールス含有細胞不含の上澄液を10-1.0の希釈
度で第２継代接種原始HEFZに載せる（継代接種
I2）。＋37℃で６日間インキユベーシヨンの後、約
25％の細胞が感染していた。ビールス含有細胞不
含の上澄液を10-1.0および10-2.0の希釈度で原始
HEFZの感染に用いる（継代接種I3）。４日間イ
ンキユベーシヨンを行つた後、10-1.0の希釈度で
は70％、10-2.0の希釈度では90％の細胞が感染し
ていた。以後は次のようにして行う。すなわち
10-1.0の希釈度で行つた継代接種をこの希釈度で
更に行う。 10-2.0の希釈度で行つた継代接種をこの希釈度
で更に行う。 この希釈度10-2.0で行われた継代接種から新し
い継代接種系列が分枝し、これについて10-3.0の
希釈段階で更に続行する（継代接種I4）。 以後の適応経過像を示せば次の通りである。
ンおよび生ワクチンは既に知られている。不活化
狂犬病ワクチンは感染動物（例えば兎および羊）
のビールス含有中枢神経組織懸濁液または感染家
鴨胚懸濁液よりなる。この種のワクチンには、異
種蛋白を多量に含有するために注射部位にのみな
らず全身的に望ましくない副反応を生じるという
欠点が伴なう。中枢神経組織よりなる狂犬病ワク
チンを人に用いる場合は、それ以外に残留障害を
伴なう神経合併症を生じることがあり、特に充分
な狂犬病防護処置には数多くの注射が必要であ
る。人の場合と同様な副反応は動物の場合にもみ
とめられている。 幼若ハムスター腎臓の細胞系統、例えば
BHK21−細胞よりなる細胞培養、NIL−細胞、
ハムスター腎臓の原始細胞（Primary cell）、ま
たは鶏胚線維芽細胞中で狂犬病ビールスを増殖さ
せ、それよりその動物のための不活化ワクチンを
調製する試みも既に行われている。動物用狂犬病
生ワクチンの調製には豚またはハムスターの腎臓
の原始細胞または犬または牛腎細胞の細胞系統が
用いられた。しかしながらその場合には、中枢神
経材料を用いた場合に得られるようなビールス濃
度は得られなかつた。しかしながら有効な狂犬病
ワクチン、特に不活化ワクチンにとつてビールス
力価が十分高いことは前提要件である。更にま
た、使用した細胞によつては悪性腫瘍を生じると
いう欠点を伴なう。 細胞培養でビールスを増殖させる際に血清を用
いると高濃度のビールスが得られるが、その異種
血清のために望ましくない抗体が形成されてしま
うのでその使用は禁止されている。従つて製造方
法にビールス含有液濃縮工程、例えば沈殿、遠心
分離または限外過などの工程を設ける手段を講
じているが、これらの手段は製造方法をより困難
でよりコスト高にするものである。 鶏胚線維芽細胞を用いた場合、動物用試験ワク
チンのピーク力価は105.0〜106.0PFU／ml（プラ
ーク形成単位／ml）また6.1×106幼若マウス
LD50／ml（LD＝致死量）であることが記載され
ており、この大きさの力価では十分な免疫の保証
は全く得られない。 本発明者は、狂犬病ビールスを原始鶏胚線維芽
細胞に適応せしめ且つ該適応後原始鶏胚線維芽細
胞中で増殖させることによる狂犬病ワクチンの製
造にあたり、狂犬病ビールスを前記適応化時には
10-1〜10-5の範囲で段階的に増大する希釈度で、
そして前記増殖時には10-2〜10-5の希釈度で増殖
培養物の接種に用いることを特徴とする製造方法
を見出した。 好ましい一実施形式では30〜38℃、好ましくは
32〜37℃の温度で操作が行われる。 この方法には、狂犬病ビールスワクチン製造に
通常用いられるあらゆる狂犬病種が適しており、
例えば狂犬病ビールス株Fluly、LEPおよび
Flury HEP、狂犬病ビールス固定（fixe）株パ
スツールおよびPM株（PM＝Pitman−Moore）
などが挙げられる。 線維芽細胞用鶏胚は低廉且つ容易に入手でき、
また良好な細胞収率を与える。人に用いるための
狂犬病ワクチンにはいわゆるSPF卵からの鶏胚を
用いるのが好ましい。SPF卵とは、特にこの目的
に適合した養鶏場で特異的に病原体不含に飼育さ
れ且つ保存されている鶏の卵である。SPF卵の組
識培養は、通常の養鶏の卵にみられた望ましくな
い汚染ビールス例えば感染性滑液嚢炎のビール
ス、感染性喉頭気管炎のビールス、Ａ型インフル
エンザのビールス、鳥痘瘡のビールス、鳥脳脊髄
炎のビールス、封入小体肝炎のビールス、感染性
気管支カタルのビールス、鳥白血球病のビール
ス、マレツク病のビールス、ニユーカツスル病の
ビールス、鳥レオビールス、鳥アデノビールス、
ミコプラスマ・ガリセプチクム（Mycoplasma
galliseptioum）、ミコプラズマ・シノビアエ
（Mycoplasma synoviae）およびサルモネラ・プ
ロルム（Salmonella pullorum）を含有していな
い。人に適用するための狂犬病ワクチンの製造に
鶏胚線維芽細胞を利用することは新規であり、ま
たこれまで報告された例はない。 本発明による狂犬病ワクチン製造においては、
狂犬病ビールスを原始鶏胚線維芽細胞に適応さ
せ、その適応させたビールスを原始鶏胚線維芽細
胞中で増殖させ、そしてビールス含有懸濁液を、
場合により既知の方法により不活化した後、ワク
チンに仕上げる。本発明により適応させた狂犬病
ビールスによつてのみ、ビールス増殖の際、有用
な狂犬病ワクチンを調製し得るに十分なビールス
濃度を達成することができる。 出発材料としては、ビールスを含有する哺乳動
物の脳、例えばVP11株またはパスツール株また
はPM株、または鶏胚ホモジエネート、例えば
Flury LEP株またはFlury HEP株などを用いる
のが好ましく、そしてそれを単層状態の原始鶏胚
線維芽細胞に載置する。 従来技術に従い、なるべく多数の細胞を感染す
るために未希釈のビールス材料を感染させた場合
には少数の細胞しか定着せず、次の継代接種では
感染した細胞の数は不変であるかまたは低下さえ
もする。その細胞へのビールスの適応は起らず、
この方法では達成することはできない。 これに対して、継代接種に用いられるビールス
含有懸濁液を10-1〜10-4に希釈した場合には狂犬
病ワクチンの製造に適した狂犬病ビールスを得る
ことができる。ある一つの希釈度から次に高い希
釈度への移行にとつて決定的なのは、前の代にお
けるビールスの増殖動力学（カイネチツク）であ
る。ビールス株は10-2の希釈度において既に十分
増殖し得るので、まず継代接種は希釈度10-1およ
び10-2の出発材料を用いて行われる。 ビールス増殖を制御するために、同様に処理し
且つ感染させたカバーガラス培養をLeighton小
管中で並行して行う。そのカバーガラス培養物を
螢光標識した抗狂犬病ガンマグロブリンで染色す
ればその染色標本を螢光顕微鏡で観察評価するこ
とができ、そして狂犬病ビールスに感染した細胞
の百分率から増殖動力学を推論することができ
る。細胞のビールス定着を毎日追跡できるように
十分な数の対照を調製する。各々の読取りには１
〜２個の小管が必要である。 最初はビールスが細胞になかなか定着しなくて
も、本発明により処理すれば継代接種の過程で定
着は増大する。 継代接種の際３〜４日で100％の細胞がビール
スに感染したら、10-2または10-3の希釈度、次い
で（必要ならば）10-4の希釈度に移す。より高い
希釈率に移すに伴ない、100％ビールス定着細胞
層におけるビールス力価も継代接種の過程で増大
する。 最後の継代接種のビールス含有懸濁液をワクチ
ン製造におけるビールス増殖用種材料として用い
る。種材料の力価は高く、また本発明による適応
により細胞への定着が迅速であるために、前記製
造時には極めて少量の種材料を必要とするに過ぎ
ず、従つてこの有用な材料は極めて経済的に用い
られる。公的規制の要求する詳細な試験により、
この種材料は極めて高価なものとなる。 ワクチン製造時に十分高いビールス力価を得る
には、約20000の細胞に対して1LD50の前記種材
料が必要であるが、これに対して従来技術による
場合には、一つの細胞の接種に約１〜10LD50ま
たはPFU（プラーク形成単位）が必要である。 マウスにおけるLD50と組識におけるPFUはほ
ぼ比較可能である。 適応は確実且つ迅速である。従来技術による方
法の場合の10倍またはそれ以上のビールス力価が
得られる。従つて濃縮工程は不要となる。それに
もかかわらずそれを、例えば人に適用するワクチ
ンに対して併用すれば、ビールス力価を更に100
倍にまで増大させることができる。 実施例 １ 狂犬病ビールスの適応、および人および動物に
適用するための不活化ワクチンの製造 フランス国パリ在パスツール研究所（Institut
Pasteur）の狂犬病のためのWHOレフアレン
ス・センター（WHO Reference Centre for
Rabies）から兎脳からの凍結乾燥物質の形で入
手できる狂犬病ビールスfixe株VP11を出発材料
として用いる。 体重11〜15ｇのNMRI系白マウスに脳内注射
することによりビールス力価は105.2LD50／mlと
測定される。 アンプル内容物を１mlの蒸留水に溶解し、そし
て10-2の希釈度で原始鶏胚線維芽細胞（HEFZ）
に適用する。 Leighton小管中の７個のカバーガラス培養
（同じ細胞調製物を有する）を同様に10-2.0の希釈
度で接種する（継代接種I1）。＋37℃で５日間イン
キユベーシヨンした後、25％よりも低率のHEFZ
が感染していた。 ビールス含有細胞不含の上澄液を10-1.0の希釈
度で第２継代接種原始HEFZに載せる（継代接種
I2）。＋37℃で６日間インキユベーシヨンの後、約
25％の細胞が感染していた。ビールス含有細胞不
含の上澄液を10-1.0および10-2.0の希釈度で原始
HEFZの感染に用いる（継代接種I3）。４日間イ
ンキユベーシヨンを行つた後、10-1.0の希釈度で
は70％、10-2.0の希釈度では90％の細胞が感染し
ていた。以後は次のようにして行う。すなわち
10-1.0の希釈度で行つた継代接種をこの希釈度で
更に行う。 10-2.0の希釈度で行つた継代接種をこの希釈度
で更に行う。 この希釈度10-2.0で行われた継代接種から新し
い継代接種系列が分枝し、これについて10-3.0の
希釈段階で更に続行する（継代接種I4）。 以後の適応経過像を示せば次の通りである。
【表】
上記表は狂犬病ビールス固定株VP11の適応経
過の４段階を表わしている。実験の最初の部分
（継代接種番号I1〜４）については表の前に説明
されている。 1.1 継代接種番号I5〜７／10-1： 継代接種番号I4 10-1のビールス含有の上澄
液を10-1に希釈し、原始鶏胚単層細胞に載せた
（継代接種番号I5／10-1）。３日後、75％の細胞
が感染していた。適応経過はその段階では不十
分であつた。 1.2 継代接種番号I5〜７／10-2： 継代接種番号I4 10-2のビールス含有の上澄
液を10-2に希釈し、原始鶏胚単層細胞に載せた
（継代接種番号I5／10-2）。３日後、100％の細
胞が感染していた。適応経過は十分ではあつた
が、安定な変異細胞は、まだ親株から得られな
かつた（継代接種番号I11〜13／10-2の結果を
参照）。 1.3 継代接種番号I5〜７／10-3： 継代接種番号I4 10-2のビールス含有の上澄
液を10-3に希釈し、原始鶏胚単層細胞に載せ
た。この上澄液をI4 10-2継代接種系列から分
枝し、本発明の真の実施例とした。何故なら、
その決定は前の代におけるビールスの増殖動力
学に基づいてなされたものであるからである。
２日後、100％の細胞が感染していた。 1.4 継代接種番号I11〜13： 1.1〜1.3に記載の方法を続行した。結果は初
期の継代接種と比較して、あまり満足ゆくもの
ではなかつた。継代接種番号I13 10-1希釈度系
列のビールス含有の上澄液を捨てた。10-2およ
び10-3の希釈度系列だけを続行した。10-2およ
び10-3の希釈度での継代接種のみを続行する決
定は、「前の代におけるビールスの増殖動力学」
に基づいてなされ、本発明の真の実施例とし
た。継代接種番号I11〜13はこのビールス株の
適応の経過が波状であることを証明するために
示した。 1.5 継代接種番号I17〜19： 1.1〜1.3に記載の方法を続行した。上澄みの
組識培養液に存在するビールス濃度をさらに明
確にするために、ビールス滴定を含めることに
より、さらに別の情報が得られた。初期のビー
ルス濃度と比較した場合、実測値のビールス力
価は、まだ十分に高いとはいえない（第11頁下
から第４〜２行参照）。 1.6 継代接種番号I26〜31： 1.1〜1.3に記載の方法を続行した。これらの
継代は、限定された希釈度（10-2および10-3）
でなされた継代接種系列の末期を構成する。す
べての継代接種（I26〜I31）における10-3希釈
度系列は、従来技術および10-2希釈度系列のも
のと比較して、非常に高いビールス力価を示
す。 継代接種I31は人用不活化狂犬病ワクチンの
種材料となる。驚ろくべきことに、継代接種
I26〜I31において、10-3.0の継代接種系列のビ
ールス濃度が10-2.0の継代接種系列よりも平均
して９倍も高くなつていることがわかる。この
ことは継代接種I31を２回繰り返すことによつ
て証明され、ビールス濃度は第１例では40倍、
第２例では100倍も高くなつていた。 人用ワクチンの製造 試験ワクチンは本発明により原始HEFZに適
応させたFlury LEP株の種材料から製造され
る。 前述の方法により調製した種材料を、本発明
に従つて10-3.0の希釈度で原始HEFZに接種し
そして＋32℃でインキユベートした。収獲した
ビールス含有懸濁液は、連続流遠心分離で清澄
化後107.4LD50／mlのビールス力価を与えた。 次いでそのビールスを既知の方法によりβ―
プロピオラクトンで不活化し、そのようにして
得られたワクチンを抗原価１の標準ワクチンと
比較することによりNIH試験、マウス防護試
験で試験する。 上記β―プロピオラクトンによるビールスの
不活性化はβ―プロピオラクトンをろ過ビール
ス懸濁液に0.025％までの濃度になるように加
え、該懸濁液を２乃至６℃で18時間、または37
℃で２時間保持することによつて実施される。
その後β―プロピオラクトンは該混合物中には
検出されない。 ビールス力価の測定は“狂犬病における実験
技術”WHO（第３版、173年、ジユネーブ）、
第73〜80頁および第106〜109頁に記載の方法に
従つて、マイクロテトプレート上での原始鶏胚
線維芽細胞の培養および蛍光抗体試験を用いて
実施される。 NIH試験による抗原価の測定は、“狂犬病に
おける実験技術”WHO（第３版、1973年、ジ
ユネーブ）第33章第279〜286頁に記載の方法に
従つて標準攻撃ビールスを用いて実施される。 ビールス力価はなおも増大させることができ
る。そのために、得られたビールス懸濁液を連
続密度勾配で更に精製しそして濃縮する。その
際、濃縮倍率は約100：１でありビールス力価
は109.3LD50／mlである。このビールス濃縮液
を10：１の濃度に調整し、β―プロピオラクト
ンで不活化しそして同じくNIH試験に付する。 本発明により製造したワクチンの抗原価は1.2
でありそして10：１に濃縮したビールスを含むワ
クチンの抗原価は4.8であつた。 本発明方法により人に適用するのに十分な抗原
価を有するワクチンを製造し得ることがわかる。
NIH試験では、その抗原価が、標準ワクチンの
抗原価の少くとも0.3倍であるワクチンが有効で
あるとして解放される。上述のワクチンは国際
WHO−狂犬病標準ワクチンに基づいて標準化さ
れている並行して用いた標準ワクチンA18よりも
1.2倍良好であり、そのビールス材料を更に精製、
濃縮した場合には4.8倍良好であつた。 実施例 ２ 製造用株の適応、および動物に適用するための
狂犬病生ワクチンの製造 ビールス含有鶏胚からのホモジエナイズされ凍
結乾燥された物質の形で米国メリーランド州ロツ
クビルにあるアメリカン・タイプ・カルチヤー・
ココレクシヨン（American Type Culture
Collection）から入手できる狂犬病ビールス株
Flury HEPを出発材料として用いる。適応は実
施例１と同様にして行うが、ただし、培養物は＋
32℃でインキユベートし、そして10-4の希釈段階
も用いた。ビールス株HEPの適応経過は次の通
りであつた。
過の４段階を表わしている。実験の最初の部分
（継代接種番号I1〜４）については表の前に説明
されている。 1.1 継代接種番号I5〜７／10-1： 継代接種番号I4 10-1のビールス含有の上澄
液を10-1に希釈し、原始鶏胚単層細胞に載せた
（継代接種番号I5／10-1）。３日後、75％の細胞
が感染していた。適応経過はその段階では不十
分であつた。 1.2 継代接種番号I5〜７／10-2： 継代接種番号I4 10-2のビールス含有の上澄
液を10-2に希釈し、原始鶏胚単層細胞に載せた
（継代接種番号I5／10-2）。３日後、100％の細
胞が感染していた。適応経過は十分ではあつた
が、安定な変異細胞は、まだ親株から得られな
かつた（継代接種番号I11〜13／10-2の結果を
参照）。 1.3 継代接種番号I5〜７／10-3： 継代接種番号I4 10-2のビールス含有の上澄
液を10-3に希釈し、原始鶏胚単層細胞に載せ
た。この上澄液をI4 10-2継代接種系列から分
枝し、本発明の真の実施例とした。何故なら、
その決定は前の代におけるビールスの増殖動力
学に基づいてなされたものであるからである。
２日後、100％の細胞が感染していた。 1.4 継代接種番号I11〜13： 1.1〜1.3に記載の方法を続行した。結果は初
期の継代接種と比較して、あまり満足ゆくもの
ではなかつた。継代接種番号I13 10-1希釈度系
列のビールス含有の上澄液を捨てた。10-2およ
び10-3の希釈度系列だけを続行した。10-2およ
び10-3の希釈度での継代接種のみを続行する決
定は、「前の代におけるビールスの増殖動力学」
に基づいてなされ、本発明の真の実施例とし
た。継代接種番号I11〜13はこのビールス株の
適応の経過が波状であることを証明するために
示した。 1.5 継代接種番号I17〜19： 1.1〜1.3に記載の方法を続行した。上澄みの
組識培養液に存在するビールス濃度をさらに明
確にするために、ビールス滴定を含めることに
より、さらに別の情報が得られた。初期のビー
ルス濃度と比較した場合、実測値のビールス力
価は、まだ十分に高いとはいえない（第11頁下
から第４〜２行参照）。 1.6 継代接種番号I26〜31： 1.1〜1.3に記載の方法を続行した。これらの
継代は、限定された希釈度（10-2および10-3）
でなされた継代接種系列の末期を構成する。す
べての継代接種（I26〜I31）における10-3希釈
度系列は、従来技術および10-2希釈度系列のも
のと比較して、非常に高いビールス力価を示
す。 継代接種I31は人用不活化狂犬病ワクチンの
種材料となる。驚ろくべきことに、継代接種
I26〜I31において、10-3.0の継代接種系列のビ
ールス濃度が10-2.0の継代接種系列よりも平均
して９倍も高くなつていることがわかる。この
ことは継代接種I31を２回繰り返すことによつ
て証明され、ビールス濃度は第１例では40倍、
第２例では100倍も高くなつていた。 人用ワクチンの製造 試験ワクチンは本発明により原始HEFZに適
応させたFlury LEP株の種材料から製造され
る。 前述の方法により調製した種材料を、本発明
に従つて10-3.0の希釈度で原始HEFZに接種し
そして＋32℃でインキユベートした。収獲した
ビールス含有懸濁液は、連続流遠心分離で清澄
化後107.4LD50／mlのビールス力価を与えた。 次いでそのビールスを既知の方法によりβ―
プロピオラクトンで不活化し、そのようにして
得られたワクチンを抗原価１の標準ワクチンと
比較することによりNIH試験、マウス防護試
験で試験する。 上記β―プロピオラクトンによるビールスの
不活性化はβ―プロピオラクトンをろ過ビール
ス懸濁液に0.025％までの濃度になるように加
え、該懸濁液を２乃至６℃で18時間、または37
℃で２時間保持することによつて実施される。
その後β―プロピオラクトンは該混合物中には
検出されない。 ビールス力価の測定は“狂犬病における実験
技術”WHO（第３版、173年、ジユネーブ）、
第73〜80頁および第106〜109頁に記載の方法に
従つて、マイクロテトプレート上での原始鶏胚
線維芽細胞の培養および蛍光抗体試験を用いて
実施される。 NIH試験による抗原価の測定は、“狂犬病に
おける実験技術”WHO（第３版、1973年、ジ
ユネーブ）第33章第279〜286頁に記載の方法に
従つて標準攻撃ビールスを用いて実施される。 ビールス力価はなおも増大させることができ
る。そのために、得られたビールス懸濁液を連
続密度勾配で更に精製しそして濃縮する。その
際、濃縮倍率は約100：１でありビールス力価
は109.3LD50／mlである。このビールス濃縮液
を10：１の濃度に調整し、β―プロピオラクト
ンで不活化しそして同じくNIH試験に付する。 本発明により製造したワクチンの抗原価は1.2
でありそして10：１に濃縮したビールスを含むワ
クチンの抗原価は4.8であつた。 本発明方法により人に適用するのに十分な抗原
価を有するワクチンを製造し得ることがわかる。
NIH試験では、その抗原価が、標準ワクチンの
抗原価の少くとも0.3倍であるワクチンが有効で
あるとして解放される。上述のワクチンは国際
WHO−狂犬病標準ワクチンに基づいて標準化さ
れている並行して用いた標準ワクチンA18よりも
1.2倍良好であり、そのビールス材料を更に精製、
濃縮した場合には4.8倍良好であつた。 実施例 ２ 製造用株の適応、および動物に適用するための
狂犬病生ワクチンの製造 ビールス含有鶏胚からのホモジエナイズされ凍
結乾燥された物質の形で米国メリーランド州ロツ
クビルにあるアメリカン・タイプ・カルチヤー・
ココレクシヨン（American Type Culture
Collection）から入手できる狂犬病ビールス株
Flury HEPを出発材料として用いる。適応は実
施例１と同様にして行うが、ただし、培養物は＋
32℃でインキユベートし、そして10-4の希釈段階
も用いた。ビールス株HEPの適応経過は次の通
りであつた。
【表】
上記表は狂犬病ビールス固定株Flury HEPの
適応経過の３段階を表わしている。 2.1 継代接種番号K1〜３： ATCC USAから入手できる凍結乾燥株
Flury HEPを10-2に希釈し、原始鶏胚線維芽
細胞に接種した（継代接種番号K1／10-2）。継
代接種番号K1／10-2のビールス含有の上澄液
を10-2に希釈し、原始鶏胚線維芽細胞に接種し
た（継代接種番号K2／10-2）。 2.2 凍結乾燥株Flury HEPを10-3に希釈し、原
始鶏胚線維芽細胞に接種した（継代接種番号
K1／10-3）。これらの継代接種は共に、公知の
従来技術と比べて差のない低いビールス力価で
あつた。ビールス株は、まだ原始鶏胚線維芽細
胞において増殖する程適合していなかつた。 2.3 継代接種番号K7〜９： 2.1〜2.2に記載の方法を続行した。継代接種
番号K7／10-3の上澄液から、希釈10-4のもの
を分枝し、鶏胚線維芽細胞に接種した。この段
階の決定は、継代接種番号K7／10-3の優れた
増殖動力学によつてなされたものであり、これ
は再び本発明の真の実施例を構成する。 2.4 継代接種番号K12〜13： 2.1〜2.2に記載の方法を続行したが、10-3お
よび10-4の希釈度だけを次の中に用いた。10-4
の継代接種への継代接種番号K9は常に組織培
養上澄液におけるより高いビールス濃度を表わ
すことから、適合経過が十分であることを示し
た。 実施例１および２は前の代の増殖動力学がビー
ルス接種の次のより高い希釈度へ進む指標になつ
ていることを立証している。２つの試験ワクチン
を次のようにして製造した。 継代接種K8およびK9のビールス含有保存媒質
を、重合且つ分解させたゼラチン（西独特許第
1118792号明細書の記載に従つて製造）およびグ
ルタミン酸ナトリウムよりなる33％安定剤溶液と
混合した。試験ワクチン１の凍結乾燥後のビール
ス含有量は106.3TCID50／mlであつた。 試験ワクチン２の凍結乾燥後のビールス含有量
は107.0TCID50／mlであつた。 WHO、狂犬病における実験技術（Lanoratory
Techiniques in Rabies）第３版（ジユネーブ、
1973年）の推奨によれば、生ワクチンには105.2
LD50またはTCID50の最低力価が必要である。本
発明により製造されたワクチンはその必要な最低
ビールス濃度の10倍以上も含有している。 実施例 ３ 製造用株の適応／動物に適用るための不活化ワ
クチンの製造 アメリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨ
ンから入手できる狂犬病ビールス株Flury LEP
を出発材料として用いる。この株は、細胞株
Wi38に適応した。凍結乾燥したビールス含有鶏
胚ホモジエートとして提供された。原始鶏胚線維
芽細胞への適応は、本発明により一連の継代接種
に、感染細胞率に応じて感染材料を10倍ずつ徐々
に希釈率を上げたものを用いることにより行つ
た。市販の不活化ワクチンMadivakを製造する
ための種材料はC22の代（10-3.0の希釈代）から
製造した。そのビールス力価は107.2であつた。本
発明により、10-3.0の希釈度の種材料を用いるか、
または実施例１と同様にして調製された種材料か
らの本発明に従つて処理された中間の代を用いて
ワクチンを製造した。 このワクチンはNIH価2.6を示したのに対して
従来方法により製造されたワクチン（他の組織培
養（細胞株PK15）から得たもの）はNIH試験に
おいて0.4の抗原価を示した。
適応経過の３段階を表わしている。 2.1 継代接種番号K1〜３： ATCC USAから入手できる凍結乾燥株
Flury HEPを10-2に希釈し、原始鶏胚線維芽
細胞に接種した（継代接種番号K1／10-2）。継
代接種番号K1／10-2のビールス含有の上澄液
を10-2に希釈し、原始鶏胚線維芽細胞に接種し
た（継代接種番号K2／10-2）。 2.2 凍結乾燥株Flury HEPを10-3に希釈し、原
始鶏胚線維芽細胞に接種した（継代接種番号
K1／10-3）。これらの継代接種は共に、公知の
従来技術と比べて差のない低いビールス力価で
あつた。ビールス株は、まだ原始鶏胚線維芽細
胞において増殖する程適合していなかつた。 2.3 継代接種番号K7〜９： 2.1〜2.2に記載の方法を続行した。継代接種
番号K7／10-3の上澄液から、希釈10-4のもの
を分枝し、鶏胚線維芽細胞に接種した。この段
階の決定は、継代接種番号K7／10-3の優れた
増殖動力学によつてなされたものであり、これ
は再び本発明の真の実施例を構成する。 2.4 継代接種番号K12〜13： 2.1〜2.2に記載の方法を続行したが、10-3お
よび10-4の希釈度だけを次の中に用いた。10-4
の継代接種への継代接種番号K9は常に組織培
養上澄液におけるより高いビールス濃度を表わ
すことから、適合経過が十分であることを示し
た。 実施例１および２は前の代の増殖動力学がビー
ルス接種の次のより高い希釈度へ進む指標になつ
ていることを立証している。２つの試験ワクチン
を次のようにして製造した。 継代接種K8およびK9のビールス含有保存媒質
を、重合且つ分解させたゼラチン（西独特許第
1118792号明細書の記載に従つて製造）およびグ
ルタミン酸ナトリウムよりなる33％安定剤溶液と
混合した。試験ワクチン１の凍結乾燥後のビール
ス含有量は106.3TCID50／mlであつた。 試験ワクチン２の凍結乾燥後のビールス含有量
は107.0TCID50／mlであつた。 WHO、狂犬病における実験技術（Lanoratory
Techiniques in Rabies）第３版（ジユネーブ、
1973年）の推奨によれば、生ワクチンには105.2
LD50またはTCID50の最低力価が必要である。本
発明により製造されたワクチンはその必要な最低
ビールス濃度の10倍以上も含有している。 実施例 ３ 製造用株の適応／動物に適用るための不活化ワ
クチンの製造 アメリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨ
ンから入手できる狂犬病ビールス株Flury LEP
を出発材料として用いる。この株は、細胞株
Wi38に適応した。凍結乾燥したビールス含有鶏
胚ホモジエートとして提供された。原始鶏胚線維
芽細胞への適応は、本発明により一連の継代接種
に、感染細胞率に応じて感染材料を10倍ずつ徐々
に希釈率を上げたものを用いることにより行つ
た。市販の不活化ワクチンMadivakを製造する
ための種材料はC22の代（10-3.0の希釈代）から
製造した。そのビールス力価は107.2であつた。本
発明により、10-3.0の希釈度の種材料を用いるか、
または実施例１と同様にして調製された種材料か
らの本発明に従つて処理された中間の代を用いて
ワクチンを製造した。 このワクチンはNIH価2.6を示したのに対して
従来方法により製造されたワクチン（他の組織培
養（細胞株PK15）から得たもの）はNIH試験に
おいて0.4の抗原価を示した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 鶏胚線維芽細胞培養への狂犬病ビールスの適
応により狂犬病ワクチンを製造することよりなり
而して適応させるために狂犬病ビールスを10-1〜
10-5の範囲で段階的に増大する希釈度で前記細胞
培養の継代接種に用いそして増殖させるために
10-2〜10-5の希釈度で増殖用細胞培養に接種する
ことを包含する、狂犬病ワクチンの製造方法。 ２ 継代中、温度を30〜38℃の範囲に維持する前
記第１項の方法。 ３ 継代中、温度を32〜37℃の範囲に維持する前
記第１項の方法。 ４ SPE卵の鶏胚線維芽細胞をワクチン製造に用
いる前記第１項の方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2616407A DE2616407C3 (de) | 1976-04-14 | 1976-04-14 | Verfahren zur Herstellung eines Tollwut-Impfstoffs |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS52125620A JPS52125620A (en) | 1977-10-21 |
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|---|---|---|---|
| JP4212977A Granted JPS52125620A (en) | 1976-04-14 | 1977-04-14 | Production of hydrophobic vaccine |
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