JPH02138287A - 新規な抗生物質ｏａ‐６１２９のリン酸エステル - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な抗生物質に関し、さらに詳しくは、下記
式 で示される７−オキソ−１−アザビシクロ〔３・２・Ｏ
〕ヘプト−２−エン−２−カルボン酸骨格を有する抗生
物質は、一般に高い抗菌力とβ−ラクタマーゼ阻害活性
を有しており、従来から、発酵法、半合成法、全合成法
により各種の７−オキシ−１−アザビシクロ〔３・２・
０〕へブト２−エン−２−カルボン酸誘導体が製造され
ている〔例えば、チェナマイシン（ジャーナル・オン・
アンティビオティクス、３２巻（１９７９年）、１〜１
２頁）、エビチェナマイシン類（第１７回インターサイ
エンス・コンファランス・オン・アンテイミクロビアル
・エイゼンツ・アンド・ケモテラビー、要旨第８０およ
び第８１号（１９７７年））、Ｎ−アセチルチェナマイ
シン（西ドイツ特許第２６５２６８１号（１９７７年）
）、オリバニン酸類（ジャーナル・オブ・アンティビオ
ティクス、３２巻（１９７９年）、２８７〜３０４頁＞
、ＰＳ−５（ジャーナル・オブ・アンティビオティクス
、３２巻（１９７９年）、２６２〜２８６頁＞、ＰＳ−
６（特開昭５４−５９２９５号）、ＰＳ−７（特開昭５
４−９２９８３号）など〕。

さらに、本発明者め一部は、ストレプトミセス０Ａ−６
１２９菌株（微工研条寄第１１号（ＦＥＲ）ｌ　ＢＰ−
１１＞　）が下記式式中、Ｒは水素原子、水酸基又はヒ
ドロキシスルホニルオキシ基を表わす、 で示されるように７−オキソ−１−アザビシクロ〔３・
２・０〕ヘプト−２−エン−２−カルボン酸骨格の３位
にバンチチイニル基を有し且つ６位にエチル基、１−ヒ
ドロキシルエチル基又は１−ヒドロキシスルホニルオキ
シエチル基を有している点に構造的特徴を有する従来の
文献に未載の新規な抗生物質を産出することを見い出し
、これらを抗生物質０Ａ−６１２９Ａ、Ｂ及びＣと命名
して先に特許出願した。（特開昭５７−６２２８０号、
開開５７−７０８９０号及び開開５７−９５９８７号参
照）。

本発明により提供される前記式（Ｉ＞の化合物は、上記
抗生物質０Ａ−６１２９Ａ、Ｂ及びＣ（以下、総称して
［抗生物質０Ａ−６１２９Ｊという）の−級水酸基がリ
ン酸エステルになっている点に構造的特徴を有する新規
な抗生物質である。以下これらの抗生物質のうち、６位
にエチル基を有する化合物を［抗生物質０Ａ−６１２９
Ａ−リン酸エステル］、■−ヒドロキシエチル基を有す
る化合物を「抗生物質０Ａ−６１２９Ｂ−リン酸エステ
ル」、並びに１−ヒドロキシスルホニルオキシエチル基 ５Ｏ２０Ｈ （ＣＨ，−ＣＨ−）を有する化合物を［抗生物質０Ａ−
６１２９Ｃ−リン酸エステル」と略称する。

また、これらのリン酸エステルを「抗生物質ＯＡ　−６
１２９のリン酸エステル」と総称する。

式（’Ｉ）の新規抗生物質０Ａ−６１２９のリン酸エス
テルは、従来提案されている同じ基本骨格をもつ抗生物
質に比較して安定である点でユニークであり、しかも上
記の公知文献に記載されていると同様に、強い抗菌力及
びβ−ラクタマーゼ阻害活性を有すると共に、β−ラク
タマーゼ生産菌に対するペニシリン系、セファロスポリ
ン系等の抗菌性物質の抗菌力を相乗的に増強する能力を
も併せ有しており、抗菌剤として有用である。

式（Ｉ）の化合物は、２−位のカルボキシル基及び／又
はリン酸基の塩の形態をとることもでき、かかる塩の例
としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、リチウム
塩の如きアルカリ金属塩：カルシウム塩、マグネシウム
塩の如きアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩の如きそ
の他の金属塩；アンモニウム塩；モノエチルアミン、ジ
メチルアミン、トリメチルアミン、モノエタノールアミ
ン、ジェタノールアミンの如く第一級、第二級又は第三
級アミンによる塩：ベンザチン塩、プロ力イン塩などの
有機塩基による塩、等が含まれ、中でも製薬学的に許容
しうる塩が好ましく、特に、ナトリウム塩、カリウノ、
塩などのアルカリ金属塩が好適である。

本発明に従えば、前記式（１）の抗生物質０Ａ−６１２
９のリン酸エステルは、式（ｎ）で示される抗生物質０
Ａ−６１２９Ａ、ＢまたはＣを基質とした通常の酵素反
応条件下に、ＡＴＰ　（アデノシン−５′−トリリン酸
）の共存下でパントテン酸をリン酸化し得る微生物の培
養菌体又は該菌体の処理物で反応させることにより製造
することができる。

本発明で使用する培養菌体又は該菌体の処理物は、前述
した式（ｎ）の化合物の一級水酸基をリン酸化し、６位
の置換基が対応する式（１）の化合物を生産する能力を
有するものである限り、どのような属に属する微生物の
菌体又は菌体処理物でも使用できるが、本発明の目的に
適する菌体又は菌体処理物は、一般にパントテン酸をリ
ン酸化し得るもの（例えば、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕａｌ　
ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙｖ
ｏ！、３６．８４〜９２頁（１９７２）に記載の菌株）
を挙げることができるが、その中で、ブレビバクテリウ
ム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ６８７１の培養菌体の洗
浄したものが有利に用いられる。

該菌体を用いた酵素反応は、ｐ１１６〜８．５の緩衝液
にリン酸供与体としてＡＴＰを添加し、上記菌体を懸濁
した溶液を調製した後、式（ｎ）で示される各化合物を
添加反応させる方法によって実施できる。

１２％液は、式（Ｉ［＞の化合物の安定性等を考慮して
リン酸を含有するものでｐ１１６−８，５の範囲、特に
０１１７〜８の範囲に調節するのが有利である。

かかる緩衝液での反応は、一般に２０〜４５℃、好まし
くは３０〜４０℃の範囲内の温度が好適であり、その反
応時間は、反応温度や使用菌体又は菌体処理物によって
異なるが通常３０分〜１０時間の範囲である。

また、反応を好適に行なうため、必要に応じて反応液中
高級脂肪属硫酸ナトリウム等の界面活性剤やマグネシウ
ム等の酵素活性の安定化に寄与し得る金属イオンを共存
させることができる。

なお、使用する反応条件は、使用する菌体又は菌体処理
物の特性に応じて、当業者であれば簡単な実験により、
最適条件を容易に決定することができる。

かくして生成した式（Ｉ＞の化合物を反応混合物から単
離するには、反応後、濾過、遠心分離、抽出などのそれ
自体公知の分離法によって菌体又は菌体処理物を除去し
、その炉液、上澄液、抽出液などより回収される。

回収はそれ自体公知の種々の方法で行なうことができ、
特にカルボン酸型抗生物質の回収のためにしばしば利用
される方法が有利に適用される。例えば、低ｐＨにおけ
る酢酸エチル、ｎ−ブタノール等での溶媒抽出及びその
溶媒層から高ｐＨ水槽への転溶；活性炭、アンバーライ
トＸＡＤ　（ローム・アンド・ハース社製）、ダイヤイ
オンＨＰ−２０（三菱化成社製）等による吸着と、メタ
ノール水、アセトン水等による溶出；ダウエックス１×
２（ダウケミカル社製）、ＱＡＥ−セファデックスＡ−
２５（ファルマシア社製）、ＤＥＡＥ−セルローズワッ
トマンＤＥ−３２（ワットマン社製）、ＤＥＡＥ−セフ
ァデックスＡ−２５（ファルマシア社製）等のイオン交
換樹脂による吸着及び溶出；セファデックスＧ−１０（
ファルマシア社製）、バイオ・ゲルＰ−２（バイオ・ラ
ット社製）、等にゲル濾過；セルローズ、アビセルＳＦ
（アメリカン・ビスコース社製）等のカラムクロマトグ
ラフィー；アセトン等の溶剤添加による強制沈殿法；凍
結乾燥法、等をそれぞれ単独で或いは適宜組合せて、さ
らに場合によっては反復して使用される。

回収精製工程中の式（Ｉ）の化合物の挙動は後述するビ
オアッセイ法およびビオオートグラフィーにより定量測
定することができる。

かくして、前記した特性を有する抗生物質０Ａ−６１２
９Ａ−リン酸エステル、同０Ａ−６１２９Ｂ−リン酸エ
ステル又は同０Ａ−６１２９Ｃ−リン酸エステルが得ら
れる。

本抗生物質０Ａ−６１２９のリン酸エステルは、一般に
遊離型のものよりも塩の形の方がより安定であるから、
後述する医薬用途に使用したり、さらに誘導体に転換す
る場合の中間体として使用したり、或いは前記した精製
工程に付する場合等においては、塩の形で処理すること
が好適である。

抗生物質０Ａ−６１２９のリン酸エステルのその塩形へ
の転化はそれ自体公知の方法に従い、該抗生物質０Ａ−
６１２９のリン酸エステルを無機又は有機の塩基で処理
することにより行うことができる。この造塩反応に使用
し得る無機又は有機の塩基としては、例えば、水酸化ナ
トリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム如きアルカ
リ金属の水酸化物；水酸化カルシウム、水酸化マグネシ
ウムの如きアルカリ土類金属の水酸化物；モノエチルア
ミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、モノエタノ
ールアミン、ジェタノールアミン、ベンザチン、プロ力
インの如き第一級、第二級又は第三級の有機アミン等が
挙げられる。

本発明により提供される抗生物質０Ａ−６１２９のリン
酸エステル又はその塩は、広範囲の抗菌活性を有し、各
種微生物、例えばスタフィロコッカス属、サルシナ属、
バチルス属等に属する陽性菌に対し非常に強い抗菌力を
示し、更に例えばアルカリ土類金属、コマモナス属等に
属するダラム陰性菌に対しても非常に強い抗菌力を示す
。

また、本発明の抗生物質０Ａ−６１２９のリン酸エステ
ルは、例えばエシェリヒア属、クレブシェラ属、プロテ
ウス属等に属するダラム陰性菌に対してもがなり強い抗
菌力を示す。

特に、本発明の抗生物質０Ａ−６１２９のリン酸エステ
ルは、β−ラクタム環を有する抗生物質に対して耐性を
有する、例えばシトロバクタ−属、１０テウス属、エン
テロバクタ−属、クレブシェラ属、セラチア属等に属す
るダラム陰性細菌に対してかなり強い抗菌力を示す点、
及び哺乳動物の腎臓ホモジネートに対して安定である点
で特徴的である。

本発明の抗生物質０Ａ−６１２９のリン酸エステルの抗
菌スペクトルは以下に述べる各種病原性被験菌に対する
最小発育阻止濃度の測定により立証される（第１表）。

また、本発明の抗生物質０Ａ−６１２９のリン酸エステ
ルは、前述したように、従来公知の同種の抗生物質と比
較して安定であり、特に哺乳動物の腎臓ホモジネートに
対する安定性は、以下に述べる各種の被験腎臓ホモジネ
ート処理に対する残存活性の測定により明らかである（
第２表）。

（以下、余白） 第２表 抗生物質０Ａ−６１２９のリン酸エステルおよび関連化
合物の各種＋ｒｆ臓ホモジネートに対する安定性４（以
下、余白） 次に実施例により本発明をさらに説明する。なお、以下
の実施例において用いる抗菌活性物質の定性及び定量分
析は下記の方法で行った。

（１）ビオアッセイ法 一夜、ニュートリエンド・アガー上で培養したコマモナ
ス・テリゲナ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ　ｔｅｒｒｉｇｅｎ
ａ）　Ｂ−９９６の菌体を、ニュートリエンド・ブロス
中に懸濁させ、その苗木に由来する６１０ｎｍ吸光度が
、０．０４を示す種母液をつくる。極東粉末ブイヨン（
極東製薬工業（１１製）０．８％及びバクト・アガー（
デイフコ社製）１％よりなるとけた寒天培地に種母液１
％を接種し、これを７ｍｌずつ９■径のベトリ皿に分注
し固化されて、コマモナス検定板とする。

（２）ビオオートグラフィー 上記ビオアッセイ法において、９■径ペトリ皿を用いる
代りにタテ３２ｃｍＸヨコ２４■の皿を用い、被験菌を
接種した寒天培地１００ｍ１を分注し固化させて大型検
定板をつくる。

被検液の展開後のペーパークロマト濾紙を上記で作った
大型検定板の寒天表面に張り、１５分後収り除き、大型
検定板を３５℃、２０時間培養し、阻止帯の位置よりペ
ーパークロマト濾紙ムのＲｆ値を算出しく定性）、且つ
阻止帯の大きさから半定量することができる。薄層クロ
マト板を用いる場合は、薄紙を介して、成分面がふれる
ように寒天表面に張り、１５分後収り除き、上記と同様
操作により定性及び半定量分析を行う。

実施例　１ ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（ＡＴＣＣ６８
７１）の培養方法 グルコース１％、ヘフトン１．５％、Ｋ　２　ＨＰ　Ｏ
４０，３％、ＮａＣ１０１２％、ＭｇＳＯ４−７Ｈ２０
０，０２％、酵母上ｑス０．１％（殺菌前ｐＨ７，０＞
カら成る培地５ｇを５００ｍ１エルレンマイヤーフラス
コに１００ｍ１ずつ分注し、１２０’Ｃ１５分間殺菌し
た。冷却後ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ａ
ＴＣＣ６８７１）を無菌的に接種し、２８℃で２日間振
盪培養した。培養後、遠心分離により菌体を得、−０，
０１Ｍリン酸緩衝液（９１１７，１）で２回洗浄後、同
緩衝液１００ｍ１に懸濁し、凍結保存した。

実施例　２ 抗生物質０Ａ−６１２９Ａ−リン酸エステルの調製ＡＴ
Ｐ　（２Ｎａ塩）　　３００ｍｇ、Ｍｇ５０４−７Ｈ２
０１４８■を蒸留水５ｍｌに溶解し、Ｎ　ａ　ＨＣＯ３
でｐＨを７附近に調整後１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７、４
）　５　ｍｌ、実施例１で得られた菌体懸濁液１００ｍ
１、ラウリル硫酸ナトリウム１００■を加え良く攪拌し
た。これに抗生物質ＯＡ　−６１２９Ａ　（Ｎａ）、！
＞４０■を加え３５℃で４時間、ゆるやかに振盪した。

反応後遠心分離により菌体を除去し、上清を高圧濾紙電
気泳動くワットマンＮｏ、　ＩＦ紙、１５００Ｖ／３０
ｃｍ、５０分、ｐＨ８，６ベロナール緩衝液）で検定す
ると陽極側４ｏｎの所にわずかな原料スポット、１１１
の所に新らたな抗生物質０Ａ−６１２９Ａ−リン酸エス
テルのスポットが認められた。

この反応液（遠沈上清）を予め０．０１　Ｍリン酸緩衝
液（Ｏ１１７，４）で平衡化したＱＡＥ−セファデック
スＡ−２５（ファルマシア社製）カラム（３，ＯＸ４０
ｃｍ＞に吸着させ同緩衝液で洗浄後、同緩衝液に溶解し
たＮａＣ１の濃度勾配により溶出した。抗生物質０Ａ−
６１２９Ａ−リン酸エステルは０．２５１ＶＩ附近の濃
度で溶出されるので、その活性区分を集め、予め０゜０
１Ｍリン酸Ｍ街液（ｐＨ７、４＞で平衡化したダイヤイ
オンＩ−ｒ　Ｐ−２０ＡＧ　（三菱化製社製）カラム（
３，ＯＸ４０ｃｍ）に吸着させた。これを蒸留水で溶出
し、活性区分を凍結乾燥して部分精製標品１６■を得た
。本標品を蒸留水１ｍｌに溶解し、セルロファインＧＣ
−１５−ｍ（チッソ社製）カラム（１，９Ｘ　６５ｃｍ
　＞を用いてゲル濾過を行い、活性区分を凍結乾燥して
０Ａ６１２９Ａ−リン酸エステル１２．９■を得た。

この抗生物質０Ａ−６１２９Ａ−リン酸エステルは次ぎ
のような諸特性を示した。

（１）紫外部吸収スペクトラム ０、０１　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）中で測定λ＋
ａａｘ　ｎｍ：３０２、ＩＦ、’、：８７．９（２）核
磁気共鳴スペクトラム（溶媒：Ｄ２０、内部基準ＤＳＳ
） δ（ｐｐｍ）　： ０．９８（３１＋、ｔ、Ｊ＝７．ＯＨ２，ＣＨ２−ＣＨ
３）１．５０〜２．００（２Ｈ，ｍ、ＣＨ２−ｃＨｉ　
）２．４７（２１１ｔ、Ｊ＝６．５１１ｚ、ＮＨ−ＣＨ
２−ＣＨ２−Ｃｏ）２．７０〜３．８３（ＩＩＨ，ｍ、
　Ｃ−４Ｈ２、Ｃ−６Ｈ，５−ＣＨ。

ＣＨ２−ＮＨ，ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃｏ、（３）呈
色反応 エールリッヒ試薬：陽性 塩化白金酸反応：陽性 モリブデン酸反応：陽性 ニンヒドリン反応：陰性 （４）ペーパークロマトグラフィー 東洋濾紙Ｎｏ、　５０ 展開溶媒　　アセトニトリル：０．ＩＭ　　Ｔｒ　ｉ　
５−ＨＣ１緩衝液（１）Ｈ７，５）　：０．ＩＭ　　Ｅ
ＤＴＡ＝１２０：３０：１検出方法　Ｃｏｍａｍｏｎａ
ｓ　ｔｅｒｒｉｇｅｎａ　Ｂ９９Ｇによるバイオオート
グラフィー Ｒｆ値　０．０３（この時抗生物質０Ａ−６１２９Ａ、
及び抗生物質ＰＳ−５のＲｆ値はそれぞれ０．２６．０
．３１であった。）（５）高圧濾紙電気泳動 ワットマンＮｏ、　１Ｐ紙 ベロナール緩衝液（ｐＨ８，６） １５００Ｖ　７３０ｃｍ、５０分逆通 電出方法　Ｃｏｍａｍｏｎａｓ　ｔｅｒｒｉｇｅｎａ　
［３９９６によるバイオオートグラフィー 移動度　陽極側に１１〜１２ｃｍ　（この時、抗生物質
０Ａ−６１２９Ａは４〜５ｃｍ、ＰＳ−５は６〜７（１
）陽極側に移動しな。

（６）フォスファターゼに対する挙動 アルカリフォスファターゼ（シグマ社Ｐ３８７７＞処理
により分解され、抗生物質０Ａ−６１２９Ａを生ずる。

実施例３ 抗生物質０Ａ−６１２９Ｂ−リン酸エステルの調製及び
単離精製 実施例２と同様にして抗生物質０Ａ−６１２９１３４０
■をリン酸化した。反応液を菌体除去後、予め０、ＯＩ
Ｍリン＃緩街液（ｐＨ７、４）で平衡化したＱＡＥ−セ
ファデックスＡ−２５（ファルマシア社製）カラム（３
，ＯＸ　４０ｃｍ　）に吸着させた。カラムを同緩衝液
で洗浄後、同緩衝液に溶解したＮａＣ１の濃度勾配で溶
出した。抗生物質０Ａ−６１２９Ｂ−リン酸エステルは
０．３５Ｍ附近で溶出されるのでその活性区分を集め、
予め０．０１　Ｍリン酸緩衝液で平衡化したダイヤイオ
ンＨＰ−２０ＡＧ（三菱化成社製）カラム（３，ＯＸ４
０ｃｍ＞に吸着させた。

同緩衝液で十分洗浄後、１０％アセトンで溶出した。活
性区分を集めドライアイストラップを使用して減圧下約
１ｍｌなるまで濃縮し、これをセルロファインＧＣ−１
５−ｍ（チッソ社製）カラム（１，９Ｘ６５ｃｍ）でゲ
ル濾過を行った。活性区分を凍結乾燥して抗生物質０Ａ
−６１２９Ｂ−リン酸エステル１１．３■を得た。

得られた抗生物質０Ａ−６１２９Ｂ−リン酸エステルは
以下の諸特性を示した。

（１）紫外部吸収スペクトラム ０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７、４）中で測定λ１１
、ｎｍ　：３０２、Ｅ、’、：８２．４（２）核磁気共
鳴スペクトラム（溶媒＝Ｄ２０、内部基準ＤＳＳ） δ（ｐｐｍ）： ２．４７（２Ｎ、ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、ＮＨ−ＣＨ２−
ＣＨ２−ＣＯ）２．８０〜４．５０（１４ｔｌ、ｍ、　
Ｃ−４Ｈ２、Ｃ−５Ｈ，Ｃ−６Ｈ１ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ
，−ＣＯ２ （３）呈色反応 エールリッヒ試薬：陽性 塩化白金酸反応：陽性 モリブデン酸反応：陽性 ニンヒドリン反応：陰性 （４）ペーパークロマトグラフィー 東洋濾紙Ｎｏ、　５０ 展開溶媒　アセトニトリル：０．ＩＭ　　Ｔｒ　ｉ　５
−ＨＣｌｉ街液（ｐＨ７，５）　：０．１Ｍ　　ＥＤＴ
Ａ＝１２０：３０：１検出方法　ｃｏｍａｍｏｎａｓ　
ｔｅｒｒｉｇｅｎａ　Ｂ９９Ｂによるバイオオー１へグ
ラフィー Ｒｆ値　０．０１（この時抗生物質０Ａ−６１２９Ａ、
及び抗生物質ＰＳ−５のＲｆ値はそれぞれ（０，２６，
０，３１であった。）（５）高圧濾紙電気泳動 ワットマンＮｏ、　１濾紙 ベロナール緩衝液（ｐＨ８，６＞ １５００Ｖ　／　３０ｃｍ、５０分逆通電出方法　Ｃｏ
ｍａｍｏｎａｓ　ｔｅｒｒｉｇｅｎａ　Ｂ９９６による
バイオオー１〜グラフイー 移動度　陽極側に１１〜１２ｃｍ　（この時、抗生物質
０Ａ−６１２９Ａは４〜５舗、ＰＳ−５は６〜７１陽極
側に移動した。）（６）フォスファターゼに対する挙動 アルカリフォスファターゼ（シグマ社Ｐ　３８７７　）
処理により分解され、抗生物質０Ａ−６１２９Ｂを生じ
る。

実施例４ 抗生物質０Ａ−６１２９Ｃ−リン酸エステルの調製抗生
物質０Ａ−６１２９Ｃ１■（力価相当）をＭ１５リン酸
緩衝液（ｐ１１７．４）０．２ｍｌに溶解し１００ｍＭ
　　ＡＴＰ溶液（ＮａＨＣＯ３でｐＨ６〜７に調整）　
０．０５ｍ１．１００　ｍ　Ｍ　　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４溶
液０．０５ｍ１、実施例１と同様にして得られた菌体懸
濁液０．２ｍｌを加え、攪拌後ラウリル硫酸ナトリウム
０．５■を添加し３５℃で４時間振盪した。反応後、遠
心分離により菌体を除去し、上清について高圧ｒ紙電気
泳動を下記の条件で行ったところ、陽極側６．５備の所
にわずかな原料スポットと９．４１の所に新たな０Ａ−
６１２９Ｃ−リン酸エステルのスポットが認められた。

高圧Ｐ紙電気泳動 ワットマンＮｏ、　１＄紙 ベロナール緩衝液（ｐＨ８，６） １５００Ｖ／　３０ａｍ、３０分逆通 電出方法　Ｃｏｍａｍｏｎａｓ　ｔｅｒｒｉｇｅｎａ　
Ｂ９９６によるバイオオートグラフィー 移動度（全て陽極側） 抗生物質　　０Ａ−６１２９Ｃ６〜７備ｎ０Ａ−６１２
９Ｃ−リン酸エステル　９〜１０ｃｎｌＩＩ　　　　　
ＯＡ　　６１２９Ａ　　　　　　　　　　２〜３ａｕノ
ア　　　　　　　　　ＰＳ　　　５　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　４〜５ｃｎ又、抗生物質０
Ａ−６１２９Ｃ−リン酸エステル区分を切り出し、０．
０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，／ｌ　）て′ｔｕｂ出後
、アルカリフォスファターゼ（シグマ社Ｐ３８７７）処
理したものを再び高圧濾紙電気泳動を行ったところ、抗
生物質０Ａ−６１２９Ｃのスポットが認められた。

本発明の原料に用いられる抗生物質０Ａ−６１２９物質
の調製法を以下の参考例に示す。

参考例 （Ａ　）　　５００ｍ１容エルレンマイヤーフラスコに
１００ｔｎｌの下記組成の種母培地（Ｓ−１）を入れ、
常法により、１２０℃で１５分間殺菌した。

一方、ストレピトミセス・エスピー０Ａ−６１２９（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ、　　０Ａ−６１２９）
菌株の胞子を充分着生させ、この−白金耳を上記種母培
地に接種し、２８℃で４８時間ロータリーシェーカー（
２００ｒｐｍ、振幅７　ＣＲ）振盪培養した。この種母
培養液２００ｍ１を、下記組成の種母培地（ＳＥ−４＞
１５１を入れた３０．０容ジヤー・ファーメンタ−に接
種し、２８℃、４００ｒｌ）ｍで攪拌及び７．１／　ｍ
　ｉ　ｎ通気の条件下に９０時間通気攪拌培養を行った
。消泡剤としてシリコンＫＭ−７５（登録商標・信越化
学■製〕を０．０７％使用した。

（Ｂ）上記（Ａ）で得られた２４時間培養後の種母培養
液２ｇを下記組成の生産培地（ＧＭ−１＞　　１００．
ｆ！を入れた２００ｇ容醗酵タンクに接種し、２８℃、
２００ｒｐｍで攪拌及び５０１／ｌｌｌ１ｎ通気の条件
下に９０時間通気攪拌培養を行った。消泡剤としてシリ
コンＫＭ−７５（前出〕を０．０７％使用した。

経時的に培養液をサンプリングし、遠心分離した上澄液
についての抗菌力の測定を行った。

各時間における測定結果は、下表に示す通りであった（
抗菌力価はＰＳ−５ナトリウム塩相当力価である）。

培養時間（時間）　　　　抗菌力価（μａ／ｍ１）４８
２・６ 種母培地（Ｓ−１＞の組成： 大豆粉 酵母エキストラクト ポテトスターチ Ｃａ　ＣＯ３ ｐＨ（殺菌前） 種母培地（ＳＥ−４＞の組成： 牛肉エキストラクト トリプトン グルコース 溶性でんぷん 酵母エキストラクト ａＣＯ３ 大豆粉 ｐＨ（殺菌前） １１．５ ２４．０ １．５％（Ｗ／Ｖ） ０．５　　　　　ノ１ ２、Ｏｎ Ｏ，２ｎ ７．０ ０．３％（Ｗ／Ｖ） ０．５　　　７７ ０．５　　　　ＩＩ ２．４　　　　ｎ Ｏ，５７７ Ｑ、４　　　１１ Ｑ、５　　　　ｎ ７．５ 生産培地（ＧＭ−１）の組成： グリセリン　　　　　　　８．０％（Ｗ／Ｖ）魚粉　　
　　　１．０ツノ 大豆粉　　　　　　　　　　３．Ｏｎ ＣａＣ０，０，３１１ に２　ＨＰＯ４０，２ｌｌ Ｍｇ５ｏ４　　　　　　　′　０．２　　　ｔｔ殺菌前
に、Ｎ　ａ　ＯＨ″Ｃ′ｐｌ−１を７．２に調整。

別にｐｕｓ、５の０．ＯＩＨリン酸緩衝液中に溶解し、
且つオートクレーブで１ｋ（１／ｃＪＧ　、５分間殺菌
したビタミンＢ、２を０゜０００５％（Ｗ／Ｖ）添加。

（Ｃ）上記ＣＢ）で得られた９０時間培養後の醗酵液ｉ
　ｏｏ、。

に５％（Ｗ／Ｖ）量のドブコバーライトＮｏ、３４　　
（登録商標・東回パーライト■製〕を添加し、バスケッ
ト型遠心分離器で菌体を分離し、９０ρの培養を液を得
な。これをダイヤイオントＩＰ−２０［登録商標・三菱
化成（珠製〕充填カラム（１５Ｘ１００ｃｍ＞に吸着さ
せ、蒸留水５ｇで洗浄後、３０％（Ｖ／Ｖ）アセトン水
溶出しな。１画分を１．０．Ｉ！とし、その溶出液を分
画した。バイオアッセイ活性画分８から画分１５までの
合計８．０９の溶出液を集め、これをダイヤイオンＰＡ
３０６　Ｓ　（登録商標・三菱化成側製〕充填カラム（
８Ｘ６０ｃｍ＞に吸着させ、蒸留水１．０Ｍで洗浄後、
３．０％食塩水で溶出した。５００ｍ１ずつ溶出液を分
画し、バイオアッセイ活性画分７から両分１６までの合
計５．０９の抗生物質０Ａ−６１２９Ａ、Ｂが含まれた
溶出液を集めた。

続いて、上記のＰＡ３０６Ｓ充填カラムを３０％食塩水
で溶出し、５００ｍ１ずつ溶出液を分画し、バイオアッ
セイ活性画分３から両分１６までの合計７．Ｏｆｆの抗
生物質０Ａ−６１２９Ｃが含まれた溶出液を集めた。

抗生物質０Ａ−６１２９Ａ、Ｂを含む溶出液５．０１に
３００　ｇの食塩を加え、ダイヤイオンＨＰ−２０充填
カラム（６Ｘ　１５０Ｇ＋１　＞に吸着させ、蒸留水５
００ｍ１で洗浄後、濃度が０％から４０％まで直線的に
増加するアセトン水合計４．Ｏ，ｌｌで溶出した。

１区分を１７ｍ１として、その溶出液を分画した。バイ
オアッセイ活性画分２０から画分１３０までの約１．８
．０の溶出液には、主に抗生物質０Ａ−６１２９Ｂと若
干の抗生物質０Ａ−６１２９Ａが含まれていた。バイオ
アッセイ活性画分１３１から画分１７０　　までの約７
００ｍ１の溶出液には０Ａ−６１２９Ａが含まれていた
。上記の２区分をそれぞれ凍結乾燥し、茶褐色の粉末を
得た。

抗生物質０Ａ−６１２９Ａの精製 ＣＤ）抗生物質０Ａ−６１２９Ａを主に含む溶出液を、
凍結乾燥することによって得られた茶褐色粉末を、少量
の蒸留水に溶解し、バイオゲルＰ−２（登録商標・バイ
オラット社製）充填カラム（８Ｘ１００■）に導き、蒸
留水で展開し、バイオアッセイにより活性画分ｉ、ｏｎ
　ｔ−集めた。この活性画分を予め、０．０１）１リン
酸桜街液（ｐＨ８，４）で平衡化したＱＡＥ−セファデ
ックスＡ−２５（登録商標・ファルマシア社製）充填カ
ラム（４Ｘ４０Ｇ１１＞に吸着させ、上記緩衝液２００
ｍ＋で洗浄後、濃度が０％から４％まで直線的に増加す
る食塩水（合計３．０．ｌ））で溶出を行った。溶出液
を１５ｍ１ずつ分画し、バイオアッセイを行い、画分５
１から画分７０まで、合計３００ｍ１の活性画分を得た
。

この両分を凍結乾燥し、黄褐色の粉末を得た。

この粉末を少量の蒸留水に溶解し、５ｇの食塩を加え、
ダイヤイオンＨＰ−２０ＡＧ（登録商標・三菱化成（…
製〕充填カラム（２Ｘ５０■）に吸着させ、５％食塩水
５０ｍ１で洗浄後、蒸留水１００ｍ１で洗浄した。濃度
が０％から３０％まで直線的に増加するアセトン水（合
計１．０１）　）で溶出し、１両分を１０ｍ１とし、そ
の溶出液を分画した。バイオアッセイにより、活性画分
３５から画分４５までの合計１１０ｍ１を集め、これを
凍結乾燥すると黄褐色の抗生物質０Ａ−６１２９Ａの粗
粉末５２ｍ１が得られた。

該粉末を、少量の蒸留水に溶解し、セファデックスＧ−
１０（登録商標・ファルマシア社製）充填カラム（２Ｘ
８０ｃｍ）に導き、蒸留水で展開し、バイオアッセイに
より活性両分３０ｒｎｌを集めた。この活性画分を予め
、０．０ＩＨリン酸緩衝液（ｐＨＢ、７ｍ）で平衡化し
た　ＱＡＥ−セファデックスＡ−２５（前出）充填カラ
ム（２Ｘ３０ｃｍ）に吸着させ、上記緩衝液５０ｍ１で
洗浄後、濃度が０％から５％まで直線的に増加する食塩
水（合計８００ｍ１　）で溶出を行い、溶出液を５ｍｌ
ずつ分画した。バイオアッセイにより、活性画分３６か
ら画分４０までの合計２５ｍ１を集めた。

この両分に４ｇの食塩を加え、ダイヤイオンＨＰ−２０
ＡＧ〔前出〕充填カラム（２Ｘ４０ｃｍ）に吸着させ、
蒸留水５０ｍ１で洗浄後、濃度Ｏ％から３０％まで直線
的に増加するアセ１−ン水（合計８００ｍ１　＞で溶出
し、１両分を５ｍｌとし、その溶出液を分画した。

バイオアッセイにより、活性画分１０５から画分１１７
の合計６５ｍ１を集めた。

これを凍結乾燥することにより抗生物質０Ａ−６１２９
Ａの淡黄色粉末２１■を得た。

得られた抗生物質０Ａ−６１２９Ａの凍結乾燥標品は次
の特性を示した。

（１）形状：淡黄色粉末 （２）比旋光度：〔α）　Ｐ　：　１１．６°（Ｃｍ１
．０、ｏ、　ｏｉＨリン酸緩衝液、ｐＨ８，４） 但し、紫外部吸収においてλ、、、Ｘ３００ｎｍのεを
５６００とした時の値である。

（３）分子式 １ｊｌｊ論分子式Ｃ２ｏＨ，，Ｎ、、０７ＳＮａ（）？
、Ｗ、−４７９）（４）紫外部吸収スペクトラム ０、０ＩＨリン酸緩衝液（ｐＨ８，４）λ１１、ｎｍ　
（ε）　　３００（５６００）（５）赤外部吸収スペク
］〜ラム（Ｋ［３ｒ）の主要ピークｌ　。

ｐＨ１１，、Ｃｍ　　。

１７（３０（β〜ラクタム） １６６０　（アミド） １６００　（カルボキシレート〉 （６）核磁気共鳴スペクトラノ＼（溶媒：Ｄ２０）（内
部基準：　ＤＳＳ） δ（Ｅ）ｌ）ｍ）　： １．００（３１１，ｔ、Ｊ＝７．５１１ｚ、　　ＣＩ−
（２’−ＣＩ−ｈ　）１．６０〜２．００（２１１，ｍ
、　　　　ＣＨ２−ＣＨ３）２．４８（２１１，ｔ、Ｊ
＝７．５１１Ｚ、Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ）２．８０
〜３．６５（１１Ｎ、ｍ、　Ｃ−４Ｈ２、Ｃ−６ＨｌＳ
−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ，ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２（Ｅ）
抗生物質０Ａ−６１２９Ｂの精製抗生物質０Ａ−６１２
９８を主に含む溶出液を、凍結乾燥することによって得
られた茶褐色の粉末を、少量の蒸留水に溶解し、バイオ
ゲルＰ−２（前出）充填カラム（８Ｘ１００■）に導き
、蒸留水で展開し、バイオアッセイにより活性画分１、
ＯＮを集めた。この活性区分を予め、Ｏ，Ｏ１Ｈリン酸
ｆｆｊ（ｌｑ液（ｐＨ８，４）で平衡化したＱＡＥ−セ
ファデックスＡ−２５（前出）充填カラム（４ｘ４０ｃ
ｍ　＞に吸着させ、上記緩衝液２００ｍ１で洗浄後、濃
度が０％から４％まで直線的に増加する食塩水（合計３
．０．ｌ）　）で溶出を行った。溶出液を１５ｍ１ずつ
分画し、バイオアッセイを行い、画分５１から画分７０
まで、合計３００ｍ１の活性画分を得た。

この粉末を少量の蒸留水に溶解し、５ｇの食塩水を加え
、ダイヤイオンＨＰ−２０ＡＧ　（前出）充填カラム（
２Ｘ５０ｃｍ＞に吸着させ、５％食塩水５０ｍ１で洗浄
後、蒸留水１００ｍ１で洗浄した。濃度が０％から３０
％まで直線的に増加するアセＩ・ン水（合計１．Ｏ，ｌ
！　＞で溶出し、１両分を１０ｍ１とし、その溶出液を
分画した。バイオアッセイにより活性画分１５から画分
３５まで合計２１０ｍ１の区分を得た。この区分を凍結
乾燥することにより抗生物質０Ａ−６１２９Ｂの黄褐色
粉末が得られた。得られた抗生物質０Ａ−６１２９Ｂの
凍結乾燥標品は次の特性を有した。

（１）・形状：淡黄色粉末 （２）比旋光度：〔α〕計４．７°（ｃ＝１．０，０．
０１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ８，４） 但し、紫外部吸収においてλ１１．３００１ｍのεを５
４００とした時の値である。

（３）分子式 理論分子式Ｃ２，Ｈ３，Ｎ、０ＢＳＮａ（）１．Ｗ、−
４９５）（４）紫外部吸収スペクトラム ０、０１８リン酸桜街液（ｐＨ８，／ｌ）λ１１、ｎｍ
　（ｅ　）　　３００（５４００）（５）光外部吸収ス
ペクトラム（Ｋ　Ｂ　ｒ　）の主要ピークｌ　。

シ□、０１１゜ １７６０（β−ラクタム） １６６０　（アミド） １６００　（カルボキシレート） （６）核磁気共鳴スペクＩへラム（溶媒：ＤｚＯ）（内
部基準：　ＤＳＳ） δ（１）ｌ）ｍ）　： し１″ｉ３−シ ２．４５（２Ｈ，ｔ、Ｊ＝７．０Ｉｌｚ、　Ｎ　Ｈ−Ｃ
Ｈ２−ＣＨ２−ＣＯ）３．９４（ＩＨ，ｓ、ＨＯ−ＣＨ
−ＣＯ）（Ｆ）抗生物質０Ａ−６１２９Ｃの精製前期の
抗生物質０Ａ−６１２９Ｃを含む溶出液７．Ｏ，ｌｌを
ダイヤイオンＨＰ−２０（前出）充填カラム（５Ｘ８０
ｃｍ　）に吸着させ、ｏ、　ｏｉＨリン酸緩衝液（１）
１１８．４）１．鯵で洗浄後、濃度が０％から２０％ま
で直線的に増加するアセトン水（合計６．０ｇ）で溶出
液を２５０ｍ１ずつ分画し、画分９から画分１３までの
合計１．２５Ｎの溶出液を得た。

この溶出液を、３％アルキルジメチルベンジルアンモニ
ウムクロライド〔東京化成（１朱製〕を含むメチレンク
ロライド１．Ｏｇで抽出を行い、続いて、抽出後のメチ
レンクロライド層を８％ヨウ化ナトリウム水溶液３００
ｍ１で再抽出を行った。

得られた抽出液３００ｍ１を予め０．０１）１リン酸桜
街液（ｐｌ＋８．４）で平衡化したバイオゲルＰ−２（
前出）充填カラム（８×１００■）に導き、上記緩衝液
で展開し、バイオアッセイを行い、活性画分１．２ｇを
集めた。

この溶出液をダイヤイオンＨＰ−２０充填カラム（４Ｘ
６０ｃｍ＞に吸着させ、蒸留水６００ｍ１で洗浄後、濃
度が０％から１０％まで直接的に変化するアセトン水（
合計３．Ｏ，Ｑ）で溶出した。溶出液を１５ｍ１ずつ分
画し、バイオアッセイを行い、画分４１から画分１１５
までの合計１．１．１！の活性画分を得た。この溶出液
を予め０．０ＩＨリン酸緩衝液（ｐＨ８，４）で平衡化
したＱＡＥ−セファデックスＡ−２５（前出）充填カラ
ム（４Ｘ４０ｔｒｎ）に吸着させ、上記緩衝液５００ｍ
１で洗浄後、濃度が０％から５％まで直線的に増加する
食塩水（合計３．Ｏ，ｌｌ　）で溶出を行った。溶出液
を１５ｍ１ずつ分画し、バイオアッセイを行い、画分１
１２から画分１３９までの合計４２０ｍ１の活性画分を
得た。次に、この活性画分に最終濃度が５％になるよう
に食塩を加え、ダイヤイオント（Ｐ−２０ＡＧ　（前出
〕充填カラム（３Ｘ６０ｃｍ　＞に吸着させ、脱イオン
水で溶出をおこなった。溶出液を１５ｍ１ずつ分画し、
バイオアッセイを行い画分３１から画分４８まで、合計
２７０ｍ１の活性画分を得な。この活性画分を凍結乾燥
し、１３５■の黄褐色の粉末を得た。

この粉末１３５■を少量の蒸留水に溶解し、セファデッ
クスＧ−１０（前出）充填カラム（２Ｘ７０（１））に
導き、蒸留水で展開し、バイオアッセイを行い、活性画
分合計６８ｍ１を得な。

これを予め０．０ＩＨリン酸緩衝液（ｐＨ８，ｄ）で平
衡化したＱＡＥ−セファデックスＡ−２５充填カラム（
ｌｌＸ３０ｃｍ　＞に吸着させ、上記緩衝液８００ｍ１
で洗浄後、濃度が０から５％まで直接的に増加する食塩
水（合計２．／１．１！＞で溶出しな。溶出液を１３ｍ
１ずつ分画し、バイオアッセイを行い、画分１１８から
画分１３９まで合計２８６ｍ１を得た。

これに、最終濃度が５％になるように食塩を加え、ダイ
ヤイオンＨＰ−２０ＡＧ充填カラム（３Ｘ６０ｃｍ　）
に吸着させ脱イオン水で溶出を行った。溶出液を１０ｍ
１ずつ分画し、３００ｎｍに、紫外部極大吸収を有する
両分を合計９０ｍ１集めた。

これを、凍結乾燥し、１８■の淡黄色の抗生物質０Ａ−
６１２９Ｃ粉末を得た。

得られた抗生物質０Ａ−６１２９Ｃの凍結乾燥標品は次
の十ｌ性を示した。

（１）形状：淡黄色粉末 （２）比旋光度：〔α〕Ｐ　　１７．４″（Ｃ−０，５
５、Ｏ，ＯＩＮリン酸緩衝液、ｐＨ８，２） （３）元素分析値（Ｃ２０Ｈ２９Ｎ３０１１Ｓ２　Ｎａ
２　’　２Ｈ２０として） 計算値　Ｃ３７，９１％、８　５．２５％、Ｎ　　６．
６３％、３１０．１２％ 分析値　Ｃ３７，６１％、Ｈ５，００％、Ｎ　　６．３
８％、３　９．５２％ （４）分子ｉ　　５９７．５７３１　（分子式Ｃ２ｏＨ
２，Ｎ３０１，５２Ｎａ（５）紫外部吸収スペクトラム ０、０１）ｆリン酸緩衝液（ｐＨ８，４）λ、、、　ｎ
ｍ　（ε）　：　３００．５（７６００）（６）光外部
吸収スペクトラム（Ｋ　Ｂ　ｒ　）の主要ピークｌ　。

νｌ、（ｆｆｌｌ　　　＋ １７５０（β−ラクタム） １６６０〜１５９５　（アミド、カルボキシレート〉１
２５０〜１２２０　（硫酸エステル）（７）核磁気共鳴
スペクトラム（溶媒：　Ｄ　２０　）（内部基準：　Ｄ
ＳＳ） δ（ｐｐｍ）　： ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃｏ、 ｓ−ｃ旦２−ｃ旦２−ＮＨ） ３．８３（１１１，ｄｄ、Ｊ＝５．５ｔｌｚ、Ｊ＝９．
５Ｈｚ、　Ｃ３，９４（ｌｔｌ、ｓ、、ＨＯ−ＣＨ−Ｃ
Ｏ）４．４０〜４．４３（ＩＨ，ｍ、　Ｃ−５Ｈ）６Ｈ
）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、Ｒは水素原子、水酸基又はヒドロキシスルホニル
   オキシ基を表す、 で示される化合物及びそれらの塩。