JPH0213385A - ジカルボン酸の製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はモノカルボン酸の生化学的酸化によってジカル
ボン酸を製造する方法に関する。より詳細には、この生
化学的酸化は適当な基質中で酵母を増殖させることによ
り行う。

各種出発物質から中鎖ジカルボン酸を生化学的に製造す
ることは公知の方法であり、特に下記の文献に記載され
ている。

特開昭４９−１９０８５号公報（旭電化工業株式会社）
には、尿素、リン酸塩、及び数種の金属塩を含有する培
地中でカンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄ　ｉ　ｄａｔ
ｒｏｐｉｃａｌｉｓ）を培養することによって、炭素原
子を８個より多く含むモノカルボン酸のエステルをジカ
ルボン酸に酸化することが記載されている。

特開昭４８−３９６９０号公報（三井造船株式会ネ１）
には、硝酸アンモニウム、リン酸塩、金属塩及び酵母エ
キスを含有する培地中のカンジダ・ロプストラ（Ｃａｎ
ｄｉｄａ　１ｏｐｓｔｒａ　）　ＨＦ１による炭素原子
数８乃至１３のｎ−パラフィン類のジカルボン酸への酸
化が記載されている。

特開昭４９−４３１５６号公報＜ｍ沢薬品工業株式会社
）には、リン酸アンモニウム、ピオチン、数種のリン酸
カリウム及び硫酸マグネシウムを含有する培地中のカン
ジダ・トロピカリスによるｎ−ヘキサデカンのアジピン
酸への酸化が記載されている。

特開昭５８−１２１７９７号公報（三井石油化学工業株
式会社）には、窒素源及びリン酸塩を連続的又は断続的
に供給して、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）酵
母株によってｎ−パラフィン類をジカルボン酸に酸化す
ることが記載されている。培地中のアンモニウムイオン
濃度は例えば１００乃至７００　Ｄｉａｌ　、好ましく
は１００乃至４００　ｐｐｍである。窒素源及びリン酸
を連続的又は断続的に供給するという技術は最終的なジ
カルボン酸濃度を著しく増加させると記載されている。

米国特許第３，９７５，２３４号公報［フィリップス・
ベトロリューム社（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ　Ｐｅｔｒｏｌｅ
ｕｎ＋　Ｃｏ）　］には、少なくとも１種の炭水化物源
及び極めて低濃度の代謝可能な窒素を含有する炭化水素
無添加培地中でトルロプシス・ボムビコーラ（Ｔｏｒｕ
ｌｏｐｓｉｓｂｏｍｂｉｃｏｌａ）の変異株を予め増殖
させて、酵母中で最大３％窒素とし、続いて窒素源は含
まないが炭水化物は含む非増殖性転化用培地中の非増殖
性条件下でこの微生物をｎ−アルカン、ｎ−アルコール
又はこれらの混合物と接触させることによって、Ｃ６乃
至Ｃ２２ｎ−アルカン、ｎ−アルキルアルコール、又は
これらの混合物をジカルボン酸に酸化させることが記載
されている。この二段階法はｎ−アルカン、ｎ−アルキ
ルアルコール、又はこれらの混合物を対応するジカルボ
ン酸により選択的に転化し、その結果それよで得られて
いたちのより炭素鎖の欠落が少なくなった。

本発明は比較的簡単な一段階法でジカルボン酸が選択的
かつ良好な収率で得られるような、中鎖モノカルボン酸
の生化学的酸化の方法を供することを目的とする。

本発明の方法は、毒性を有さないレベルの０８−０１８
モノカルボン酸又はグリセリドを含んだ炭素源含有培地
中で窒素制限酵母を増殖させて、（条件に応じて）Ｃａ
、Ｃ＋ｏ、及びＣＩ２ジカルボン酸を製造する。「窒素
制限酵母」とは、最適値より少ないｍ１好ましくは４乃
至９重量％、より好ましくは５．５重量％より大で７重
量％未満の同の代謝可能な窒素を含むｗｌ母を意味する
。窒素は好ましくはＮＨ４”″イオン及び／又は有機窒
素として適当量を培地に供給するのが好ましい。

培地中の炭素源としては、例えばスクロース、グリセロ
ール、又はエタノールを、例えば３．５ｇのリン酸アン
モニウム［（ＮＨｉ　）２１１ＰＯＡ　］を含有する培
地１リットル当り３０９のスクロースのように、適当ａ
用いることができる。

１転化に関する脂質基質は、増殖期が終わりに近づく頃
に培地中に供給するａＣａ−ＣＩ８Ｉ２ジカルボン酸の
ままの形で供給してもよいが、Ｃａ−Ｃ＋ｏモノカルボ
ン酸に関しては酵母に有害な影響を与えないように培地
中の′ａ度を０．２ｇ／ｆＪ未満に保つように注意しな
くてはならない。

従って、場合によっては、その毒性がほとんど問題とな
らない、エステル、好ましくはトリグリセリドの形でモ
ノカルボン酸を供給することが有利である。

本発明の実施に用いられる酵母はカンジダでもトルロプ
シスでもよい。特に好ましいのはカンジダ・クロアセニ
ーのようなカンジダ稜であり、特に低いβ酸化活性を示
す株又は変異株が好ましい。

このような特に好ましい株の一つでありカンジダ・クロ
アセニー５　ＧＬ＾１２は天然油中の脂肪酸から主とし
てＣａ、Ｃｏｏｓ及びＣ＋ｚジカルボン酸（条件に依存
する）を生じさせるという驚くべき性質を有している。

ジカルボン酸への生化学的酸化の時間は−・般に２０乃
至２００時間である。酸化の温度は通常１５乃至約４５
℃の範囲内であり、好ましくは２０乃至３７℃である。

適当量の窒素化合物の他に、培地中に金属塩、特にマグ
ネシウム及びカルシウム、リン酸塩、及びビオチン、チ
アミン、ニコチン酸、ピロトキシン及びパントテン酸塩
などの補因子を含有させると良好な結果が得られる。

生化学的酸化を行った後、微生物は標準的な手法によっ
て培地から分離し、ジカルボン酸を例えば溶媒抽出によ
って回収してさらに精製する。このようにして得られた
ジカルボン酸は、例えばポリアミド及びポリエステルの
製造における有用な材料である。

実施例１−４ 菌体及びインキュベーション条件 アルカン、脂肪酸、及びトリグリセリドを唯一の炭素源
として利用することができることが知られているカンジ
ダ・クロアセニーの一菌株（ＦＥＩｔＨＰ−４１０１を
、β酸化の途絶した変異株を生じさせるための突然変異
計画の親株として用いた。突然変異の誘発はＮ−メチル
ートニトロソグアニジンを用いて行い、脂肪酸又はアル
カンを炭素源とした酵母窒素ベース［デイフコ（Ｄｉｒ
ｃｏ）　］上ではほとんど増殖しないが、酢酸又はグル
コースを炭素源とした酵母窒素ベース上では良好に増殖
するものを選択してβ酸化陰性の変異株を単離した。

変異株は適当量のグルコースを炭Ｘ源として添加し、か
つ適当量の（ＮＨ４）２　ｔｌＰＯ４又は酵母エキス（
デイフコ）を窒素源として添加したものから成る限定培
地中で増殖さゼた。培地の他の成分は下記の通りであっ
た。

成　　分　　　　　　　　　　　　　　県Ｎａｚ　ＳＯ
４０，７５ｇ／　１ にＨ２ＰＯ４３，２９／　１１ ＨｇＣＩｚ　　　　　１．０９／ｌｌ ＺｎＳＯ４１０Ｒ２Ｚｎ ＨｎＳＯ４１０１＄／ｆＪ ＦｅＳＯ４１０ｑ／Ｎ ニコチン酸　　　　　１５　　　η／１パントテンｌ！
Ｆ！　　　　　３　　　η／１ピリドキシン　　　　１
０　　　ｊｌ！Ｊ／ｆＩヂアミン　　　　　　　４　　
η／９ ビオチン　　　　　　５０　　μｇ／ｌ各種の培養によ
って得られた！Ｉ母ｔＩＡＩＩ＆はある窒素含有量の範
囲を有し、これは下記の式によって計暮される。

静止ＩＩＩＪ（２４乃至４８時間後）にトリグリセリド
基質（１０％の０８及び３０％のＣ＋ｏ脂肪酸を含む合
成トリグリセリド）を加え、インキュベーションを続け
た。生成物の分析のために試料を分取し、分析は酸性化
に続いてエーテルで抽出し、ガスクロマトグラフィーで
ジカルボン酸のシリルエーテルとしてジカルボン酸を分
析することによって行った。

２５ｇ／Ｊｌのグルコースを炭素源とし、かつ１乃至４
’Ｊ／Ｊの濃度範囲にある（ＮＨ４）２　ｔｌＰＯ４を
窒素源とした培地中でカンジダ・クロアセニー（変異株
５　ＧＬＢ　１９　）を５回増殖させた。静止用に２５
ｇ／９の合成トリグリセリドを加え、４日間インキュベ
ートした。生成物はＣ８及びＣ８−Ｃ１０ジカルボン酸
及びＣ８及びＣ＋ｅ脂肪酸であった（表１）。

表１ （ＮＨ４）２８ＰＯ４バイオマス　　ジカルボン酸　　
　　脂肪酸ｇ／ｌ　　　中の％Ｎ　　（Ｃｓ　”Ｃ８−
Ｃ１０）　’Ｊ／ｊ　　（Ｃ８＋Ｃ８−Ｃ１０）　ｇ／
’Ｊ１．５３．６　　　　　１．０１　　　　　　　０
２．５　　　　５．５　　　　　２．０　　　　　　　
０．０５３．５　　　　７．Ｇ　　　　　　１．２１　
　　　　　　０．９５４　　　　　８、８　　　　　０
．５　　　　　　　１．６本実施例においては、窒素含
有量が５．５％（ｗ／ｗ）の酵母細胞が最大量のジカル
ボン酸を生成した。

遊離の脂肪酸も主として窒素に富んだ細胞によって生成
した。様々な黴の０６ジカルボン酸（アジピンｌ’ｉり
も観察され、β酸化活性が幾らか残っていることを示し
た。アジピン酸の量はこれらの結果には含めていない。

実施例５−１２ ３０ｇ／ｊのスクロースを炭素源とし、かつ２．５乃至
５．５ｇ／４１の濃度範囲にある（ＮＨ４）２　ＨＰＯ
ａを窒素源とした培地中でカンジダ・クロアセニー（変
異株５　ＧＬＢ　２１）を９回増殖させた。静止期に３
０ｇ／ｇの合成トリグリセリドを加え、５日間インキュ
ベートを続けた。生成物はＣ８及び０１Ｇジカルボン酸
及びＣ８及びＣ＋ｏ脂肪酸であった（表２）。

表２ ２．０　　４　　　０．７５　　　０．０３２．５　　
５．３　　１．２３　　　０゜０５３．０　　５．７　
　３．６　　　０，０９３．５　　６．２　　６．９３
　　　　Ｑ、１３４．０　　６．７　　６．１５　　　
０．１４．５　　７．５　　１．３３　　　２．０５．
０　　８．３　　０．７６　　　４．２５．５　　９．
０　　０．３１　　　６．２この変異株については、窒
素含り聞が６．２乃至６．７％（ｗ／ｗ）の１胞が最大
重のジカルボン酸を生成した。脂肪酸は主として窒素制
限の少ない細胞によって生じた。

実施例１３−１７ ３０９７Ｍのスクロースを炭素源とし、かつ３１５至１
２ｇ／ｊ！の濃度範囲にある酵母エキス（デイフコ）を
窒素源とした培地中でカンジダ・クロアセニー（変異株
５　ＧＬＢ　２１）を８回増殖させた。静止１組に３０
ｇ／４１の合成トリグリセリドを加え、５日間インキュ
ベートを続けた。生成物は表３に示す。

表　　３ ６　　３．９　　２．２　０．０１ ７　　４．３　　２．８　０．３７ ９　　５．４　　３．４ １０　　５．７　　４．１　０．３５ １２　　６．９　　３．４　０．８ 実施例１８−１９ ３０ｇ／Ｊｌのスクロースを炭素基質とし、かつ３又は
３．５ｇ／、１１の（ＮＨ４）２１１ＰＯ４を窒素源と
した培地中でカンジダ・りＯアセニー（変異株５ＧＬＡ
１２　）を増殖させた。静止期に４２ｇ／ρのココナツ
ツ油を加えた。表４は３．５ｇ／ｊの（ＮＨａ　）２１
１ＰＯａで増殖させた細胞によるジカルボン酸生成の時
間経過を示したものである。

表　　４ １１．０ ２３．０ ４６．１ １３　　　　１０．８ ７７．１ この実施例においては、生成型は６日後に最大となり、
その後減少した。表５はジカルボン酸（アジピン酸は除
く）の総量の最大値を示づ。最大値はどちらの酵母の場
合にも５又は６日後に得られた。

表　　５ ３．０　　５．５　　　９．９ ３．５　　７．７　　１０．８ ココナツツ油はＣａ　−Ｃｐｓの範囲の脂肪酸を含んで
いるが、５ＧＬＡ１２株は鎖長がＣ８及びＣ＋ｅのジカ
ルボン酸を選択的に集積する能力を有していた。

表６は実施例１９で生じたジカルボン酸の鎖長とココナ
ツツ油基質中の脂肪酸の鎖長を比較したもので、Ｃ８及
びＣ＋ｏジカルボン酸が選択的に生成していることを示
している。

表　　６ Ｃｓ　　　Ｏ６ Ｃ８７５９ Ｃｏｏ　　　９　　　　３５ ＣＩ２　　５０ ＣＩ６　　１０ Ｃｏｏ：＋　　７ 実施例２０−２４ 全成分の濃度を２倍にしたことを除いては表１のらのと
同一の組成を有する培地中で変異株５１ＧＡ１２を生育
させた。炭素源は６０ｇのスクロースであり、かつ窒素
源は５乃至１０９／４１の濃度範囲の（ＮＨ＋　）２１
１ＰＯ４であった。増殖期間はスクロースを完全に利用
するように４８時間として、ココナツツ油基質を４２９
７１の濃度となるように加えた。

表７は、このより濃縮した培地中で生じさせたより多量
のバイオマスがジカルボン酸の集積を表４よりもより速
くかつより高濃度に行うことを示している。ジカルボン
酸生成物は主としてＣ８及びＣ＋Ｑであり、初期の試料
には幾らかのＣＩ２が含まれている。この実験において
は、５．８％の窒素を含むバイオマスが最も多量のジカ
ルボン酸生成物を生じた。Ｃ８及びＣｔｏジカルボン酸
の量と収率は、特にバイオマス中の最適窒素含有量のも
のについて、ココナツツ油中の０８及びＣ８−Ｃ１０脂
肪酸だけからは生じ得ないものである。ジカルボン酸の
大部分はより長い鎖の脂肪酸の鎖の短縮化によって生じ
たものであると思われる。

１１旦至 表１と同一の組成を有するが濃度を２倍にした培地中に
おいて、シエマップ（ＣＭｌａｌ））醗酵槽中で変異株
５ＧＬＡ１２を増殖さゼた。炭素源は６０ｇ／ｊ）のス
クロースであった。本実験は２リツトルの規模で、増殖
期の間の通気量を０．５ＶＶｌ　、かつ撹拌翼の回転速
度を６０Ｏｒｐｍとして行った。１日半の増殖の後、バ
イオマスは２４ｆｆ／Ｎに達し、ここで５０Ｍ１／９の
ココナツツ油を加えて撹拌■の速度を１　、５００ｒｐ
ｍに増大さゼた。ココナツツ油は実験を通じてさらに加
えた。ＷａＭＭから毎日試料を分取して生成物を分析し
た。表８に生成したジカルボン酸の准と種類を示す。工
程を撹拌した醗酵タンク中で行った時には、振盪フラス
コとは明らかに異なる点が二つ存在する。先ず第一に、
ＣＩ２ジカルボン酸が多聞に存在し、集積された生成物
の性質が異なること、そして第二にジカルボン酸生成の
全体速度が振盪フラスコの場合の２倍であることである
。

実施例２６−３０ ６０９７Ｍのスクロースを用いた２倍の濃度の培地中で
、振盪フラスコ中において変異株５ＧＬＡ１２を数回増
殖させた。増殖期の終わりに５０！？／４１の量の脂質
基質を加えた。基質は、ココナツツ油、ナトリウムタロ
ーエート（ｔａｌ　＋ｏｗａｔｅ；　　７０％Ｃｐｓ、
３０％Ｃｐｓ）、オリーブ油、又はヘキサデカン、ペン
タデカンである。６８侵に生成物を分析して得られた結
果を表９に示す。

一つの例を除いたすべての例において、脂質基質の性質
に関係なく、Ｃｓ　、Ｃｏｏ　、ＣＩ２の鎖長のジカル
ボン酸が集積している（ただし、これらの割合は基質の
性質に影響されている）ことが明らかである。例外はペ
ンタデカンの場合であって、生成物はＣ７、Ｃ９、Ｃ１
１であった。

五−旦 ２０　　　　　　　０．４　　０．９　　２．２　　３
．５４４２゜３　　３．８　　６．０　　１２．１７０
　　　　　　　３．１　　５．５　　８．４　　１７．
０　　２７９５　　　　　　　４．８　　７．４　　１
１．９　２４．１　　　３２１１７　　　　　　　５．
５　　８．１　　１３．３　　２６．９　　　２９１４
２　　　　　　　６．７　　　Ｂ、９　　１２．２　　
２７．８脂質基質 ココナツツ油 ナトリウムタローエイト オリーブ油 ヘキサデカン ペンタデカン 表９ ン。

ｐ １１．５　　１２．７　　　２．８　　　　２７．０２
．２　　　１．３　　　２．１　　　　　５．６３．９
　　　８．７　　　８．４　　　　２１．０８．５　　
　８．８　　　０．９　　　　１８．２Ｃ７Ｃ９Ｃ１１ Ｏ，１１９，８６，３２６，１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）炭素基質含有培地中で増殖させた窒素制限酵母を
   用いて、毒性を有さないレベルのＣ＿８−Ｃ＿１＿８脂
   肪酸からＣ＿８−Ｃ＿１＿２ジカルボン酸を製造するこ
   とを特徴とする、生化学的酸化によって中鎖ジカルボン
   酸を製造する方法。 （２）請求項１記載の方法において、脂肪物質をエステ
   ル、好ましくはグリセリドの形で酵母に与えることによ
   ってＣ＿８−Ｃ＿１＿０脂肪酸の毒性を解消する方法。 （３）請求項１又は請求項２記載の方法において、バイ
   オマス中の窒素の量が４乃至９％（ｗ／ｗ）であること
   を特徴とする方法。 （４）請求項３記載の方法において、窒素の量が５．５
   乃至７％（ｗ／ｗ）である方法。（５）請求項１乃至請
   求項４のいずれか１項記載の方法において、酵母中の窒
   素をＮＨ＿４＾＋イオン及び／又は有機窒素として供給
   する方法。 （６）請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法
   において、炭素基質の濃度が１０乃至１００ｇ／ｌであ
   ることを特徴とする方法。 （７）請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法
   において、培地が金属塩類及び有機補因子も含有するこ
   とを特徴とする方法。 （８）請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法
   において、生化学的酸化を１５乃至４５℃の温度及び２
   ０乃至２００時間の反応時間で行うことを特徴とする方
   法。 （９）請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法
   において、酵母がカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種である
   ことを特徴とする方法。 （１０）請求項９記載の方法において、カンジダ種がガ
   ンシダ・クロアセエー（￥Ｃａｎｄｉｄａ　ｃｌｏａｃ
   ｅａｅ￥）であることを特徴とする方法。