JPH02122265A - 免疫学的測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、免疫学的凝集反応により抗原又は抗体の存在
を検出し判定するための方法に関する。

〔従来の技術及び課題〕

免疫学的な凝集反応に基づいて凝集又は非凝集粒子の分
布パターンを形成し分析する方法においては、サンプル
中の抗原又は抗体を特定の指標粒子に固定された抗原又
は抗体と混合して結合させると共に、これら反応成分を
反応容器の壁面に移動させ、かつ未結合の指標粒子を同
壁面の一部に集めて分離している。このような方法は、
一般に混合凝集法（ｍｉｘｅｄ　ａｇｇｌｕＨｎａＮｏ
ｎ　）と呼ばれ、Ｗｊｅｎｓｒ、　　Ａ、Ｓ、とＨｅｒ
ｍａｎ、　　Ｍ、、　　Ｊ、１ｍｍｕｎｏ１．、　３Ｂ
。

２５５　　（１９３９）　！、：おイテ報告されて以来
、Ｃｏｏｍｂｓ。

Ｒ，Ｒ，Ａ、とＢｅｄｆ’ｏｒｄ　、　　Ｄ、、　　Ｖ
ｏｘｓａｎｇ、、　　５　、　１１１（１９５５）及び
Ｃｏｏｍｂｓ、　Ｒ，Ｒ，Ａ、ら、　Ｌａｎｃｅｔ、　
ｉ　。

４６１　　（１９５６）の報告により血液型の判定を行
なうまでに発展確立された。例えば、各種血液型につい
て応用したものにＵＳＰ　４６０８２４ｆｉ号明細書、
ＵＳＰ４２７５０５３号明細書（特公昭６２−４４．２
２１号）やＵＳＰ４３２８１８３号明細書がある。また
、固体表面で血液型の判定を行なって感度の向上を図っ
たものにＵＳＰ　２７７０５７２号明細書がある。更に
、ＲｏｓｅｎｆｉｅｌｄＲ，Ｅ、　　ら、　　Ｐａｒｉ
ｓ　、　　Ｐｒｏｃ、１５Ｔｈ　Ｃｏｎｇ、１ｎｔ１．
　Ｓｏｃ。

Ｂｌｏｏｄ　Ｔｒａｓｒｕｓｉｏｎ、　２７　（１９７
６）では混合凝集法の原理を利用して固体表面で赤血球
抗原と抗体との反応を行なっている。

ところで、従来の混合凝集法の多くは底面に収束部を有
する形状の反応容器中での指標粒子の自然沈降によるも
のである。従って、指標粒子が底面に一様に沈降し、な
おも未反応の粒子が収束部に沈積してパターンを形成す
るまでに多大な時間を要していた。ｊｌｌに沈降速度を
高めるためならば粒径を大きくしたり、比重の大きな材
質を利用することが考えられるが、パターンが荒くなら
ない程度に粒径及び比重を選定しなければならない点に
限界を生じ、大幅な時間の短縮は望めない。

そこで、ＵＳＰ　４２９７１０４号明細書（特公昭６２
３１２９９号）では対称軸上に収束点を有する容器壁面
及び指標粒子としての赤血球表面に抗体（例えばＩｇＧ
　）を固定し、予めサンプル中の抗原と赤血球表面及び
容器壁面の抗体に対する抗１ｇＧ抗体を加え、更に第１
及び第２の遠心処理により抗原と未反応である赤血球と
を容器の収束点に集めることによりパターンの形成を行
なっている。しかしながら、遠心による凝集反応は粒子
の沈降を促進させる点で有効であるものの、遠心機が必
要となること自体に操作」−の制約が生じてしまう。即
ち、サンプリングから反応、判定、廃棄等を実施する際
に、反応容器のハンドリングの流れがスムーズにならず
、特に遠心力のかかる方向に対して反応容器の対称軸を
精密に一致させなければならない。

また、異なる項目の分析においては夫々粒子の沈降条件
を変える必要があるが、同一の遠心処理中に遠心の精度
やタイミングを複数設定することは困難であるから、そ
の都度工程をやり直すか、或いは複数の遠心機に接続す
る等の構成を必要とする。更に、遠心機を用いることで
不可避的に装置か大型になる。

本発明は、上記従来の課題を解決するためになされたも
ので、遠心機を用いずに凝集反応の判定に要する時間を
短縮すると共に、凝集パターンの明瞭化を達成すること
が可能な免疫学的測定方法を提供しようとするものであ
る。

〔課題を解決するための手段及び作用〕本発明は、測定
すべき物質と該物質に特異的に反応するかもしくは競合
する物質を固定した磁性粒子を含む反応液を反応容器に
入れ、該反応液にノズルから気流又は水流等の流体を供
給して該反応液を旋回させると共に、前記磁性粒子が前
記反応容器の少なくとも一部の壁面に沿って収束するよ
うな磁場をかけることにより前記磁性粒子の分布パター
ンを形成して物質間の結合状態を測定することを特徴と
する免疫学的測定方法である。

以下、本発明を第１図（Ａ）、（Ｂ）を参照して詳細に
説明する。ここで、第１図（Ａ）は本発明の免疫学的測
定方法に使用されるマイクロプレト、ノズル及びマグネ
ット等からなる装置を示す平面図、同図（Ｂ）は同図（
Ａ）の断面図である。図中の１は、」二面に複数の円板
状フェライトマグネット２を支持した支持台である。こ
の支持台ｊの−１一方には、反応容器としてのマイクロ
プレト３か配置されており、かつ該マイクロプレト３は
前記各マグネット２に対応して配置された底部かＵ字形
をなす有底円筒形の複数のウェル４を備えている。また
、前記各ウェル４の上方には流体を該ウェル４内の反応
液に供給して該反応液を旋回させるためのノズル５が配
置されている。

なお、このノズル５は前記ウェル４の接線と平行すると
共に、該ウェル４内の反応液の液面に対して鋭角で傾斜
させて配置している。

まず、測定すべき物質、例えばウィルス、細菌、タンパ
ク質等の抗原ないし抗体に対して特異的に結合するか又
は競合する物質、例えば抗体ないし抗原等を公知の磁性
体を含む磁性粒子の表面に固定する。磁性粒子としては
、市販のＤＹＮＡＢＥＡＤＳＭ　−４５０（Ｉ）ＹＮＡ
１社製）又は磁性ラテックス（ｅｓｔａｐｏｒ　）　　
［ＲＨＯＮＥ−ＰＯＵＬＥＮＣ社製］等や磁性体を含む
ゼラチン粒子（特開昭５９−１９５１［ｉ１号参照）等
を使用することが可能である。また、前記磁性粒子に前
記物質を固定化する方法は種々の公知の方法を適用でき
る。

次いで、第１図（Ａ）、（Ｂ）に示すマイクロプレート
３の各ウェル４内に反応液６と前記磁性粒子７と測定す
べき物質８を含むサンプルを収容する。同時に、ノズル
５から流体を各ウェル４内の反応液６に供給して該反応
液６、磁性粒子７及び測定すべき物質８を矢印方向に旋
回して攪拌する。この攪拌によって、前記磁性粒子７と
測定ずべき物質８との接触機会が増加し、反応が促進さ
れる。この後、ノズルからの流体の供給を停止し、マイ
クロプレー１−３とマグネット２が支持された支持台１
とを相対的に移動させ（例えば支持台１をその上の各マ
グネット２か前記マイクロプレー３の各ウェル４の底部
に接近するように移動させ）、反応後の磁性粒子をウェ
ル４の少なくとも一部壁面に沿って収束するような磁場
をかける。

上記磁場をかけることにより、第２図（Ａ）に示すよう
にウェル４の壁面に引き寄せられた磁性粒子７はサンプ
ル中のｆｌｌｌｌ定すべき物質８を介して結合し凝集塊
を生成してそれ以上移動できなくなり、第２図（Ｂ）に
示すようにウェル４の壁面に一様に広かった分布パター
ンを形成する。これに対し、サンプル中の測定すべき物
質に結合しなかった磁性粒子７は磁界によりウェル４の
壁面に引き寄せられ、更に壁面に沿って移動して第３図
（Ａ）、（Ｂ）に示すように壁面の一部に収束して集め
られる。なお、磁性粒子にはサンプル中の測定すべき物
質と競合する物質を固定しておき、一定量の測定すべき
物質と結合反応する物質を添加して行なう公知の凝集抑
制反応を用いてもよい。

」−記ノズル５からの流体の供給による反応液６の攪拌
は、均一であるほどよく、ノズル５の形状、流体圧力、
流体流量、更にノズル５の位置によって適切に調節され
る。ノズル５から供給する流体については、窒素ガスな
どの気流の他に反応液、測定すべき物質に対して特異的
に結合するか又は競合する物質か固定化された磁性粒子
の溶液などの水流を用いることができる。また、ノズル
５の先端はウェル４内の反応液６から離れて位置させて
もよいし、流体の種類によってはノズル５先端を反応液
６中に浸漬してあった法がよい場合もある。更に、反応
液の蒸発が問題となる場合には、ノズル５から流体を間
歇的に供給したり、前述した溶液を供給することか望ま
しい。

反応後の磁性粒子に磁場をかける際には、測定すべき物
質か反応された磁性粒子の沈降を早める観点から、ノズ
ルからの流体の供給を停止することが望ましいが、流体
を供給しながら磁場をかけもよい。

従って、測定すべき物質と該物質に特異的に反応するか
もしくは競合する物質を固定した磁性粒子を含む反応液
をウェル（反応容器）に入れ、該反応液にノズルから流
体を供給して該反応液を旋回、攪拌させることにより、
測定すべき物質と磁性粒子に固定化された物質との反応
を促進でき、更に前記磁性粒子か前記反応容器の少なく
とも一部の壁面に沿って収束するような磁界をかけるこ
とにより該磁性粒子の反応容器壁面への移動を促進でき
る。その結果、反応容器壁面に磁性粒子の分布パターン
を迅速かつ明瞭に形成できるため、凝集反応の判定に要
する時間を短縮できると共に、その分布パターンから高
感度の検出を行なうことができる。

また、反応容器壁面にサンプル中の測定すべき物質と結
合するかもしくは競合する物質を予め固定しておき、こ
れにサンプル及び前述した磁性粒子を加えて、ノズルか
らの流体の供給による反応液の旋回、攪拌を行なった後
、磁界を作用させることかできる。この場合、反応容器
内の反応液の攪拌により反応容器壁面の物質と結合しな
いで反応液に浮遊したサンプル中の測定すべき物質と磁
性粒子に固定化された物質との反応が促進され、更に磁
界により反応容器の壁面に磁性粒子を移動させることに
より該磁性粒子が反応容器壁面に固定された物質と該粒
子に反応した測定すべき物質を介して結合し、−様に広
がった分布パターンが形成される。一方、未反応の磁性
粒子は反応容器壁面の一部に収束した分布パターンを形
成する。

従って、かかる方法でも反応容器壁面に磁性粒子の分布
パターンを迅速かつ明瞭に形成できるため、凝集反応の
判定に要する時間を短縮できると共に、その分布パター
ンから高感度の検出を行なうことができる。なお、反応
容器壁面への測定すべき物質と結合するかもしくは競合
する物質の固定化法は従来の公知方法を使用できる。

〔実施例〕

以下、本発明をＨＢ　ｓ抗原の検出に適用した例につい
て詳細に説明する。

実施例］ く抗ｌｌＢｓ抗体固相プレー１・の作製〉まず、第４図
（Ａ）、（Ｂ）に示すＵ７底マイクロプレート（ＮＵＮ
Ｃ社、製造番号４６４３９４）　３に対し、アフィニテ
ィー精製したウザギ抗ＨＩ３５抗体を０．０１Ｍ　リン
酸緩衝液（１）ＢＳ）　、ｐＨ７，０で１０Ｍｇ／ｍＪ
！に調製し、これを各ウェル４に対して２５μノずっと
なるようにマイクロプレート３に添加し、３７°Ｃで１
時間反応させることによりマイクロプレート３の各ウェ
ル４壁而に吸着、固定した。つづいて、０、ＯＬＭ　Ｐ
ＢＳ　、　ｐＨ７，０を各ウェル２５０μノずつ用いて
３回洗浄し、更に０．２％ウン血清アルブミン（ＢＳＡ
）を含む０．０１Ｍ　ＰＢＳ　、　ｐＨ７，０を２００
μノ／ウエル添加して３７°Ｃで１時間反応させ、ブロ
ッキン］］ グを行なった。ひきつづき、００５％Ｔｗｅｅｎ　２０
を含む０．０１Ｍ　ＰＢＳ　、　ｐＨ１７，０を各ウェ
ル２５０μノ用いて３回洗浄した後、室温で乾燥して４
℃に保存した。

く抗ＨＢｓ抗体感作磁性ラテックスビーズの調製〉粒径
１μｍ１暗褐色の磁性ラテックス （ｃｓｔａｐｏｒ　）　　［ＲＯＩＩＮＥ−ＰＯＵＬＩ
ＥＮＣ社、製造番号ＬＭＩ）２３３］及び抗ｌｌＢｓ抗
体を夫々０．１Ｍグリシン緩衝液、ｐ　Ｈ８、３により
０．４％及び２．５μｇ／顧に調製し、各２獣を混合し
て３７℃で１時間値作反応させた。つづいて、１％ＢＳ
Ａを含む０．１Ｍグリシン緩衝液、ｐ）１８．３を２Ｎ
により３７°Ｃで３００分間反応せてブロッキングを行
なった。ひきつづき、００５％Ｔｗｅｅｎ　２０及び０
．１％ＢＳＡを含む０．０１Ｍ　ＰＢＳ　、　ｐＨ７，
５を２　ｍｉを用いて３回洗浄した後、同ＢＳＡ　４　
ｍｌ！を添加して反応に用いる。

＜ｌＩｎ５抗原の検出〉 １１Ｂｓ抗原陽性血清及び対照として陰性血清を原液の
まま前記ｌｌＢｓ抗体を固相固定したプレート３の各ウ
ェル４に夫々２５μノ添加し、室温で１５分間反応させ
てｌｌＢｓ抗原の一部をウェル４壁面のｔｌ　Ｂ　ｓ抗
体固相に結合した。つづいて、プレート３の各ウェル４
内に前記抗１１Ｂｓ抗体感作磁性ラテックスピース７を
２５μノ添加した後、ウェル４内の反応液６の液面に対
して３０°の角度で傾斜させた先端径か０．５ｍｍのノ
ズル５から窒素ガスを］ｋｇ／ｃｆｆｌ。

ｌ　ｃｍ３／ｍｉｎの条件で噴射、供給して反応液６、
磁性ラテックスビーズ７及びサンプル中のＩ−Ｉ　Ｂ　
ｓ抗原８を旋回、攪拌した。この後、ノズル５からの窒
素ガスの供給を停止し、支持台１をその上のマグネット
（直径８　ｍｍ、厚さ３　ｍｍ、残留磁束密度２０００
ガウス）２か前記マイクロプレート３の各ウェル４の底
部に接近するように移動させて、各ウェル４底面の垂直
方向に磁場を作用させ、室温で１分間反応させた。

その結果、各ウェル底面に磁性ラテックスビズの分布パ
ターン（凝集パターン）を迅速に形成でき、従来の遠心
処理に比べて反応性か良好になったことから、形成され
た分布パターンを明瞭化でき、サンプル中のＨＢｓ抗原
の存在を精度よく検出することかできた。

］　３ 実施例２ 第５図（Ａ）、（Ｂ）に示すマイクロプレート３の各ウ
ェル４に実施例１と同様な方法により抗ＨＢｓ抗体同相
を作製し、ｌｌＢｓ抗原陽性血清及び陰性血清を各ウェ
ル４に添加し、更に実施例］と同様な抗ＨＢｓ抗体感作
磁性ラテックスビーズ７を添加した。つづいて、ウェル
４内の反応液６の液面に対して３０°の角度で傾斜させ
た先端が高さ０．５ｍｍ、幅４　ｍｍの断面長方形のノ
ズル５′から窒素ガスをＩ　ｋｇ／ｃＩｊ、　１　ｃｍ
３／ｍｉｎの条件で噴射、供給して反応液６、磁性ラテ
ックスビーズ７及びサンプル中の旧３ｓ抗原８を旋回、
攪拌した。この後、ノズル５′からの窒素ガスの供給を
停止し、支持台１をその」二のマグネット（直径８ｍｍ
５厚さ３順、残留磁束密度２０００ガウス）２が前記マ
イクロプレト３の各ウェル４の底部に接近するように移
動させて、各ウェル４底面の垂直方向に磁場を作用させ
、室温で５０秒間反応させた。

その結果、各ウェル底面に磁性ラテックスビズの分布パ
ターン（凝集パターン）を実施例１に比べてより迅速に
形成でき、従来の遠心処理に比べて反応性か良好になっ
たことがら、形成された分布パターンを明瞭化でき、サ
ンプル中のＨＢｓ　抗原の存在を精度よく検出すること
ができた。

実施例３ 第５図（Ａ）、（Ｂ）に示すマイクロプレート３の各ウ
ェル４に実施例１と同様な方法により抗１１Ｂｓ抗体同
相を作製し、ＩＩ　Ｂ　ｓ抗原陽性血清及び陰性血清を
各ウェル４に２５μ、ｅ添加した。つづいて、ウェル４
内の反応液６の液面に対して３０’の角度で傾斜させた
先端が高さ０．５　ｍｍ、幅４　ｍｍの断面長方形のノ
ズル５′から窒素ガスを１　ｋｇ／ｃｒｊ、　１０ｍ３
／ｍｉｎの条件で５分間噴射、供給して反応を行なった
。ひきつづき、添加した血清を廃棄又はソノままで更＋
、：０．０１Ｍ　ＰＢＳ　、　ｐＨ７，５を２００μ、
ｆｆで１回洗浄した。次いで、実施例１と同様な抗ＨＢ
ｓ抗体感作磁性ラテックスビーズ７を各ウェル４に添加
し、前記ノズル５′から窒素ガスを１．　ｋｇ／　ｃｒ
ｊ　。

１、　ｃｍ”　／旧１１の条件で噴射、供給して反応液
６、磁性ラテックスピース７及びサンプル中のＨＢｓＢ
ｓ抗 原５を旋回、攪拌した。この後、ノズル５″からの窒素
ガスの供給を停止し、支持台１をその」−のマグネッｌ
−（直径８　ｍｍ、厚さ３　ｍｍ、残留磁束密度２００
０ガウス）２か前記マイクロプレート３の各ウェル４の
底部に接近するように移動させて、各ウェル４底面の垂
直方向に磁場を作用させ、室温で５０秒間反応させた。

その結果、各ウェル底面に明瞭な磁性ラテックスビーズ
の分布パターン（凝集パターン）を実施例２と同様に迅
速に形成できた。また、抗ＩＩ　Ｂ　ｓ抗体固相とｌｌ
Ｂｓ抗原陽性血清及び陰性血清との反応、ｌｌＢｓ抗原
陽性血清及び陰性血清と抗１１Ｂｓ抗体感作磁性ラテッ
クスビーズとの反応時において、ノズルからの窒素ガス
の供給による攪拌を行なうことによって、総合的な反応
時間の短縮を図ることかできた。

〔発明の効果〕

以上詳述した如く、本発明の免疫学的測定方法によれば
遠心機を用いずに凝集反応の判定に要する時間を短縮す
ると共に、Ｕ集パターンを明瞭化をでき、ひいては検出
時間の短縮と検出感度の向−」二を達成できる等顕著な
効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

第１図（Ａ）、（Ｂ）はマイクロプレート、マグネット
及びノズルを備えた免疫学的測定装置を示し、同図（Ａ
）は平面図、同図（Ｂ）は同図（Ａ）の断面図、第２図
（Ａ）は本発明による陽性時での粒子間の♀１１１合状
態を示す模式図、同図（Ｂ）は陽性時での粒子の反応パ
ターンを示す模式図、第３図（Ａ）は本発明による陰性
時での粒子間の結合状態を示す模式図、同図（Ｂ）は陰
性時での粒子の反応パターンを示す模式図、第４図（Ａ
）、（Ｂ）は実施例１で使用したマイクロプレート、マ
グネット及びノズルを備えた免疫学的測定装置を示し、
同図（Ａ）は平面図、同図（Ｂ）は同図（Ａ）の１折面
図、第５１図（Ａ）、（Ｂ）は実施例２．３て使用した
マイクロプレート、マグネット及びノズルを備えた免疫
学的測定装置を示し、同図（Ａ）は平面図、同図（Ｂ）
は同図（Ａ）の断面図である。 Ｊ・・支持台、２・・・円板状フェライトマグネット、
３・・マイクロプレート、４・・・ウェル、５．５゛・
・・ノズル、６・・・反応液、７・・・磁性粒子（抗１
１Ｂｓ抗体感作磁性ラテックスビ〜ズ）、８　・・測定
すべき物質（ＩＩＢｓ抗原）。 出願人代理人　弁理士　坪井　　淳 （Ａ） 第２図 第１ （Ａ） ＃！３図 Ａ （Ｂ）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）、測定すべき物質と該物質に特異的に反応するか
   もしくは競合する物質を固定した磁性粒子を含む反応液
   を反応容器に入れ、該反応液にノズルから流体を供給し
   て該反応液を旋回させると共に、前記磁性粒子が前記反
   応容器の少なくとも一部の壁面に沿って収束するような
   磁場をかけることにより前記磁性粒子の分布パターンを
   形成して物質間の結合状態を測定することを特徴とする
   免疫学的測定方法。
2. （２）、反応容器の壁面には測定すべき物質と結合する
   かもしくは競合する物質を固定してあることを特徴とす
   る請求項１記載の免疫学的測定方法。