JPH02117397A

JPH02117397A - 微生物細胞の生死判別法

Info

Publication number: JPH02117397A
Application number: JP26938388A
Authority: JP
Inventors: Kiyoshi Sugata; 清菅田; Ryohei Ueda; 良平植田
Original assignee: Mitsubishi Heavy Industries Ltd
Current assignee: Mitsubishi Heavy Industries Ltd
Priority date: 1988-10-27
Filing date: 1988-10-27
Publication date: 1990-05-01
Anticipated expiration: 2012-03-19
Also published as: JP2592114B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は微生物細胞の生死を判別する方法に関し、特に
食品製造プラント、医薬品製造プラントにおける原料、
製品の品質管理や殺菌装置の性能確認等に適用される微
生物検査、モニタリング法に有利に適用しうる同方法に
関する。

〔従来の技術〕

食品製造プラント、医薬品製造プラントにおいては殺菌
が非常に重要な工程を占め、原料、製品の品質管理や殺
菌装置の性能確認のため微生物検査・測定が不可欠であ
る。従来、微生物検査・測定法にはいくつかの方法があ
るが、主なものは顕微鏡による直接観察法、寒天培養法
、バイオルミネッセンス法およびそれらの変法などでる
る。

顕微鏡による直接観察法は試料を直接又は試料濃度が薄
い場合には、フィルターなどで一旦微生物細胞を捕集し
た後、光学顕微鏡を用いて観察・測定する方法である。

しかし、この方法では細胞の生死判別がつかないため殺
菌できたかどうかの評価ができなｈｏ寒天培養法は従来最もよく用いられている方法である。

この方法は微生物の栄養源を溶は込ました寒天上に試料
を分散させ適温で培養することにより微生物コロニーを
形成させて、これを測定することによシ試料中の生きて
いる微生物数を把握するものであり、コロニーを形成し
なければ試料中には微生物は存在しないか又は殺菌、死
滅していると判断するものである。しかし、この方法は
培養操作を伴うため、コロニ−を形成させるまでに少な
くとも１０時間以上、菌の種類によっては数日間の測定
時間が必要であシ、品質管理、殺菌性能把握に大きなネ
ックとなっている。

バイオルミネッセンス法としては、例えば牛乳などの細
菌数の測定感度を高めるため、アクリジンオレンジとい
う蛍光色素を作用させて顕微鏡で観察する方法が知られ
ているが、この方法は総画数（生菌＋死菌）の測定を目
的とするものであって、細菌の生死判別ができるもので
はない。

そこで、微生物の生死を判別できる迅速測定法について
最近多くの研究がなされているが、その一つがバイオル
ミネッセンス法である。バイオルミネッセンス法で実用
化されているのは、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）とホ
タルの生物発光酵素でおるルシフェリンルシフェラーゼ
と反応を利用するものである。この方法は生細胞中に含
まれる補酵素の一種ＡＴＰにルシフェリンルシフェラー
ゼを作用させると７オトンが放出される現象を利用する
もので、この７オトンｉｔ−測定することによシ生菌数
を１間接的に把握するものであるが、測定時間が数十分
〜１時間と寒天培養法に比較し大幅に短縮できる利点は
めるものの現段階では、測定感度はまだ低いため、低濃
度の細胞試料（数十個／−以下）に対しては適用できず
、まして１個の細胞の生死が問題となる試料では対象外
であった。

このように、従来法では、１個の微生物細胞の生死を短
時間（瞬時または、それに近いレベル）Ｋ判別できる方
法はなかった。これができれば微生物検査・測定の自動
化・迅速化が可能となシ原料、製品の品質管理や殺菌装
置の信頼性・安全性向上に多大の貢献ができる。

〔発明が解決しようとする課題〕

上述したように、従来技術には■　寒天培養法では測定
時間が長くかかる、■　顕微鏡観察法では、細胞の生死
判別ができない、■　バイオルミネッセンス法は低濃度
細胞試料に適用はできない、という技術課題があった。

本発明は従来技術の課題■、■、■を解決した全く新し
い微生物細胞の瞬時生死判別法を提供しようとするもの
である。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者等は、１個の細胞の生死を瞬時に判別する方法
について研究を重ねた結果、細胞内物質である核酸と結
びついて蛍光を発する色素を適当な濃度で細胞に作用さ
せ、水銀ランプ等で色素を励起させて蛍光顕１ａ鏡によ
り細胞を観察すると、生菌、死菌の発する光量に大きな
差異（微生物の種類によっても異なるが、生菌の発する
光量は小さく、死菌の発する光量は生菌に比べて数〜数
十倍大きい）が見られる事実を発見した。

本発明は、この知見に基づいて完成されたものであって
、微生物細胞に蛍光色素を作用させ、次いで、蛍光色素
を励起させるに必要な波長を有する光源を用いて蛍光色
素を励起させ、その時個々の細胞から発する光の強弱を
検知、測定することを特徴とする微生物細胞の生死判別
法である。

〔作　用〕

微生物細胞に蛍光色素を適当な濃度で作用させ、水銀ラ
ング等で色素を励起させることにょル、生菌、死菌の間
に発光量の差異か見られる事実を適用すれば、１個の細
胞の生死でも瞬時又は、それに近いレベルで判別が可能
となり、微生物検査・測定の自動化・迅速化ができるこ
とＫなる。

生きた細胞が加熱や薬剤（アルカリ、酸など）の作用に
よシ死滅すると、細胞の外側にある細胞壁やその内側に
ある細胞膜が変性、損傷を受け、その結果、死滅した細
胞の方が生細胞に比較して、蛍光色素が細胞内に浸透し
ゃすくな９、発光量に差異が見られるようになるものと
考えられる。

なお、本発明においては細胞に作用させる蛍光色素の濃
度が重要なポイントであ〕色素の濃度が高いと生細胞・
死細胞は同程度に染まって判別しにくくな）、また濃度
が低いと両方の細胞共うまく染色されないので最適な濃
度に１１整した色素を用いることが必要である。

本発明で用いられる蛍光色素としては下記のようなもの
から選択して使用しうる。

■　細胞内物質である核酸に結合して蛍光を発する色素４；６−ジアミデイノー２−７エルインドール（ＤＡＰ
Ｉ）、ローダミン６Ｇ％アクリジンオレンジ（ＡＯ）な
ど ■　アミノ基に結合して蛍光を発する色素フルオレスカ
ミン、０−フタルアルデヒド、ダンジルクロライド、フ
ルオレセインイソチアネート、７−クロ四−４−二トロ
ペンソ−２−オキサ−１，５−ジアゾールなど ■　チオール基に結合して蛍光を発する色素ダンシルア
シリジン、５−（ヨードアセトアミドエチル）アミノナ
フタレン−１−スルホン酸、５−ヨードアセトアミドフ
ルオ゛レセイン、フルオレセインマーキュリアセテート
、Ｎ−（５−ピレン）マレイミドなど ■　非共有結合性色素アリルナフタレンスルホン酸、オーラミン０、クロロテ
トラサイクリン、シアニン色素、エオシン、ジフェニル
ヘキサトリエン、−一アデノシンなど ■　そのほか、それ自体は蛍光を発しないが酵素の作用
によシ蛍光を発するものフルオレスカミンニ酢酸また、蛍光色素の最適濃度は、対象細胞の大きさ、種類
、細胞の懸濁している液の組成などによって異なる可能
性があるため、予め実験により決定することが必要であ
る。

更にまた、蛍光色素を励起させるに必要な波長を有する
光源の選択も、作用する蛍光色素の１’ｌ１Ｍ、対象細
胞によって異なるので、これも予め実験によシ確認する
ことが必要である。

〔実施例〕

（１）　　試験に用いた細胞次の５８１類の生菌、死菌を用いた。なお、死菌は、生
菌を■１２１℃×５分間の熱処理、■５　Ｎ　ＮａＯＨ
１−を１０−細胞懸濁液に作用させアルカリ処理したも
のの以上２方法にょシ作成した。

■　Ｂａｋｅｒ’ｓ　ｙｅａｓｔ　（＠母）■　Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉｆｏｒｍ　ＩＦＯ！１５０
１　（大腸菌〕 ■　Ｂａｃｉｌｌｕｅ　５ｕｂｔｉｌｉｓ芽胞　ｌＰＯ
５５１５（枯草菌）（２）　　使用した蛍光色素 ■　４；６−ジアミデイノー２−フェニルインドール（
ＤＡＰ　Ｉ　） ■　ローダミン６Ｇ ■　アクリジンオレンジ（ＡＯ）（３）細胞の調整Ｏ各機生物細胞を酵母については約１０”個／−１大腸
菌、枯草菌芽胞については約Ｉ　Ｏ８個／−の濃度に調
整し、その生細胞、死細胞に蛍光色素を作用・混合し、
そのα０１〜α０５ｍをスライドグラス上に採取カバー
グラスをしたのち、ただちに蛍光顕微鏡で観察を行った
。

Ｏ細胞液に作用させる蛍光色素濃度は、細胞液に対し拳　ＤＡＰＩ　　−ｃＬ１〜１０　Ａｔ／ｍｌ”　（細
胞液）・Ａ・０　　・・・　１〜１００μｔ／−・（細
胞液）・　ローダミン６Ｃｋ　・−ＩＩＬ１〜１　ｏ　
ａｔ／ｗｄ　−（細胞ｇ　）が適当である。例えば、Ａ
、Ｏの場合、・１００μｆ／−以上の濃度で作用させる
と生菌、死菌も同程度に染色されてしまうので判別でき
なくなる。試験ではＤＡＰ１１μｆ／ｄ％　Ａ・０１０
μｆ　／ｗｄ　、　　ローダミン６Ｃｋｊｌｌｆ／−の
濃度になるように添加・調整した。

り４）細胞の観察細胞の観察に用いた蛍光顕微鏡の光学系を第１図に示す
。

第１図において、１は水銀灯であシ、出力１００Ｗのも
のを使用した。２はコレクターレンズでち９水銀光を集
光する。５は励起フィルターでアシ、蛍光色素を励起さ
せるに必要な波長を選定するものである。ＤＡＰＩ　、
んＯの励起フィルターとしては３５０〜５８０ｎｍの波
長を通すもの、また、ローダミン６Ｇの励起フィルター
としては５５０〜５８０　ｎｍ。

および５１０〜５６０　ｎｍの波長を通す２１１１類を
使用した。４はミ２−５は対物レンズであシ２０倍のも
のを使用した。対物レンズ５を通して、励起フィルター
３で選定された特定の波長域の光が試料７に照射され蛍
光色素を励起する。６は試料台である。励起光は対物レ
ンズ５を通過し、吸収フィルター８によシ励起光の中の
特定の波長域の光をカットしたものを、接眼レンズ９を
通して観察する。

ＤＡＰＩ、　Ａ、Ｏの場合、吸収フィルター８は４２０
　ｎｍ以下の波長域をカットするもの、また、ローダミ
ン６Ｇの場合、励起フィルター５に３３０〜５８０　ｎ
ｍのものを使用した時、４２０ｎｍ以下の波長域をカッ
トするもの、５１０〜５６０ｎｍ　の励起フィルター５
を使用した時、５９０　ｎｍ以下の波長域をカットする
吸収フィルター８を用いた。

（５）　　測定結果ＤＡＰ　Ｉで蛍光染色した細胞は、酵母、大腸菌、枯草
菌芽胞共に生細胞はうす暗い弱い黄色の光を放つのに対
し、熱およびアルカリで処理した死細胞は明るいほぼ白
色に近い元を放つので、ただちに生死を判別することが
できる。特に酵母の場合、大腸菌、枯草菌芽胞に比して
細胞が数倍大きいので、差異が顕著に判別できる。

Ａ、Ｏの場合、生細胞は弱り黄色〜白の光を放つのに対
し、死細胞はやや黄色みがかった乳白色の明るい光を放
つ。

ローダミン６Ｇの場合、励起フィルター３を３３０〜３
８０　ｎｍ　　吸収フィルター８に４２０　ｎｍ以下の
波長をカットする条件で観察すると、はｉｆ　Ａ、　Ｏ
と同様の結果、即ち、生細胞は弱い黄色〜白の光、死細
胞は黄色みがかつ丸孔白色の明るい光を放つ。また、励
起フィルター５に５１０〜５６０　ｎｍの波長域を通過
、吸収フィルター８に５９０ｎｍ以下の波長をカットす
る条件で観察すると、橙色のパックグランドに生細胞は
暗い灰色、死細胞は、明るい白〜黄色の光を放つ。

このように、蛍光色素を適当な濃度で細胞に作用させ、
蛍光顕微鏡により観察を行えば生死がただちに判別でき
る。

第１図は、細胞の生死判別に用いた基本的な光学系であ
るが、第２図は本発明を微生物細胞の連続生死判別法に
適用した場合の一実施例であシ、構成は次の通シで、あ
る。

１は水銀ランプ、２はコレクターレンズ、３は励起フィ
ルター　４はきツー　５は対物レンズでろ）、それぞれ
の機能は第１図の説明と同様である。

々お、蛍光色素を励起させるに、実施例として水銀ラン
プを使用したが、蛍光色素を励起させることができる光
源であれば、中セノンランプ、レーザー光などを用いて
もさしつかえない。

６は測定対象である細胞液を連続的に流すフローセルで
あり、細胞液はライン７を経由して７０−セル６の中に
入る。フローセル６に入る手前で蛍光色素１５が所定の
濃度でライン７に送シ込まれる。細胞に作用して蛍光色
素が７０−セル６内で励起光を受けて励起され蛍光を発
する。この蛍光の波長を吸収フィルター９で適当な波長
域に選定したものをテレビカメラ１０を経由して光の強
度を検出するフォトマル１１でとらえる。フォトマル１
１でとらえた光の強度、パルスを波高解析装置１２など
で解析することによシ、生細胞、死細胞の数がただちに
測定することが可能となる。

〔発明の効果〕

本発明によシ、従来測定時間が数十時間要していた微生
物細胞の生死判別が、低濃度（１個でもンの細胞に対し
ても、瞬時に可能となり、食品製造プラント、医薬品製
造プラント等における原料、製品の品質管理、また殺菌
装置の性能把握が迅速にかつ容易に行えるようになる。

その結果、これら製品、装置の信頼性、安全性の向上に
加え、手間のかかる培養法に比較し、大幅な検査時間、
労力の省力化が可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は本発明の実施例における微生物細胞
の生死判別する際に使用した光学系装置の概略図である
。

Claims

【特許請求の範囲】

微生物細胞に蛍光色素を作用させ、次いで、蛍光色素を
励起させるに必要な波長を有する光源を用いて蛍光色素
を励起させ、その時個々の細胞から発する光の強弱を検
知、測定することを特徴とする微生物細胞の生死判別法
。