JPH0211517A - マイコプラズマ汚染の防止または除去 - Google Patents
マイコプラズマ汚染の防止または除去Info
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Abstract
め要約のデータは記録されません。
Description
植物の培?i細胞におけるマイコプラズマ汚染の防止な
いし除去剤に関するものである。
を欠く三層からなる細胞膜で包まれており、細石(Sh
izomycetes網)とウィルス(RHcrota
tobiotes網)との中間的な位置に分類されてい
る[岩波生物学事典第3版、第1240頁(1985)
、合波書店]。
ニワトリの慢性呼吸器病などの起因となる。
。ピリドンカルボン酸系抗マイコプラズマ剤としてはオ
フロキサシンが報告(特開昭 60−184014 )
されている。しかし、その抗マイコプラズマ作用は必ず
しも十分に強いものではない。
ズマで汚染されている。マイコプラズマで汚染された細
胞は形態学的にも、遺伝学的にも、生理学的にも変化を
受けている。細胞の大規模培養や長期培養でのマイコプ
ラズマの汚染率は80〜90%にも達するといわれてい
る。ワクチン、ホルモン、抗体、酵素の如き生理活性物
質を生産せしめる場合、マイコプラズマで汚染されてい
ない細胞を用いることが要請される。
(MIC)が低いミノサイクリ/やチアムリ/を用いて
マイコプラズマの汚染ないし防止を行うことが考えられ
る。しかし、これらの薬剤は、静マイコプラズマ的に作
用するだけで殺マイコプラズマ的に作用せず、そのため
−旦発育が阻止されたマイコプラズマが一定時間後には
再生育する(すなわち再汚染される)。またキノロン系
抗菌剤の一種であるシプロフロキサシ/の単独使用また
はチアムリノ、ミノサイクリンとの併用によりマイコプ
ラズマ汚染の除去が試みられている(特開昭62−15
1178 ) 、 Lかし、シプロフロキサシンの使用
濃度は高<(10〜50μg/■l)、その細胞毒性と
抗マイコプラズマ活性との比、すなわち安全係数も高く
ない、従って、−旦マイコプラズマに汚染されると有効
な汚染除去法がないため、その培養ロフトを廃棄して析
らたに培養をやり直す以外に辺当な方法がないのが現実
である。
するのみならずマイコプラズマ汚染の除去ないし防止に
も顕著な効果を示す薬剤を種々探索し、本発明を完成し
た。
酸誘導体は特開昭62−277362に!i!口されて
いるが、そこにはこの化合物のマイコプラズマに対する
作用は勿論のこと、培養細胞におけるマイコプラズマ汚
染の防止ないし除去作用について全く開示されていない
。
原子または水酸基もしくはアミノ基で置換されていても
よい炭素数1〜5の低級アルキル基を意味する。) で表わされるピリド/カルボン酸またはその塩を「効成
分とする抗マイコプラズマ剤および培養細胞におけるマ
イコプラズマ汚染の防止ないし除去剤に関する。
ては、例えば塩酸、リン酸等の無I!酸との塩;酢酸、
乳酸、シュウ酸、コハク酸、メタンスルホ/r1i、マ
レイアrt!、マロン酸、グルコ/酸等の仔vAffi
との塩;アスパラギ:/!1. グルタミン酸等の酸
性アミノ酸との塩;または化合物(1)のナトリウム、
カリウム、カルシウム、マグネシウム。
の塩;トリエチルアミンの如きa機塩基との塩などが挙
げられる。また、置換基Rの例としてはクロロメチル、
ヒドロキシメチル、アミノメチルなどが挙げられる。
化合物が挙げられ、特に化合物1およびその塩が好まし
く用いられる。
−シクロプロピル−6,8−ジフルオロ−1,4−ジヒ
ド0−4−オキソキノリ/3−カルボン酸 化合物 2 5−アミノ−7−(2−クロロメチルモルホリノ)−1
−シクロプロピル−6,8−ジフルオロ−1,4−ジヒ
ドロ−4−オキソキノリ/3−カルボン酸 化合物 3 5−7ミ/−1−シクロプロピル−8,8−ジフルオロ
−7−(2−ヒドロキシメチルモルホリ/)−1,4−
ジヒドロ−4−オキソキノリン−3−カルボ/酸 化合物 4 5−アミノ−1−シクロプロピル−6,8−ジフルオ口
−7−モルホリ/−1,4−ジヒドロ−4−オキソキノ
リン−3−カルボ7Wtこれらの化合物は、後記参考例
や特開昭62−277362に記載の方法またはこれら
に準する方法により容易に製造することができる。
コプラズマ汚染の防止ないし除去剤としての諸性質を更
に詳細に説明する。
法により供試薬剤の最小発育阻止濃度(MIC:μg/
■l)を測定した。
用培地[マイコプラズマ ニュモニエおヨヒアコレプラ
ズマ レイドロライの場合は0.5%ブドウ糖添加チャ
ノブク (Chanock)液体培地pH6,8(細菌
学gi書2、「ヒト・動物および植物マイコプラズマの
分mと同定」日本細苗学会教育委員会編、第8頁(19
82) 、菜種出版)、マイコプラズマヒョライニスの
場合はマイコプラズマ ヒョライニス分離用液体培地p
H7,8(8獣会誌32.34〜3g (1979)
) 、その他のマイコプラズマ種の場合は0.2%アル
ギニ/添加チャノック液体培地PH6,8]の2〜3薦
!に接種し、これを1iiI液とじて前培養用培地で1
0倍希釈により1万倍まで連続希釈を行う。これらの希
釈液を37℃で2〜7日間培養し、マイコプラズマの増
殖により培地の変色が認められたものの内、希釈倍数の
最も高いものを前培養用培地で100倍希釈し、これを
接種用マイコプラズマ液とする。
る(難溶性供試薬剤の場合は等モルの水酸化ナトリウム
を加えて溶解する。以下同様)。これを原液として2倍
連続希釈系列を作成し、プラスチックシャーレに1ml
ずつ分注する。重比の「ヒト・動物および植物マイコプ
ラズマの分離と同定」第9頁に記載のチャノック寒天培
地(マイコプラズマ ヒョライニスの場合には更に0.
5%ムチン添加)を加ll!!溶解後、55℃に保温し
、前記の供試薬剤含有シャーレに9 ■!ずつ分注して
供試薬剤と十分混合し供試薬剤含有寒天平板を調製する
。
ラレプリケーター(3mmピン)を用いて3μβずつ供
試薬剤含有寒天平板上に接種する。マイコプラズマ ニ
ュモニエ、マイコプラズマ アルギニ二、アコレプラズ
マ レイドロライおよびマイコプラズマ ヒョライニス
を接種した平板は、水を含んだ脱脂綿を入れたプラスチ
ック シャーレと一緒にビニル袋に入れて密封する。マ
イコプラズマ ニュモニエは7日間、マイコプラズマ
アルギニm;およびアコレプラズマ レイドロライは2
日間、高湿度条件のもとに37℃で好気培養する。その
ほかのマイコプラズマ種はガスパック嫌気システム(B
OIL)を用いて2日間嫌気培養を行う。
察し、マイコプラズマの増殖の認められない供試薬剤の
最小濃度をMICとした。
ie) Macマイコプラズマ オラーレ(M、or
ale) Cll−19299マイコプラズマ オミ
ニス(M、homlnls) PG−21? (:y
フラX ? 7 y −/ 79 /X (M、f
ersenta++++) PG−18マイコプラズ
マ サリバリウム(Il、g為目マarlum) P
C−20マイコプラズマ ブカレ(M、buccale
) Cll−20247アコレプラズマ レイドロラ
イ(^、laldlawll) PCi−8マイコプ
ラズマ アルボ= −= (M、arglnlnl)
に−230マイコプラズマ ヒョライニス(M、hy
orhlnls)但し、A〜Fはヒト由来のものであり
、GおよびHはつ/由来のものであり、■はブタ由来の
ものである。
MIC)は、同じピリドンカルボ/酸であるシプロフロ
キサシンやオフロキサシ/よりも試験例2 抗マイコプ
ラズマ作用(MIC,MMC)液体希釈法により最小発
育阻止濃度(MIC,μg/ml>および最小殺マイク
プラズマiH[1t (MMC。
定法は試験例1の場合とは異なる。
を前培養用培地で5倍希釈し、つづいて更に2倍希釈系
列を調製する。この希釈液の50μ!ずつをマイクロプ
レートのウェルに分注する。なお、供試薬剤無添加のウ
ェルを対照とした。
をマイクロピペットを用いて上記供試薬剤含仔各ウェル
に50μβずつ滴下する。マイクロプレートをプレート
シールで密封し、マイクロミキサーで振盪後、37℃で
5日間培養する。供試薬剤無添加の対照では培養2日後
にマイコプラズマの増殖による培地の変色が認められる
。この時点でキャサラレプリケーターを用いて液体培養
液3μlを供試薬剤を含まないチャノブク寒天培地上に
接種する。上記液体培地および寒天培地を更に37℃で
3日間培養[マイコプラズマ オラーレの場合は嫌気培
養、アコレプラズマ レイドロライおよびマイコプラズ
マ アルギニm;の場合は好気培?i]する。5日目の
観察結果からMICおよびM M Cを決定する。すな
わち、液体培地でマイコプラズマの増殖が認められない
供試薬剤の最小濃度をM I Cとし、寒天培地でマイ
コプラズマの増殖が認められない供試薬剤の最小濃度を
MMCとした。
IC値とMMC値とは一致する。すなわち化合物1およ
びシプロフロキサシンはM I C(aにおいて殺マイ
コプラズマ的に作用する。
ズマ的に作用し、殺マイコプラズマ的には作用しない。
にマイコプラズマで汚染せしめた動物細胞に供試薬剤を
4日間作用させ、その後供試薬剤無添加の培地で継代培
養を行い、マイクプラズマが再び成育(すなわち再汚染
)するかどうかをみた。
第3表記載のマイコプラズマを試験例1(1)の如く前
培養を行い、その培養液2諺!を1 、500 xg1
30分間遠心してマイコプラズマを分mする。
胎児血清とペニシリン6100単位ハ2を添加した培地
、すなわち10%−F B S −M E M培地の2
曹l中に前記の分層マイコプラズマを懸濁する。
−M E M培地中に2.5XIO’個/mlの4度
になるように懸濁し、この4mlずつを2枚の円形カバ
ーグラス(直径1.8 cm)を入れた組は培養用シャ
ーレ(直径6 cm)に分注し、つづいて前記マイコプ
ラズマ懸濁液1mlを更に加える。これを37℃、5%
炭酸ガス中で3日間培養後、継代培養を2回行う。DN
A結合・蛍光色素染色法(重比の[ヒト・動物および植
物マイコプラズマの分離と同定」第95〜97頁)−に
よりマイコプラズマ汚染を確認し、マイコプラズマ汚染
細胞とした。
イコプラズマ汚染L −929細胞を前項のように培養
する。供試薬剤の1 、000μg/■2水M、Ifを
:A!i2し、これをイーグル(Eagle)の最少必
須培地で所定cJI!1′に希釈したものを培地中に添
加する。シャーレは各供試薬剤濃度あたり2枚を使用し
、1枚には円形カバーグラスを2牧人れてマイコプラズ
マ検査用とし、他の1枚にはカバーグラスを入れずに継
代培養用とした。供試薬剤添加期間での培養は4日間行
い、その後3週間は供試薬剤を含まない培地で培養を続
ける。培地交換は3〜4日毎に行い、継代は毎週−回行
う。
間毎に行う、マイコプラズマの検出はDNA結合・蛍光
色素染色法で行う。
0%以上の細胞がマイコプラズマ陽性便w−−〜マイコ
プラズマ陰性 第3表に示すように化合物1の添加系ではG11−1い
ずれのマイクプラズマ種においても培養3日後にマイコ
プラズマ陰性になり、その後は薬剤無添加で継代培養を
してもマイコプラズマの再発Nは全く認められない。シ
プロフロキサシン添加系ではGのマイコプラズマ種のみ
培養3日以降マイコプラズマ陰性となった。ミノサイク
リン添加系でも培養3日後にマイコプラズマ陰性となる
が、その後に薬剤を除去すると顕著なマイクプラズマの
再発育がろられる。
されたヒト肺カルシ/−マ細胞[1]およびヒトメラン
ーマ細胞[■]に対するマイコプラズマ汚染の防止・除
去作用を試験例3に準じて行い、第4表の結果を得た。
たマイコプラズマ種は不明である。
を完全に除去したのに対し、シプロフロキサシ7は6,
25μg/■!の高濃度を必要とした。最小マイコプラ
ズマ除去濃度と第5表に示す細胞毒性0度(I C50
)との比は、化合物1では36であり、シプロフロキサ
シンでは4.5である。
の増殖を阻害するかどうかを調べた。
agIe)の最少必須培地で2倍系列希釈する。
胞PLを2XIO’個懸濁し、組織培養用シャーレ(1
1!径GO*i)にまき、37℃、5%炭酸ガス中で4
8時間培養する。先に:A製した供試薬剤溶液0.4m
lずつを各シャーレに添加して所定4度となし、更に3
日間培養する。培養終了後、培地を除去し、ダルベフ:
1I(Dulbecco )のリン酸緩衝液(p)17
.4)で1回洗浄する。2,5%トリプシン−0,02
%EDT^混液(1:9)の0.2■!を加えて細胞を
はがし、10%FIIS−MEM培地で適当に希釈した
後、エルマ血球計算盤で細胞数を測定する。細胞増殖率
は供試薬剤無添加対照群の5日日の平均細胞数から2日
日のそれを差し引いたものを100%とし、同様に計算
した供試薬剤添加群の細胞数の百分率を求めて算出する
。50%細胞増殖阻害0度(IC50:μg/mi+)
は濃度−百分率回帰直線から算出する。 その結果を次
に示す。
1440シプロフロキサシ7 28
9〜280第5表に示すように供試薬剤の50%細胞
増殖阻害濃度(JCso;μg/ml>は、これらのマ
イコプラズマに対するMICよりも高い、IC50値と
第1表におけるMIC値との比は、化合物1では180
〜I440、シプロフロキサシ/では9〜280であり
、安全域は化合物1の方が広すった。
常法により調べ、LDso値(μg/w+1)をベーレ
/ス・ケルバー法により算出し、LD50(mg/kg
)値が2000以上との結果を得た。
示すように強い抗マイコプラズマ作ITJを任し、また
前記試験例6に示すように毒性も弱いのでヒトを含む動
物に対する抗マイクプラズマ剤として作用である。本発
明の抗マイコプラズマ剤の投与量は年令1体重、症杖、
投与経路により異なるが、有効成分として通常1o■g
〜3g1好ましくは50〜250mg7日であり、1回
ないし数回に分けて投与(一般的には経口投与)される
。本発明の有効成分(I)またはその塩は通常、製剤用
担体と混合して調製した製剤の形で投与される。製剤の
具体例としては錠剤、カプセル剤、mljlM、 シ
ロップ剤などが挙げられる。これらの製剤は通常の製剤
用担体を用いて常法により!i製できる。
は強い抗マイコプラズマ作用ならびに優れたマイコプラ
ズマ汚染の防止・除去作用を存し、更には抗マイコプラ
ズマ活性と培養細胞の増殖阻害濃度との間には大きな開
きがある。従って、化合物1またはその塩は培養細胞の
マイコプラズマ汚染の防止ないし除去剤としても極めて
有用である。マイコプラズマ汚染の防止・除去剤たる化
合物(I):lたはlDmは、0.2〜Joug /
ml 、 kVましくは0.4〜3μg/mlの濃度に
なるように通常試薬の形で、培養前または培養中の培地
に添加される。このような試薬は用時溶解型固形剤の形
であってもよいが、水溶液のような液状剤の形をとるの
が取り扱いに便利である。試薬が液状剤であるときは凍
結保存するのがよい。試薬中には有効成分(1)のはか
リン酸塩の如き緩衝剤、アルカリの如き溶解補助剤、細
胞培養用培地の一成分などを更に介在していてもよい。
説明する。
54g 力ルンウム カル4キシメチル 七ルトス
40g微細結晶性セルロース 50
g ステアリン酸マグネシウム 6g 上記成分をよく混合し、常法により打錠して1.000
個の錠剤を調製する。
mg/ s l水溶液を10■!容の褐色バイアルに分
注し凍結保存する。この溶液の0.1■!中には化合物
1が5μg含有される。
の5−アミ7〜1−シクaプロピル−6、7,8−)リ
フルオロ−!、4−ジヒドロー4−オキソキノリン−3
−カルボン酸、1.15gの2−アセチルアミノメチル
モルホリン、1gのトリエチルアミンおよびIOm 1
のピリジ/の混合物を16時間加熱還流する。反応液を
減圧で濃縮乾固し、残渣に酢酸エチルを加えて結晶を濾
取する。結晶を水20m lに2濁させ、りoaホルム
で抽出する。
て720 m gの5−アミ/−7−(2−アセチルア
ミノメチルモルホリノ)−1−シクロプロピル−6,8
−ジフルオロ−1,4−ジヒドロ−4−オキフキ/リン
−3−カルボン酸を得る。
%塩ff115m1を加え90分間加熱還流する。反応
液を減圧下に濃縮した後、残渣を水−エタノールより再
結晶して化合物lの塩酸塩300 m gを得る。
水に溶解し、これを10%アンモニア水で中和し、クロ
ロホルムで抽出する。抽出液を乾燥後0縮し、残渣をエ
タ/−ルから再結晶して120 m gの化合物1を得
る。m 、 I) 、 215〜217℃。
称 マイコプラズマ汚染の防止または除去 (新名称) 特許出願人 大日本製薬株式会社 代 理 人 小島 −晃 3、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所大阪市中央区道修町2丁目6番8号名称291
大日本製薬株式会社 住所大阪府吹田市江の本町33番94号大日本!!!薬
株式会社 総合研究所内電話 大阪(08)−337−
(5931)&補正の対象 全 文 訂 正 明 細 書 「マイコプラズマ汚染の防止または除去」明細書の全文
を別紙のとおり補正する。
a発明の詳細な説明 産業上の利用分野 本発明は特定のピリド/カルボン酸を有効成分とする動
植物の培養細胞におけるマイコプラズマ汚染の防止また
は除去剤ならびに動植物細胞の培養方法に関するもので
ある。
iz。
+otes ti4 )との中間的な位置に分類されて
いる。培養された動物や植物の細胞は、はとんどの場合
マイコプラズマの汚染が認められる。マイコプラズマで
汚染された細胞は形態学的にも、遺伝学的にも、生理学
的にも変化を受けている。細胞の大規模培養や長期培養
でのマイコプラズマの汚染率は80〜90%にも達する
といわれている。そして、分離されるマイコプラズマ種
としてはマイコプラズマ オーラレ、マイコプラズマ
ザリバリウム、アコレプラズマ レイドロウイイ、マイ
コプラズマ アルギニ一二、マイコプラズマ ヒョライ
ニスが大部分を占める。
生理活性物質を生産せしめる場合、マイコプラズマで汚
染されないように細胞を培養することが要請される。
IC)が低いミノサイクリンやチアムリンを用いて、マ
イコプラズマ汚染の除去または防止を行うことが考えら
れる。しかし、これらの薬剤は、静マイコプラズマ的に
作用するだけで殺マイコプラズマ的に作用せず、そのた
め−旦発育が阻止されたマイコプラズマが一定時間後に
は再増殖する(すなわち再汚染される)。
ルボン酸系抗菌剤を用いることも試みられている。例え
ば、特開昭63−152318には次式で表わされるピ
リド/カルボン酸がマイコブラズマ汚染の防止または除
去剤として作用であると記載されている。
ていてもよい1−ピペラジニル基もしくは1−ピロリジ
ニル基を意味する。
くは炭素数1〜5の低級アルキルアミ7基で置換されて
いてもよい炭素数1〜5の低級アルキル基を意味するか
、あるいはアミン基またはフッソ原子を意味する。R2
はシクロプロピル基を意味するか、あるいは1個または
2個のハロゲン原子で置換されていてもよいフェニル基
を意味する。AはNまたはC−HらしくはC−Yを意味
し、ここにおけるYはハロゲン原子を意味する。Xは水
素原子またはアミノ基もしくは7ツソ原子を意味する。
ンの単独使用またはチアムリン、ミノサイクリ/との併
用による細胞培養物のマイコプラズマ汚染の除去が試み
られている( E P 221493A >。
剤たるオフロキサシンが開示されている。
カルボン酸は、その使用13度が高いし、その細胞毒性
と抗マイフプラズマ活性との比、すなわち安全係数が低
く、マイコプラズマ汚染の防止または除去剤としては本
発明の特定のピリドンカルボン酸よりも劣る。
5−アミ/−7−(2−アミノメチルモルホリノ)−1
−シクロプロピル−6,8−ジフルオI:I−1.4−
ジヒドロ−4−オキソキノリン−3−カルボンW!!(
以下、化合物A)またはその塩を有効成分とする動物や
植物の培養細胞におけるマイコプラズマ汚染の防止また
は除去剤ならびに動物細胞や植物細胞の培養方法に関す
るものである。
ン酸等の無機酸との塩:酢酸、乳酸、シュウ酸、コハク
酸、メタ/スルホン酸、マレイノ酸、マロン酸、グルコ
ン酸等の存機酸との塩;アスパラギン酸、グルタミン酸
等の酸性アミノ酸との塩:または化合物Aのナトリウム
、カリウム。
ンの如き有機塩基との塩などが挙げられる。
方法は特開昭62−277362に記載されている。し
かし、そこにはこの化合物Aまたはその塩のマイフプラ
ズマに対する作用は勿論のこと、培養細胞におけるマイ
コプラズマ汚染の防止または除去作用について全く開示
されていない。
除去剤たる化合物Aまたはその塩の諸性質について説明
する。
文献に具体的に開示されている次の化合物も対照として
試験に供した。
により供試薬剤の最小発育阻止濃度(MIC:μg/璽
l)を測定した。
ズマ凍結保存懸濁液0.2〜0.3 m lを後述の前
培養用培地の2〜3mlに接種し、これを原液として後
述の前培養用培地で10倍希釈により1H倍まで連続希
釈を行う、これらの希釈液を37℃で2〜7日間培養し
、マイコプラズマの増殖により培地の変色が認められた
ものの内、希釈倍数の最も高いものを前培養用培地で1
00倍希釈し、これを接種用マイコプラズマ懸濁液とす
る。
プラズマ レイドロウイイの場合は0.5%ブドウ糖添
加チャノック(Chanock)液体培地pl+7.8
(細菌学叢書2、「ヒト・動物および植物マイコプラズ
マの分離と同定」日本細菌学会教育委員金偏、第8頁(
+982) 、菜種出版)、マイコプラズマ ヒョライ
ニスの場合はマイコプラズマ ヒフライニス分離用液体
培地P H7,8r日獣会誌32.34〜38 (+9
79) ]、その他のマイコプラズマ種の場合は0.
2%アルギニン添加チャノック液体培地1)H6,8を
用いた。
、000μg/wl*溶液を調製する(難溶性供試薬剤
の場合は等モルの水酸化ナトリウムを加えて溶解する。
し、プラスチックシャーレに1mlずつ分注する。前出
の「ヒト・動物および植物マイコプラズマの分離と同定
」茅9頁に記載のチャノック寒天培地(マイコプラズマ
ヒョライニスの場合には更に0.5%ムチン添加)を
加温溶解後、55℃に保温し、前記の供試築剤介在シャ
ーレに9 mlずつ分注して供試薬剤と十分混合し供
試薬剤含を寒天平板を調製する。
ャサラレプリケーター(3■■ビ/)を用い、て3μβ
ずつ供試薬剤含育寒天平板上に接種する。マイコプラズ
マ ニューモニエ、マイコプラズマ アルギニ一二、ア
コレプラズマ レイドロウィイおよびマイコプラズマ
ヒョライニスをtffi[した平板ハ、水を含んだ脱脂
綿を入れたプラスチックシャーレと一緒にビニル袋に入
れて密封する。マイコプラズマ ニューモニエは7 E
l 間、マイコプラズマ アルギニm;およびアコレプ
ラズマ レイドロウィイは2日間、高湿度条件のもとに
37℃で好気培養する。そのほかのマイコプラズマ種は
ガスバック嫌気システム(nllL)を用いて2日間嫌
気培養を行う。培養後、オリンパス実体顕微鏡にて20
〜100倍で観察し、マイコプラズマの増殖の認められ
ない供試薬剤の最小濃度をM I Cとした。
umonlae) M&Cb、マイコプラズマ オラ
ーレ(1,ormle) CM−19299C:マイ
コプラズマ サリバリウム(Il、91■マ慕rlu雷
) PG−20dニアコレプラズマ レイドロウイイ
(^、lNd11w1l) PC−88:マイコプラ
ズマ アルギニ−ニ(1,arglnlnl) G−
230flマイコプラズマ ヒョライニス(1,hyo
rhlnls) BST−7但し、λ〜Cはヒト由来
のものであり、dおよびeはラン由来のものであり、f
はブタ由来のものである。
マ作用(MIC)は、対照化合物1〜4よりも強い、対
照化合物1の抗マイコプラズマ作用は優れているが、本
発明の化合物Aの方が更に2〜8倍も強い。
液体希釈法により最小発育阻止濃度(MIC,μg/m
l)および最小殺マイコプラズマ濃度(MMC。
法は試験例1の場合とは異なる。
を前培養用培地で5倍希釈し、つづいて更に2倍希釈系
列を調製する。この希釈液の50μ!ずつをマイクロプ
レートのウェルに分注する。なお、供試薬剤無添加のウ
ェルを対照とした。
マ懸濁液をマイクロピペットを用いて上記供試薬剤無添
加ウェルに50μβずつ滴下する。マイクロプレートを
プレートシールで密封し、マイクロミキサーで振盪後、
37℃で5日間培養する。供試薬剤無添加の対照では培
養2日後にマイコプラズマの増殖による培地の変色が認
められる。この時点でキャサラレプリケーターを用いて
液体培養液3μlを供試薬剤を含まないチャノック寒天
培地上に接種する。上記液体培地および寒天培地を更に
37℃で3日間培ft[マイコプラズマ オラーレの場
合は嫌気培養、アコレプラズマ レイドロウイイおよび
マイコプラズマ アルギニm;の場合は好気培f!]す
る。5日目の観察結果からMICおよびMMCを決定す
る。すなわち、液体培地でマイコプラズマの増殖が認め
られない供試薬剤の最小濃度をMICとし、寒天培地で
マイコプラズマの増殖が認められない供試薬剤の最小濃
度をMMCとした。
り第2表に示すように化合物A。
合物はMIC値において殺マイコプラズマ的に作用する
。
おいて静マイコプラズマ的に作用し、殺マイコプラズマ
的には作用しない。
化合物よりも優れている。
にマイコプラズマで汚染せしめた動物細胞を供試薬剤を
含む培地で4日間培養し、その後、供試薬剤無添加の培
地で継代培養を行い、マイコプラズマが再び増殖(すな
わち再汚染)するかどうかをみた。
のマイコプラズマを試験例1(1)の如く前培養を行い
、その培養液2mlをI 、 500 xg130分間
遠心してマイコプラズマを分離する。
胎児血1nとペニシリンG100単位l■lを添加した
培地、すなわち10%−FBS−MEM培地の2■!中
に前記の分離マイコプラズマを懸濁する。
−M E M培地中に2.5XIO’個/■!の濃度
になるように懸濁し、この4mlずつを2枚の円形カバ
ーグラス(直径1.8 cm)を入れた組織培養用シャ
ーレ(直径6C1)に分注し、つづいて前記マイコプラ
ズマ懸濁液1mfを更に加える。これを37°C95%
炭酸ガス−空気(加湿)中で3日間培養後、継代培養を
2回行う。DNA結合・蛍光色素染色法(前出の「ヒト
・動物および植物マイコプラズマの分離と同定」第95
〜97頁)により細胞がマイコプラズマで汚染(80%
以上の細胞がマイコプラズマ陽性)されたことを&l!
認した。
項のように培養する。供試薬剤の1.000μg/ml
水溶液を調製し、これを10%−F n S −M E
Mで所定0度に希釈したものを培地中に添加する。
は円形カバーグラスを2牧人れてマイコプラズマ検査用
とし、他の1枚にはカバーグラスを入れずに継代培養用
とした。供試薬剤含を培地での培養は4日間行い、その
後3週間は供試薬剤を含まない培地で培養を続ける。培
地交換は3〜4日毎に行い、継代は毎週−回行う。マイ
コプラズマの検査は4日目、7日目、その後は1週間毎
に行う。マイコプラズマの検出はDNA結合・蛍光色素
染色法で行う。
: マイコプラズマ陽性 −; マイコプラズマ陰性 第3表に示すように本発明化合物Aの0.2μg/ m
l >Fi加系では両マイコプラズマ種において、培
?i4日後にマイコプラズマ陰性になり、その後は薬剤
無添加で継代培養をしてもマイコプラズマの再増殖は全
く認められない。対照化合物lも優れたマイコプラズマ
汚染の防止・除去作用を示すが、その有効濃度は0.3
9μg/mlであり、本発明化合物A(7)場合よりも
約2倍濃い0度が必要である。 対照化合物2(シプロ
フロキサシン)の3.13μg/ml添加系ではA、レ
イドロウイイPG−8のマイコプラズマ種のみ培′a4
日以降マイコプラズマ陰性となった。対照化合物3(ミ
ノサイクリ/)の12.5μg/ml添加系でも培養4
日後にマイコプラズマ陰性となるが、その後に薬剤を除
去して培養すると顕著なマイコプラズマの再増殖がみら
れる。
されたヒト肺カルシノーマ細胞[I]およびヒトメラン
ーマ細胞[■]に対するマイコプラズマを5染の防止・
除去作用を試験例3に窄じて行い、第4表の結果を得た
。
たマイコプラズマ種は不明である。
−; マイコプラズマ陰性 + ; マイコプラズマ陽性 第4表に示すように本発明化合物Aのマイコプラズマ除
去濃度は0.2μg/mlであり、対照化合物1の1/
2、対照化合物2(シプロフロキサシ/)のl/32で
ある。
の増殖を阻害するかどうかを調べた。
−FUS−MEMで2倍系列希釈する。
細胞F Lを2XIO’個セ濁し、組織培養用シャシ(
直径60mm)にまき、37℃、5%炭酸ガス−空気(
加Ilり中で48時間培養する。先にI製した供試薬剤
溶液0.4m lずつを各シャーレに添加して所定濃度
となし、更に3日間培養する。培養終了後、培地を除去
し、ダルベツコ(Dulbecco)のり/酸緩衝液(
pt17.4 >で1回洗浄する。2.5%トリプシン
−0,002%EDT^混液(1:9)の0.2■!を
加えて細胞をはがし、10%−FBS−MEM培地で適
当に希釈した後、エルマ血球計算盤で細胞数を測定する
。
添加系の平均増殖細胞数6”平均増殖細胞数=[5日目
の平均細胞数]−[2日目の平均細胞数]50%細胞増
殖阻害濃度(ICso:μg/++1)は濃度−百分率
回帰直線から算出する。その結果を次に示す。
80〜14401 13.2
60〜5282 28
9〜72第5表に示すように供試薬
剤の50%細胞増殖阻害dlf(I C50; ug/
ml )は、これらのマイコプラズマに対するMICよ
りも高い。IC50値と第1表におけるMIC値との比
は、本発明化合物へでは180〜+440、対照化合物
1では66〜528、対照化合物2(シプロフロキサシ
ン)↑は9〜72であり、安全域は本発明化合物Aが最
も広い。
件としては動物や植物の染色体に悪い影響を与えないこ
とが要請され、この点においても本発明化合物Aは優れ
ている。
染を防止するためにペニシリンGやストレプトマイシン
の如き抗生物質が培地に添加されるのが一般的である。
4よりも優れている。
に対するMIC値は0.0063μg / m lであ
り、化合物1のそれは0.025μg/mlであり、化
合物Aの方が約4借も強い抗菌力を仔している。
Gやストレプトマイシンの使用を省略することができる
。
し、その3〜5日後に培地の交換を行い、培養開始約7
日後に継代培養を行い、これらの操作を操り返すことに
より実施される。
99培地、ハム培地、L−15培地、マツコイ5A培地
、CMRL 1060培地、RPMI 1040培地、
NCTC135培地、ウィリアムE培地、ウェイマウス
培地、トロウェルT−8培地などが挙られる。
たは培養中の任意の時点で、化合物Aまたはその塩を培
地に添加することにより実施できる。
にあらかじめ加えておいでもよいし、培養の途中で加え
てもよい。化合物Aまたはその塩は、培養の全期間を通
じて存在していてもよいし、−部の期間だけ存在してい
てもよい。例えば、化合物へまたはその塩を含有する培
地に細胞を接種し、培養し、培地交換のときに化合物A
またはその塩を含有しない培地を用いて培養してもよい
。しかし、化合物Aまたはその塩は培養の全期間を通じ
て存在せしめるのが一般的である。マイコプラズマ汚染
が除去されたかどうかは、例えば、ON八へ合・蛍光色
素染色法などの方法によりチエツクできる。
汚染の程度によって変化するが、0.2〜10μg /
m l s好ましくは0.4〜a u g/m lの
範囲から選択される。
または粉末の形で培地に添加される。化合物Aまたはそ
の塩を含む溶液(以下、試薬溶液という)の添加液量は
、液体培地容量の2%以下、特に好しくは1%以下の範
囲から選択するのがよい。なぜならば、大量の溶液を培
地に加えることは、培地を希釈することになり、細胞の
増殖に悪い影響を与えることもあるからである。一般に
試薬溶液中の化合物Aまたはその塩の10度は15gg
/m1以上、好ましくは30gg/m1以上、特に好ま
しくは40〜70μg/mlの範囲内から選択するのが
よい。試薬溶液は、化合物Aまたはその塩を小量の希ア
ルカリ溶液や希l!1[溶液またはメタノール、エタノ
ール、ジメチルスルホキサイドの如きa機溶媒に溶解し
、水を加えて希釈することにより調製できる。試薬溶液
は培地成分の一部や緩衝液、安定化剤などを更に介在し
ていてもよい。
として、予じめ培地に加えておいてもよい。この場合、
ペニシリンGやストレプトマイシンの如き抗生物質の添
加を省略することもできる。
説明する。
の化合物Aを2.4 m lの0.I N −NaOH
水溶液に溶解する。この溶液に水を加えて10100O
となし、これをミリポアフィルタ−により濾過し、その
5mlづつを褐色バイアルに分注する。
いる。
の5−アミノ−1−シクロプロピル−6、7,8−トリ
フルオロ−1,4−ジヒドロ−4−オキソキノリン−3
−カルボン酸、1.15gの2−アセチルアミノメチル
モルホリン、1gのトリエチルアミンおよびIOm l
のビリジ/からなる混合物を16時間加熱還流する。反
応液を減圧でt5縮乾固し、残渣に酢酸エチルを加えて
結晶を濾取する。
る。抽出液を乾燥後濃縮し、残渣をエタノールから再結
晶して720 m gの5−アミノ−7−(2−アセチ
ルアミノメチルモルホリノ)−1−シクロプロピル−6
、8−ジフルオロ−1,4−ジヒドロ−4−オキソキノ
リン−3−カルボン酸を得る。
塩ff115m1を加え90分間加熱還流する。反応液
を減圧下に濃縮した後、残渣を水−エタノールより再結
晶して化合物Aの塩酸塩300 m gを得る。
水に溶解し、これを10%アンモニア水で中和し、クロ
ロホルムで抽出する。抽出液を乾燥後濃縮し、残渣をエ
タノールから再結晶して!20 m gの化合物Aを得
る。m 、 p、 215〜217℃。
マ作用を有するとともに培養細胞に対する毒性が弱い。
マ科やアコレプラズマ科、スピロプラズマ科などを含む
マイコプラズマ目に属するマイコプラズマにより汚染さ
れた培養細胞からマイコプラズマを確実に除去する。ま
た、本発明の化合物Aまたはその塩はこれらのマイコプ
ラズマ汚染の防止を達成するものであり、本発明は動植
物細胞のいずれの培養に適用できる。
Claims (6)
- (1)一般式( I ) ▲数式、化学式、表等があります▼( I ) (式中、Rは水素原子を意味するか、ある いはハロゲン原子または水酸基もしくはア ミノ基で置換されていてもよい炭素数1〜 5の低級アルキル基を意味する。) で表わされるピリドンカルボン酸またはその塩を有効成
分とする抗マイコプラズマ剤。 - (2)Rがアミノメチル基である請求項1記載の抗マイ
コプラズマ剤。 - (3)Rがモルホリノ基の2位と結合するアミノメチル
基である請求項2記載の抗マイコプラズマ剤。 - (4)請求項1記載の一般式( I )で表わされるピリ
ドンカルボン酸またはその塩を有効成分とする培養細胞
におけるマイコプラズマ汚染の防止ないし除去剤。 - (5)Rがアミノメチル基である請求項4記載の培養細
胞におけるマイコプラズマ汚染の防止ないし除去剤。 - (6)Rがモルホリノ基の2位と結合するアミノメチル
基である請求項5記載の培養細胞におけるマイコプラズ
マ汚染の防止ないし除去剤。
Priority Applications (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63162918A JP2709604B2 (ja) | 1988-06-29 | 1988-06-29 | マイコプラズマ汚染の防止または除去 |
US07/371,974 US5051419A (en) | 1988-06-29 | 1989-06-27 | Prevention or elimination of mycoplasma contamination of animal or plant cell cultures |
AT89111783T ATE96837T1 (de) | 1988-06-29 | 1989-06-28 | Vorbeugung oder beseitigung von mycoplasmakontamination in pflanzlichen oder tierischen zellkulturen. |
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