JPH02111374A - 杭凝固処理された血液から血小板、リンパ球および単核大白血球を分離する方法 - Google Patents
杭凝固処理された血液から血小板、リンパ球および単核大白血球を分離する方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は抗凝固処理された血液から血小板、リンパ球お
よび単核大白血球を分離する方法に関するものである。
よび単核大白血球を分離する方法に関するものである。
人間の血液からの白血球、特にリンパ球の分離は、組織
適合性測定、特に器官移植を要する患者の組織適合性Δ
Ｐ＋定にとって臨床上必要である。免疫閉止に必要な薬
物治療のタイプおよびレベルが問題となる場合にリンパ
球作用の７Ｉｌｌｌ定が必要とされる。
適合性測定、特に器官移植を要する患者の組織適合性Δ
Ｐ＋定にとって臨床上必要である。免疫閉止に必要な薬
物治療のタイプおよびレベルが問題となる場合にリンパ
球作用の７Ｉｌｌｌ定が必要とされる。
通常の判路技術によって採取された抗凝固処理された人
間の血液からリンパ球および単核大白血球を分離するの
に現在行なわれている方法は、般にはフィコール バキ
ュ−（Ｐｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ、登録商標）である特
殊なニュートン流動体による血球の遠心分離を利用した
ものである。このフィコール バキューは１．０７７
ｇ７ｃｃの比重を有する流動体であり、ファルマチア
ファインケミカル社（Ｐｈａｒｍａｃｌａ Ｆｉｎｅ
ＣｈｅＬｌｉｃａｌｓ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗ
ｅｄｅｎ）から市販されている。この方法は下記の４つ
の基本的な工程からなる。
間の血液からリンパ球および単核大白血球を分離するの
に現在行なわれている方法は、般にはフィコール バキ
ュ−（Ｐｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ、登録商標）である特
殊なニュートン流動体による血球の遠心分離を利用した
ものである。このフィコール バキューは１．０７７
ｇ７ｃｃの比重を有する流動体であり、ファルマチア
ファインケミカル社（Ｐｈａｒｍａｃｌａ Ｆｉｎｅ
ＣｈｅＬｌｉｃａｌｓ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗ
ｅｄｅｎ）から市販されている。この方法は下記の４つ
の基本的な工程からなる。
（１）あらかじめ決められた量のフィコール バキュー
を試験管の底に設置する工程、 （′２Ｊ そのままのあるいは希釈した血液試料を注
意深くフィコール バキュー上にピペットで移す工程、 （３）フィコール パキューの比重（１，０７７）より
も大きな比重を有する血液成分が、フイコールバキュー
中に進むかあるいはフィコール バキューを通過するよ
うに、フィコール バキューー血液調製物を４００乃至
５００Ｇで約３０乃至４０分間遠心分離する工程、およ
び （４） ピペットで白血球（主としてリンパ球）をフ
ィコール パキュー相から分離し取り出す工程。
を試験管の底に設置する工程、 （′２Ｊ そのままのあるいは希釈した血液試料を注
意深くフィコール バキュー上にピペットで移す工程、 （３）フィコール パキューの比重（１，０７７）より
も大きな比重を有する血液成分が、フイコールバキュー
中に進むかあるいはフィコール バキューを通過するよ
うに、フィコール バキューー血液調製物を４００乃至
５００Ｇで約３０乃至４０分間遠心分離する工程、およ
び （４） ピペットで白血球（主としてリンパ球）をフ
ィコール パキュー相から分離し取り出す工程。
上記現在行なわれている方法はいくつかの次点を有して
いる。まず第１に、最初血液試料をフィコール バキュ
ー上にピペットで移す時、白血球かもしフィコール バ
キュー媒体の表面より下に広がった場合には、フィコー
ル バキューの比重が局部的に減少し、この減少した比
重はリンパ球および単核大白血球を分離するのには不適
当である。
いる。まず第１に、最初血液試料をフィコール バキュ
ー上にピペットで移す時、白血球かもしフィコール バ
キュー媒体の表面より下に広がった場合には、フィコー
ル バキューの比重が局部的に減少し、この減少した比
重はリンパ球および単核大白血球を分離するのには不適
当である。
第２に、遠心分離の間に血液中のより軽い相がフィコー
ル パキュー媒体中に取り込まれた場合、４００乃至５
００Ｇによって生じる浮力は小さいので取り込まれた相
はフィコール パキューヲ通って上昇することができな
い。第３に、フイコールバキューは水溶性であり、より
大きな遠心分離速度は血液中でのフィコール バキュー
の溶解度を増加させ、このためにフィコール パキュー
の比重が変化するので、約４００乃至５００Ｇよりも大
きな遠心力を使用することができない。第４に、遠心分
離が終った後、ピペットによるフイコールバキュー媒体
からの白血球の分離は、フイコールバキュー媒体がニュ
ートン特性を有しているので非常に注意深く行なわれな
ければならない。第５に、この方法を行なうのには１乃
至２時間を要し、従ってより迅速な方法が強く望まれて
いる。
ル パキュー媒体中に取り込まれた場合、４００乃至５
００Ｇによって生じる浮力は小さいので取り込まれた相
はフィコール パキューヲ通って上昇することができな
い。第３に、フイコールバキューは水溶性であり、より
大きな遠心分離速度は血液中でのフィコール バキュー
の溶解度を増加させ、このためにフィコール パキュー
の比重が変化するので、約４００乃至５００Ｇよりも大
きな遠心力を使用することができない。第４に、遠心分
離が終った後、ピペットによるフイコールバキュー媒体
からの白血球の分離は、フイコールバキュー媒体がニュ
ートン特性を有しているので非常に注意深く行なわれな
ければならない。第５に、この方法を行なうのには１乃
至２時間を要し、従ってより迅速な方法が強く望まれて
いる。
人間の血液試料中の血小板の数の測定は、凝血における
欠陥を知るのに臨床上重要である。他の血液成分、特に
赤血球および白血球からの血小板の分離は、この血小板
の数の測定を非常に迅速に行なうことを可能にする。さ
らに、あるタイプの血友病においては、血小板の欠乏は
激しい出血の原因となる。この問題をなくすために考え
られている手法の１つは、血小板濃度の高い血漿を出自
個所に与えて凝血を促進させることである。
欠陥を知るのに臨床上重要である。他の血液成分、特に
赤血球および白血球からの血小板の分離は、この血小板
の数の測定を非常に迅速に行なうことを可能にする。さ
らに、あるタイプの血友病においては、血小板の欠乏は
激しい出血の原因となる。この問題をなくすために考え
られている手法の１つは、血小板濃度の高い血漿を出自
個所に与えて凝血を促進させることである。
血小板を分離するのに現在行なわれている方法は、抗凝
固処理された採血管中に血液を採取し、その後遠心分離
を行なうことからなる。はとんどの赤血球および白血球
は管の底に沈澱し、血小板が懸濁した血漿が上層中に残
留する。その後血小板を含有する血漿は赤血球と混ざる
のを避けるためにピペットによって注意深く取り出され
る。
固処理された採血管中に血液を採取し、その後遠心分離
を行なうことからなる。はとんどの赤血球および白血球
は管の底に沈澱し、血小板が懸濁した血漿が上層中に残
留する。その後血小板を含有する血漿は赤血球と混ざる
のを避けるためにピペットによって注意深く取り出され
る。
上述から明らかなように、現行の方法は血漿成分を注意
深くピペットで取り出すという非常に退屈な操作を必要
とするが、さらに重要なことは、この方法はもともと赤
血球および白血球から血小板を完全には分離し得ないも
のであることである。
深くピペットで取り出すという非常に退屈な操作を必要
とするが、さらに重要なことは、この方法はもともと赤
血球および白血球から血小板を完全には分離し得ないも
のであることである。
ある臨床上の測定においては、血小板の存在はリンパ球
あるいは単核大白血球の作用を不明瞭にするので、リン
パ球および単核大白血球から血小板を分離することが極
めて重要になる。
あるいは単核大白血球の作用を不明瞭にするので、リン
パ球および単核大白血球から血小板を分離することが極
めて重要になる。
本発明は抗凝固性血液からリンパ球と単核大白血球を、
さらには付随的に血小板を分離する方法に関するもので
あり、本発明の方法によれば上述のフィコール パキュ
ーを使用する方法よりも著しく迅速に該分離を行なうこ
とができる。ラッカー氏およびカーセン氏はリンパ球は
赤血球および顆粒白血球よりも小さい比重を有している
と報告している（Ｂｌｏｏｄ、３４：５９１，１９６９
）。単核大白血球はリンパ球とほぼ同じ比重を有してお
り、血液中にリンパ球の数の約２５％以下の量存在して
いる。血小板は約１．０２５乃至１．０３ｇ／ｃｃの比
重を有している。
さらには付随的に血小板を分離する方法に関するもので
あり、本発明の方法によれば上述のフィコール パキュ
ーを使用する方法よりも著しく迅速に該分離を行なうこ
とができる。ラッカー氏およびカーセン氏はリンパ球は
赤血球および顆粒白血球よりも小さい比重を有している
と報告している（Ｂｌｏｏｄ、３４：５９１，１９６９
）。単核大白血球はリンパ球とほぼ同じ比重を有してお
り、血液中にリンパ球の数の約２５％以下の量存在して
いる。血小板は約１．０２５乃至１．０３ｇ／ｃｃの比
重を有している。
平均比重１．０７９３ｇ／ｃｃ １．０７４７ｇ／ｃｃ
１．０６３２ｇ／ｃｃ分布の標準偏差 ０．ＱＯ３
１０，００５４０，００２５一般には本発明の方法は （１ン 血液成分に対して化学的に不活性であり、血
小板、リンパ球および単核大白血球よりは大きいが血液
のその他の血球成分よりも小さな比重を有する不水溶性
揺変性ゲル状物質、すなわちグリースを血液試料中に入
れ、 （２１ゲル状物質−血液試料を大きな相対遠心力、すな
わち少なくとも１２００Ｇ 、好ましくは１４００Ｇ以
上の遠心力で、ゲル状物質が重たい血球と軽い血球の間
に障壁を形成するのに充分な時間の間遠心付離し、その
後 （３）上記分離工程の間にゲル状物質を通り抜けて上方
に移動した血液の血漿成分、血小板、リンパ球および単
核大白血球を除去する ことからなる。その後血球の数の測定が行なわれる。
１．０６３２ｇ／ｃｃ分布の標準偏差 ０．ＱＯ３
１０，００５４０，００２５一般には本発明の方法は （１ン 血液成分に対して化学的に不活性であり、血
小板、リンパ球および単核大白血球よりは大きいが血液
のその他の血球成分よりも小さな比重を有する不水溶性
揺変性ゲル状物質、すなわちグリースを血液試料中に入
れ、 （２１ゲル状物質−血液試料を大きな相対遠心力、すな
わち少なくとも１２００Ｇ 、好ましくは１４００Ｇ以
上の遠心力で、ゲル状物質が重たい血球と軽い血球の間
に障壁を形成するのに充分な時間の間遠心付離し、その
後 （３）上記分離工程の間にゲル状物質を通り抜けて上方
に移動した血液の血漿成分、血小板、リンパ球および単
核大白血球を除去する ことからなる。その後血球の数の測定が行なわれる。
ゲル状物質、すなわちグリースの組成は、以下のような
基準が満たされる限り重要な要因ではない。
基準が満たされる限り重要な要因ではない。
（ａ）ゲル状物質は約１．０６５乃至１．０７７ ｇ／
ｃｃの比重を有していなければならない。
ｃｃの比重を有していなければならない。
（ｂ）ゲル状物質は血液中に存在する成分に関して化学
的に不活性でなければならない。
的に不活性でなければならない。
（ｃ）遠心分離の後血小板、リンパ球および単核大白血
球が障壁中に浸透するのを最小にするために、ゲル状物
質は揺変性でなければならない。
球が障壁中に浸透するのを最小にするために、ゲル状物
質は揺変性でなければならない。
すなわち、ゲル状物質は１より太きく１０以下の揺変指
μを有していなければならない。
μを有していなければならない。
（ｄ）ゲル状物質は、約１２００乃至２５００Ｇの遠心
力を受けた時に流動し、これによって血小板、リンパ球
および単核大白血球と重たい血球との間に望みの障壁を
形成するのに充分な粘度を示すものでなければならない
。
力を受けた時に流動し、これによって血小板、リンパ球
および単核大白血球と重たい血球との間に望みの障壁を
形成するのに充分な粘度を示すものでなければならない
。
本発明の方法は従来の開口採血管および閉口採血管のい
ずれによっても行なうことができる。開口採血管が使用
される場合には、ゲル状物質は一般に遠心分離操作の直
前に管の中に入れられる。
ずれによっても行なうことができる。開口採血管が使用
される場合には、ゲル状物質は一般に遠心分離操作の直
前に管の中に入れられる。
ゲル状物質はしばしば管の内壁の血液試料の水平面より
も高い位置に置かれる。閉口採血管が使用される場合に
は、ゲル状物質はゴム栓あるいはその他の通常の手段に
よって管が閉口される前に、管内のいかなる場所に置か
れてもよい。一般に、ガラスあるいはプラスチック製の
採血管が使用される。
も高い位置に置かれる。閉口採血管が使用される場合に
は、ゲル状物質はゴム栓あるいはその他の通常の手段に
よって管が閉口される前に、管内のいかなる場所に置か
れてもよい。一般に、ガラスあるいはプラスチック製の
採血管が使用される。
リンパ球および単核大白血球からの血小板の分離が望ま
れる場合には、血小板、リンパ球および単核大白血球を
含む血漿成分が、先に述べた本発明の方法によって処理
される。しかしながらこの場合には、１．０５５ ｇ／
ｃｃ以下、一般には１．０３乃至１．０５５ ｇ／ｃｃ
の比重を有する不水溶性揺変性物質が使用されなければ
ならない。勿論、すべての赤血球および白血球からの血
小板の単一分離が望まれる場合には、１．０５５ ｇ／
ｃｅ以下の比重を有するゲル状物質が使用されなければ
ならないことは明白である。
れる場合には、血小板、リンパ球および単核大白血球を
含む血漿成分が、先に述べた本発明の方法によって処理
される。しかしながらこの場合には、１．０５５ ｇ／
ｃｃ以下、一般には１．０３乃至１．０５５ ｇ／ｃｃ
の比重を有する不水溶性揺変性物質が使用されなければ
ならない。勿論、すべての赤血球および白血球からの血
小板の単一分離が望まれる場合には、１．０５５ ｇ／
ｃｅ以下の比重を有するゲル状物質が使用されなければ
ならないことは明白である。
米国特許第３．１１１５２．１９４号には、分離される
２つの相の中間の比重を有する揺変性ゲル状物質を用い
て、血液試料中に存在するより重たい相をより軽い相か
ら分離する方法が開示されている。ゲル状物質は血液試
料とともに遠心分離される。この遠心分離操作の間にゲ
ル状物質は流動して分離される２つの相の間に障壁を形
成する。この障壁はその上に存在する相の容易な、かつ
ほぼ完全な除去を可能にする。
２つの相の中間の比重を有する揺変性ゲル状物質を用い
て、血液試料中に存在するより重たい相をより軽い相か
ら分離する方法が開示されている。ゲル状物質は血液試
料とともに遠心分離される。この遠心分離操作の間にゲ
ル状物質は流動して分離される２つの相の間に障壁を形
成する。この障壁はその上に存在する相の容易な、かつ
ほぼ完全な除去を可能にする。
この特許には上記方法に使用される種々のゲル状物質、
すなわちグリースが述べられている。これらの物質に必
須の属性として、以下の３つの基準が述べられている。
すなわちグリースが述べられている。これらの物質に必
須の属性として、以下の３つの基準が述べられている。
（１）分離される２つの相の中間の比重を有すること。
１．０３５乃至１．０６ｇ／ｃｃ、好ましくは１．０４
乃至１．０５５ ｇ／ｃｃの比重を有する物質が有効で
ある。
乃至１．０５５ ｇ／ｃｃの比重を有する物質が有効で
ある。
（乞 分離される２つの相と化学反応を起さないこと。
（３）静止状態において非流動性（半剛体）であること
。
。
この特許には、リンパ球および単核大白血球の分離に関
しては何も開示されておらず、また少なくとも１．２０
０Ｇ、好ましくは１４００Ｇ以上の遠心力を使用する分
離方法に関しても何も開示されていない。
しては何も開示されておらず、また少なくとも１．２０
０Ｇ、好ましくは１４００Ｇ以上の遠心力を使用する分
離方法に関しても何も開示されていない。
上記のような大きな遠心力は、リンパ球および単核大白
血球をゲル状物質−血漿界面に浮き上がらせるのに充分
な浮力を生ぜしめるのに必要とされる。
血球をゲル状物質−血漿界面に浮き上がらせるのに充分
な浮力を生ぜしめるのに必要とされる。
米国特許第Ｌ９２０．５４９号には、上記米国特許３．
８５２，１９４号の発明の変形および改良が述べられて
いる。上記米国特許筒３．８５２．１９４号の発明につ
いて改良がなされた点は、「エナージャイザー」（ｅｎ
ｅｒｇｉｚｅｒ）と称せられる固体成分を採血管に挿入
して使用することである。このエナージャイザーはゲル
状物質よりも大きな比重を有している。
８５２，１９４号の発明の変形および改良が述べられて
いる。上記米国特許筒３．８５２．１９４号の発明につ
いて改良がなされた点は、「エナージャイザー」（ｅｎ
ｅｒｇｉｚｅｒ）と称せられる固体成分を採血管に挿入
して使用することである。このエナージャイザーはゲル
状物質よりも大きな比重を有している。
遠心分離操作の間に、エナージャイザーがゲル状物質（
通常採血管の底に置かれる）に衝撃を与え、これによっ
てそゲル状物質が採血管の壁にそって上方に移動するの
を容易にする。エナージャイザーを含ませることは、各
血液成分の分離を促進させ、各血液成分のより明確な分
離を可能にする。
通常採血管の底に置かれる）に衝撃を与え、これによっ
てそゲル状物質が採血管の壁にそって上方に移動するの
を容易にする。エナージャイザーを含ませることは、各
血液成分の分離を促進させ、各血液成分のより明確な分
離を可能にする。
この特許には比較的大きな遠心力（ＩｌｏｏＧ）の使用
が述べられているが、他の血液成分からリンパ球および
単核大白血球を分離することについては何も延べられて
いない。ここでもまた使用されるゲル状物質の比重は１
．０：（５乃至１．０８ｇ／ｃｃ、好ましくは１．０４
乃至１．０５５ ｇ／ｃｃの範囲にあることが述べられ
ている。
が述べられているが、他の血液成分からリンパ球および
単核大白血球を分離することについては何も延べられて
いない。ここでもまた使用されるゲル状物質の比重は１
．０：（５乃至１．０８ｇ／ｃｃ、好ましくは１．０４
乃至１．０５５ ｇ／ｃｃの範囲にあることが述べられ
ている。
米国特許筒３，９６３，１１９号には、密閉剤を採血管
中に設置するための装置が述べられている。この特許で
述べられている密閉剤は、上記米国特許筒３．８５２，
１９４号および第３，９２０，５４９号で述べられてい
るゲル状物質と同じタイプのものであり、同じ働きをす
るものである。
中に設置するための装置が述べられている。この特許で
述べられている密閉剤は、上記米国特許筒３．８５２，
１９４号および第３，９２０，５４９号で述べられてい
るゲル状物質と同じタイプのものであり、同じ働きをす
るものである。
この特許には１．０２６乃至１．０９２ ｇ／ｃｃの比
重を有する密閉剤が述べられているが、好ましい範囲は
１．０３０乃至１゜０５０ｇ／ｃｃであることが述べら
れている。他の血液成分からのリンパ球および単核大白
血球の分離に関しては何も述べられておらず、また大き
な遠心力、すなわち少なくとも１２００Ｇの遠心力が有
効であることも指摘されていない。
重を有する密閉剤が述べられているが、好ましい範囲は
１．０３０乃至１゜０５０ｇ／ｃｃであることが述べら
れている。他の血液成分からのリンパ球および単核大白
血球の分離に関しては何も述べられておらず、また大き
な遠心力、すなわち少なくとも１２００Ｇの遠心力が有
効であることも指摘されていない。
本発明の方法のこのましい具体例を説明する以下の実施
例において、使用されるゲル状物質、すなわちグリース
はシリコン流動体と非常に細かい疎水性のシリカ粉末と
の混合物からなる。用いられたシリコン流動体はダウ
コーニング社（ＤｏｖＣｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａ
ｔｉｏｎ、 Ｍｌｄｌａｎｄ、 Ｍｉｃｈｉｇａｎ）に
よって製造され、ダウ コーニング社社報ＣＰＯ−１０
７２およびＣＰ Ｏ−１５８−１（Ｄｏｖ Ｃｏｒｎｌ
ｎｇＢｕｌｌｅｔｉｎｓ ＣＰＯ−１０７２，Ｍａｒｃ
ｈ、 １９７２ ａｎｄ ＣＰＯ−１５８−１、Ｍａｒ
ｃｈ、 １９７２ ）に記載されているジメチルポリシ
ロキサン流動体であるダウ コーニング２００流動体（
Ｄｏｖ Ｃｏｒｎｉｎｇ ２００ Ｆｌｕｉｄ）である
。キャボット社（Ｃａｂｏｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｌｏｎ
、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）によっ
て製造され、キャボット社パンフレット５ＧＥＮ−１に
記載されているシラノックス１０１（Ｓ１１ａｎｏｘ
１０１、登録商標）がシリカ粉末として用いられた。こ
の物質は熱分解法シリカの表面にトリメチル基を結合さ
せて疎水性を付与したものである。しかしながら、先に
説明したように、ゲル状物質に必要な特性基準を満たす
ものであるならば非シリコン揺変性ゲル状物質もまた同
様に使用することができる。
例において、使用されるゲル状物質、すなわちグリース
はシリコン流動体と非常に細かい疎水性のシリカ粉末と
の混合物からなる。用いられたシリコン流動体はダウ
コーニング社（ＤｏｖＣｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａ
ｔｉｏｎ、 Ｍｌｄｌａｎｄ、 Ｍｉｃｈｉｇａｎ）に
よって製造され、ダウ コーニング社社報ＣＰＯ−１０
７２およびＣＰ Ｏ−１５８−１（Ｄｏｖ Ｃｏｒｎｌ
ｎｇＢｕｌｌｅｔｉｎｓ ＣＰＯ−１０７２，Ｍａｒｃ
ｈ、 １９７２ ａｎｄ ＣＰＯ−１５８−１、Ｍａｒ
ｃｈ、 １９７２ ）に記載されているジメチルポリシ
ロキサン流動体であるダウ コーニング２００流動体（
Ｄｏｖ Ｃｏｒｎｉｎｇ ２００ Ｆｌｕｉｄ）である
。キャボット社（Ｃａｂｏｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｌｏｎ
、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）によっ
て製造され、キャボット社パンフレット５ＧＥＮ−１に
記載されているシラノックス１０１（Ｓ１１ａｎｏｘ
１０１、登録商標）がシリカ粉末として用いられた。こ
の物質は熱分解法シリカの表面にトリメチル基を結合さ
せて疎水性を付与したものである。しかしながら、先に
説明したように、ゲル状物質に必要な特性基準を満たす
ものであるならば非シリコン揺変性ゲル状物質もまた同
様に使用することができる。
人間の血液を採取し、充分なＥＤＴＡ抗凝固剤が入った
７ｄガラス採血管中に入れた。約１．５７のシリコン流
動体−疎水性シリカ粉末ゲル状物質の塊りを上記血液試
料が入った管の内壁上に置いた。
７ｄガラス採血管中に入れた。約１．５７のシリコン流
動体−疎水性シリカ粉末ゲル状物質の塊りを上記血液試
料が入った管の内壁上に置いた。
第１図は血液試料が入った採血管の説明図である。血液
試料３が採取された後、開口採血管１の内壁の上端（開
口端）にゲル状物質の塊り２が置かれた。
試料３が採取された後、開口採血管１の内壁の上端（開
口端）にゲル状物質の塊り２が置かれた。
血液試料は平衡状態に到達するまで約１８００Ｇで遠心
分離された。一般に平衡状態に到達するのに約５乃至１
０分間を要した。第２図は遠心分離操作における平衡状
態に到達する前のゲル状物質−血液試料混合物を示すも
のである。ゲル状物質の塊り２は管１の下方へ移動し、
血液試料３の重たい成分と軽い成分は互いに分離し始め
ている。第３図は遠心分離が平衡状態に到達した時の状
態を示す説明図である。第３図から明らかなように、ゲ
ル状物質の塊り２は血液試料の重たい成分および軽い成
分を互いに分離している。血液の血漿成分４と血小板、
リンパ球および単核大白血球５はゲル状物質の障壁２の
上に存在し、一方顆粒白血球６および赤血球７はその他
の重たい成分と共に障壁２の下に保持されている。
分離された。一般に平衡状態に到達するのに約５乃至１
０分間を要した。第２図は遠心分離操作における平衡状
態に到達する前のゲル状物質−血液試料混合物を示すも
のである。ゲル状物質の塊り２は管１の下方へ移動し、
血液試料３の重たい成分と軽い成分は互いに分離し始め
ている。第３図は遠心分離が平衡状態に到達した時の状
態を示す説明図である。第３図から明らかなように、ゲ
ル状物質の塊り２は血液試料の重たい成分および軽い成
分を互いに分離している。血液の血漿成分４と血小板、
リンパ球および単核大白血球５はゲル状物質の障壁２の
上に存在し、一方顆粒白血球６および赤血球７はその他
の重たい成分と共に障壁２の下に保持されている。
次に血漿成分４を除去した。この血漿成分４の除去は血
小板、リンパ球および単核大白血球５を乱さないように
注意深く行なわれた。第４図はピペット８によって血漿
成分４を除去し、障壁２上に血小板、リンパ球および単
核大白血球５を残す様子を示すものである。
小板、リンパ球および単核大白血球５を乱さないように
注意深く行なわれた。第４図はピペット８によって血漿
成分４を除去し、障壁２上に血小板、リンパ球および単
核大白血球５を残す様子を示すものである。
その後のＣａ ＋２． Ｍｇ ”ｉ１Ｍ塩等張緩衝溶液
９を静かに管１のゲル状物質の障壁２上に注いだ（第５
図）。
９を静かに管１のゲル状物質の障壁２上に注いだ（第５
図）。
その後管１を静かに揺り動かすかあるいは撹拌してゲル
状物質の障壁２上に静止していた血小板、リンパ球およ
び単核大白血球５を緩衝溶液９中に懸濁させ、この懸濁
液を管１から除去した。第６図はデカンテーションによ
って懸濁液をゲル状物質の障壁２から除去する様子を示
すものである。
状物質の障壁２上に静止していた血小板、リンパ球およ
び単核大白血球５を緩衝溶液９中に懸濁させ、この懸濁
液を管１から除去した。第６図はデカンテーションによ
って懸濁液をゲル状物質の障壁２から除去する様子を示
すものである。
なお、ここで、上記緩衝溶液の使用は必須ではなく、上
記障壁形成後、障壁をこわさないように管を撹拌して血
漿中に血小板、リンパ球および単核大白血球を再懸濁さ
せ、この懸濁液をピペットでゲル状物質の障壁から除去
するようにしてもよい。
記障壁形成後、障壁をこわさないように管を撹拌して血
漿中に血小板、リンパ球および単核大白血球を再懸濁さ
せ、この懸濁液をピペットでゲル状物質の障壁から除去
するようにしてもよい。
他の血小板、リンパ球および単核大白血球分離方法の場
合と同様に、回収された血球は緩衝溶液で洗浄され、そ
の後数が、１ｌｌｌ定された血球は種々の生物学的薬効
試験に利用された。
合と同様に、回収された血球は緩衝溶液で洗浄され、そ
の後数が、１ｌｌｌ定された血球は種々の生物学的薬効
試験に利用された。
比重および揺変指数が異なる３種類のシリコン流動体−
３ｈ０２粉末混合物を用いて得た実験結果を下表に示す
。
３ｈ０２粉末混合物を用いて得た実験結果を下表に示す
。
第３図に示される血球の分布の正当性が上記データによ
って確かめられる。いずれの場合においても、元の血液
試料に比較して好中球（主な顆粒白血球）の比率は著し
く減少したがリンパ球の比率は著しく増加した。単核大
白血球の比率もまた増加したが、増加の程度はリンパ球
よりもいくぶん低かった。トリパン青染料を使用して７
ＩｌｌＪ定された血球生存能力は９５％以上であった。
って確かめられる。いずれの場合においても、元の血液
試料に比較して好中球（主な顆粒白血球）の比率は著し
く減少したがリンパ球の比率は著しく増加した。単核大
白血球の比率もまた増加したが、増加の程度はリンパ球
よりもいくぶん低かった。トリパン青染料を使用して７
ＩｌｌＪ定された血球生存能力は９５％以上であった。
このようなデータは本発明の血液試料からリンパ球を分
離する方法か実用性を有するものであることを明白に示
している。
離する方法か実用性を有するものであることを明白に示
している。
上記実験は開口採血管を用いて行なわれたが、閉口採血
管を用いても同様に行なうことができる。
管を用いても同様に行なうことができる。
閉口採血管が用いられる場合には、血液試料は揺変性ゲ
ル状物質と充分な量のＥＤＴＡのような抗凝固剤が入っ
た採血管中に採取される。採取された血液試料はその後
遠心分離され、血漿が取り除かれ、そしてリンパ球と単
核大白血球が回収される。
ル状物質と充分な量のＥＤＴＡのような抗凝固剤が入っ
た採血管中に採取される。採取された血液試料はその後
遠心分離され、血漿が取り除かれ、そしてリンパ球と単
核大白血球が回収される。
先に述べたように、非シリコン揺変性ゲル状物質も使用
することができる。例えば、アモコ ケミカル社（Ａｍ
ｏｃｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
、Ｃｈｉｃａｇｏ。
することができる。例えば、アモコ ケミカル社（Ａｍ
ｏｃｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
、Ｃｈｉｃａｇｏ。
Ｉ １１１ｎｏｉｓ）から市販されており、同社の社報
１２−Ｈに主成分が高分子量モノオレフィン（８５％−
９８％）であり、残成分がイソパラフィンであるブチレ
ン重合体であると記載されている炭化水素ゲル状物質ボ
リブデンＨ−１００に、デグッサ社（Ｄｅｇｕｓｓａ、
Ｉｎｃ、、Ｐｉｇｍｅｎｔｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。
１２−Ｈに主成分が高分子量モノオレフィン（８５％−
９８％）であり、残成分がイソパラフィンであるブチレ
ン重合体であると記載されている炭化水素ゲル状物質ボ
リブデンＨ−１００に、デグッサ社（Ｄｅｇｕｓｓａ、
Ｉｎｃ、、Ｐｉｇｍｅｎｔｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）から市販されている熱分解法シリカ
粉末アエロジルＯＸ ５０（ＡＥＲＯＳＩＬ ０Ｘ５０
）を混合してなるゲル状物質を使用した場合には、上述
のシリコン物質の場合と同様の結果が得られる。炭化水
素重合体が用いられる場合には、充填物質を疎水性にす
る必要はない。
粉末アエロジルＯＸ ５０（ＡＥＲＯＳＩＬ ０Ｘ５０
）を混合してなるゲル状物質を使用した場合には、上述
のシリコン物質の場合と同様の結果が得られる。炭化水
素重合体が用いられる場合には、充填物質を疎水性にす
る必要はない。
ボリブデンＨ−１００１００ｇと０Ｘ５０シリカ充填剤
３９．４２ ｇとの混合物は、比重が１．０８７２ｇ／
ｃｃであり、揺変指数が２．７７であった。
３９．４２ ｇとの混合物は、比重が１．０８７２ｇ／
ｃｃであり、揺変指数が２．７７であった。
有用な炭化水素ゲル状物質の別な例として、アルコ ケ
ミカル社（ＡＲＣＯＣｈｅｍｌｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ
、 ＮｅｗＹｏｒｋ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）から市販さ
れており、同社の社報１９７６年４月号に重合度が約５
０のヒドロキシル末端基を有するブタジェンのホモポリ
マーとして記載されているポリｂｄ Ｒ−４５ＨＴ （
Ｐｏｌｙ ｂｄ Ｒ−４５ＨＴ、登録商標）が挙げられ
る。この重合体についてもまた非疎水性充填物質を使用
することができる。
ミカル社（ＡＲＣＯＣｈｅｍｌｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ
、 ＮｅｗＹｏｒｋ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）から市販さ
れており、同社の社報１９７６年４月号に重合度が約５
０のヒドロキシル末端基を有するブタジェンのホモポリ
マーとして記載されているポリｂｄ Ｒ−４５ＨＴ （
Ｐｏｌｙ ｂｄ Ｒ−４５ＨＴ、登録商標）が挙げられ
る。この重合体についてもまた非疎水性充填物質を使用
することができる。
上記ポリ ｂｄ Ｒ−４５ＨＴ １００ ｇと０Ｘ５
０シリカ充填剤３４．３３ ｇとからなる混合物は、比
重が１．０６５ ｇ／ｃｃであり、揺変指数がｌ、２５
であった。
０シリカ充填剤３４．３３ ｇとからなる混合物は、比
重が１．０６５ ｇ／ｃｃであり、揺変指数がｌ、２５
であった。
これらの炭化水素重合体−シリカ混合物は、本発明の方
法に使用されるゲル状物質に要求される上述の特性基阜
を満たすものである。すなわち、これらの炭化水素重合
体−シリカ混合物は、（ａ）約１．０６５乃至１．０７
７ ｇ／ｃｃの比重を有し、（ｂ）血液成分に対して化
学的に不活性であり、（Ｃ）１より大さく１０以下の揺
変指数を有しており、また （ｄ） ２０００Ｇ以下の遠心力で流動し、血小板、リ
ンパ球および単核大白血球と正だい血球との間に望みの
障壁を形成するのに充分な粘度を有している。
法に使用されるゲル状物質に要求される上述の特性基阜
を満たすものである。すなわち、これらの炭化水素重合
体−シリカ混合物は、（ａ）約１．０６５乃至１．０７
７ ｇ／ｃｃの比重を有し、（ｂ）血液成分に対して化
学的に不活性であり、（Ｃ）１より大さく１０以下の揺
変指数を有しており、また （ｄ） ２０００Ｇ以下の遠心力で流動し、血小板、リ
ンパ球および単核大白血球と正だい血球との間に望みの
障壁を形成するのに充分な粘度を有している。
上記米国特許第３．８５２．１９４号には１．０５５
ｇ／ｃｃより小さい比重を有するいくつかのゲル状物質
が述べられているが、それらのゲル状物質はリンパ球お
よび単核大白血球（ならびに血液中のその他赤血球およ
び白血球）から血小板を分離する本発明の方法に有効で
あろう。上記特許に述べられている物質はシリコン流動
体と疎水性シリカ粉末との混合物である。勿論、望みの
比重を示す炭化水素重合体−シリカ ゲル状混合物を配
合することも可能である。
ｇ／ｃｃより小さい比重を有するいくつかのゲル状物質
が述べられているが、それらのゲル状物質はリンパ球お
よび単核大白血球（ならびに血液中のその他赤血球およ
び白血球）から血小板を分離する本発明の方法に有効で
あろう。上記特許に述べられている物質はシリコン流動
体と疎水性シリカ粉末との混合物である。勿論、望みの
比重を示す炭化水素重合体−シリカ ゲル状混合物を配
合することも可能である。
血小板を分離する本発明の方法の有効性を説明するため
に、人間の血液を採取し、血液の凝固を防止するのに充
分な量のＥＤＴＡが入った７−ガラス採血管中に入れた
。１．０４０ ｇ／ｃｃの比重を有するシリコン流動体
−疎水性シリカ粉末ゲル状物質の塊り１．５−を管の内
壁の血液試料水平面よりも上方に置いた。次にこの血液
試料を約１２００Ｇで約５分間遠心分離した。この遠心
分離によってゲル状物質の塊りは血小板を含有する血漿
と赤血球および白血球とを分離する障壁を形成した。そ
の後血小板を含む血漿成分をゲル状物質の障壁からピペ
ットで除去した。
に、人間の血液を採取し、血液の凝固を防止するのに充
分な量のＥＤＴＡが入った７−ガラス採血管中に入れた
。１．０４０ ｇ／ｃｃの比重を有するシリコン流動体
−疎水性シリカ粉末ゲル状物質の塊り１．５−を管の内
壁の血液試料水平面よりも上方に置いた。次にこの血液
試料を約１２００Ｇで約５分間遠心分離した。この遠心
分離によってゲル状物質の塊りは血小板を含有する血漿
と赤血球および白血球とを分離する障壁を形成した。そ
の後血小板を含む血漿成分をゲル状物質の障壁からピペ
ットで除去した。
上記処理を行なっていない血液と上記処理によって得た
血小板を含む血漿を使用してスライドを作製した。いず
れのスイラドも血小板の数は約２００．０００であり、
血漿の顕微鏡試験の結果赤血球および白血球はほとんど
混っていなかった。
血小板を含む血漿を使用してスライドを作製した。いず
れのスイラドも血小板の数は約２００．０００であり、
血漿の顕微鏡試験の結果赤血球および白血球はほとんど
混っていなかった。
上記血小板を分離する実施例において、血液ののかわり
に、血小板、リンパ球および単核大白血球を含む血液の
血漿試料を用いて同様の処理操作を行なうこともできる
。この場合、ゲル状物質は遠心分離後、血漿および血小
板と、リンパ球および単核大白血球との間に障壁を形成
し、よって血漿および血小板をリンパ球および単核大白
血球から分離することができる。この分離は、障壁形成
後、血小板が血漿中に再懸濁するように管を撹拌し、そ
の懸濁液をピペットで吸引するか、または撹拌せずに血
漿をピペットで障壁上の血小板を乱さないように注意深
く除去し、緩衝溶液を加えて血小板をゲル状物質の障壁
表面からｉｌＭさせ、その血小板を含んだ緩衝溶液を吸
引して除去することにより行なう。
に、血小板、リンパ球および単核大白血球を含む血液の
血漿試料を用いて同様の処理操作を行なうこともできる
。この場合、ゲル状物質は遠心分離後、血漿および血小
板と、リンパ球および単核大白血球との間に障壁を形成
し、よって血漿および血小板をリンパ球および単核大白
血球から分離することができる。この分離は、障壁形成
後、血小板が血漿中に再懸濁するように管を撹拌し、そ
の懸濁液をピペットで吸引するか、または撹拌せずに血
漿をピペットで障壁上の血小板を乱さないように注意深
く除去し、緩衝溶液を加えて血小板をゲル状物質の障壁
表面からｉｌＭさせ、その血小板を含んだ緩衝溶液を吸
引して除去することにより行なう。
第１図乃至第６図は本発明の方法の好ましい具体例の概
略説明図である。 第１図は血液試料とゲル状物質を含む開口採血管を示す
ものである。 第２図は遠心分離の間のゲル状物質−血液試料混合物を
示すものであり、ゲル状物質が元の位置から血液試料中
に移動しているのを示している。 第３図は遠心分離の間に平衡状態に達したゲル状物質−
血液試料混合物を示すものであり、流動したゲル状物質
が血小板、リンパ球、単核大白血球および血漿成分とそ
の他の重たい血液成分との間に障壁を形成していること
を示している。 第４図は血漿成分の除去を示すものである。 第５図は緩衝溶液の添加を示すものである。 第６図はリンパ球が緩衝溶液に懸濁した懸濁液のデカン
テーションを示すものである。
略説明図である。 第１図は血液試料とゲル状物質を含む開口採血管を示す
ものである。 第２図は遠心分離の間のゲル状物質−血液試料混合物を
示すものであり、ゲル状物質が元の位置から血液試料中
に移動しているのを示している。 第３図は遠心分離の間に平衡状態に達したゲル状物質−
血液試料混合物を示すものであり、流動したゲル状物質
が血小板、リンパ球、単核大白血球および血漿成分とそ
の他の重たい血液成分との間に障壁を形成していること
を示している。 第４図は血漿成分の除去を示すものである。 第５図は緩衝溶液の添加を示すものである。 第６図はリンパ球が緩衝溶液に懸濁した懸濁液のデカン
テーションを示すものである。
Claims (21)
- （１）ａ）血液成分に対して化学的に不活性であり、１
．０６５乃至１．０７７ｇ／ｃｃの比重を有する不水溶
性揺変性ゲル状物質を抗凝固処理された血液試料中に入
れ、 ｂ）上記ゲル状物質と上記血液試料とを、少なくとも１
２００Ｇの力で、上記ゲル状物質が血漿、血小板、リン
パ球および単核大白血球とより重たい血球との間に障壁
を形成するのに充分な時間の間遠心分離し、その後 ｃ）上記血漿、上記血小板、上記リンパ球および上記単
核大白血球を上記障壁上から除去することからなる抗凝
固処理された血液から血小板、リンパ球および単核大白
血球を分離する方法。 - （２）上記ゲル状物質がシリコン流動体と疎水性シリカ
粉末との混合物からなることを特徴とする特許請求の範
囲第１項記載の分離方法。 - （３）上記ゲル状物質が炭化水素重合体とシリカ粉末と
の混合物からなることを特徴とする特許請求の範囲第１
項記載の分離方法。 - （４）上記炭化水素重合体が、主成分が高分子量モノオ
レフィンであり、残成分がイソパラフィンであるブチレ
ン重合体と、重合度が約５０のヒドロキシル末端基を有
するブタジエンのホモポリマーとからなる群より選ばれ
ることを特徴とする特許請求の範囲第３項記載の分離方
法。 - （５）上記ゲル状物質が１より大きく１０以下の揺変指
数を有していることを特徴とする特許請求の範囲第１項
記載の分離方法。 - （６）上記遠心分離が１２００乃至２５００Ｇの力で行
なわれることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
分離方法。 - （７）上記遠心分離が約５乃至１０分間行なわれること
を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の分離方法。 - （８）ａ）血液成分に対して化学的に不活性であり、１
．０３乃至１．０５５ｇ／ｃｃの比重を有する不水溶性
揺変性ゲル状物質を、血小板、リンパ球および単核大白
血球を含む抗凝固処理された血液の血漿試料中に入れ、 ｂ）上記ゲル状物質と上記血漿試料とを、少なくとも１
２００Ｇの力で、上記ゲル状物質が上記血漿および上記
血小板と上記リンパ球および上記単核大白血球との間に
障壁を形成するのに充分な時間の間遠心分離し、その後 ｃ）上記血漿および上記血小板を上記障壁上から除去す
る ことからなるリンパ球および単核大白血球から血小板を
分離する方法。 - （９）上記ゲル状物質がシリコン流動体と疎水性シリカ
粉末との混合物からなることを特徴とする特許請求の範
囲第８項記載の分離方法。 - （１０）上記ゲル状物質が炭化水素重合体とシリカ粉末
との混合物からなることを特徴とする特許請求の範囲第
８項記載の分離方法。 - （１１）上記炭化水素重合体が、主成分が高分子量モノ
オレフィンであり、残成分がイソパラフィンであるブチ
レン重合体と、重合度が約５０のヒドロキシル末端基を
有するブタジエンのホモポリマーとからなる群より選ば
れることを特徴とする特許請求の範囲第１０項記載の分
離方法。 - （１２）上記ゲル状物質が１より大きく１０以下の揺変
指数を有していることを特徴とする特許請求の範囲第８
項記載の分離方法。 - （１３）上記遠心分離が１２００乃至２５００Ｇの力で
行なわれることを特徴とする特許請求の範囲第８項記載
の分離方法。 - （１４）上記遠心分離が約５乃至１０分間行なわれるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第８項記載の分離方法。 - （１５）ａ）血液成分に対して化学的に不活性であり、
１．０３乃至１．０５５ｇ／ｃｃの比重を有する不水溶
性揺変性ゲル状物質を抗凝固処理された血液試料中に入
れ、 ｂ）上記ゲル状物質と上記血液試料とを、少なくとも１
２００Ｇの力で、上記ゲル状物質が血漿および血小板と
より重たい血液との間に障壁を形成するのに充分な時間
の間遠心分離し、その後 ｃ）上記血漿および上記血小板を上記障壁上から除去す
る ことからなる抗凝固処理された血液から血小板を分離す
る方法。 - （１６）上記ゲル状物質がシリコン流動体と疎水性シリ
カ粉末との混合物からなることを特徴とする特許請求の
範囲第１５項記載の分離方法。 - （１７）上記ゲル状物質が炭化水素重合体とシリカ粉末
との混合物からなることを特徴とする特許請求の範囲第
１５項記載の分離方法。 - （１８）上記炭化水素重合体が、主成分が高分子量モノ
オレフィンであり、残成分がイソパラフィンであるブチ
レン重合体と、重合度が約５０のヒドロキシル末端基を
有するブタジエンのホモポリマーとからなる群より選ば
れることを特徴とする特許請求の範囲第１７項記載の分
離方法。 - （１９）上記ゲル状物質が１より大きく１０以下の揺変
指数を有していることを特徴とする特許請求の範囲第１
５項記載の分離方法。 - （２０）上記遠心分離が１２００乃至２５００Ｇの力で
行なわれることを特徴とする特許請求の範囲第１５項記
載の分離方法。 - （２１）上記遠心分離が約５乃至１０分間行なわれるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１５項記載の分離方法
。
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|---|---|---|---|
| US88125278A | 1978-02-27 | 1978-02-27 | |
| US881252 | 1978-02-27 | ||
| US05/922,825 US4190535A (en) | 1978-02-27 | 1978-07-10 | Means for separating lymphocytes and monocytes from anticoagulated blood |
| US922825 | 1978-07-10 |
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| JP2177879A Division JPS54126718A (en) | 1978-02-27 | 1979-02-26 | Separation of platelet * limphocyte and large monocyte from anticoagulant treated blood |
Publications (2)
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|---|---|
| JPH02111374A true JPH02111374A (ja) | 1990-04-24 |
| JPH0355789B2 JPH0355789B2 (ja) | 1991-08-26 |
Family
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Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2177879A Granted JPS54126718A (en) | 1978-02-27 | 1979-02-26 | Separation of platelet * limphocyte and large monocyte from anticoagulant treated blood |
| JP1211230A Granted JPH02111374A (ja) | 1978-02-27 | 1989-08-16 | 杭凝固処理された血液から血小板、リンパ球および単核大白血球を分離する方法 |
Family Applications Before (1)
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|---|---|---|---|
| JP2177879A Granted JPS54126718A (en) | 1978-02-27 | 1979-02-26 | Separation of platelet * limphocyte and large monocyte from anticoagulant treated blood |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4190535A (ja) |
| JP (2) | JPS54126718A (ja) |
| CA (1) | CA1095477A (ja) |
| GB (1) | GB2014879B (ja) |
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