JPH0225149B2 - - Google Patents

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JPH0225149B2
JPH0225149B2 JP54021778A JP2177879A JPH0225149B2 JP H0225149 B2 JPH0225149 B2 JP H0225149B2 JP 54021778 A JP54021778 A JP 54021778A JP 2177879 A JP2177879 A JP 2177879A JP H0225149 B2 JPH0225149 B2 JP H0225149B2
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JP
Japan
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gel
lymphocytes
mononuclear
blood
platelets
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JP54021778A
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JPS54126718A (en
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Oogasuto Ruuderaa Arubaato
Odosutorukeru Jerarudo
Rarufu Jiin Junia Ansonii
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Becton Dickinson and Co
Original Assignee
Becton Dickinson and Co
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Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27128613&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JPH0225149(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
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Publication of JPS54126718A publication Critical patent/JPS54126718A/ja
Publication of JPH0225149B2 publication Critical patent/JPH0225149B2/ja
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/49—Blood
    • G01N33/491—Blood by separating the blood components

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は抗凝固処理された血液から血小板、リ
ンパ球および単核大白血球を分離する方法に関す
るものである。 人間の血液からの白血球、特にリンパ球の分離
は、組織適合性測定、特に器官移植を要する患者
の組織適合性測定にとつて臨床上必要である。免
疫閉止に必要な薬物治療のタイプおよびレベルが
問題となる場合にリンパ球作用の測定が必要とさ
れる。 通常の刺絡技術によつて採取された抗凝固処理
された人間の血液からリンパ球および単核大白血
球を分離するのに現在行なわれている方法は、一
般にはフイコール パキユー（Ficoll−Paque、
登録商標）である特殊なニユートン流動体による
血球の遠心分離を利用したものである。このフイ
コール パキユーは1.077g／c.c.の比重を有する流
動体であり、フアルマチア フアインケミカル社
（Pharmacia Fine Chemicals AB、Uppsala、
Sweden）から市販されている。この方法は下記
の４つの基本的な工程からなる。 (1) あらかじめ決められた量のフイコール パキ
ユーを試験管の底に設置する工程、 (2) そのままのあるいは希釈した血液試料を注意
深くフイコール パキユー上にピペツトで移す
工程、 (3) フイコール パキユーの比重（1.077）より
も大きな比重を有する血液成分が、フイコール
パキユー中に進むかあるいはフイコール パ
キユーを通過するように、フイコール パキユ
ー血液調製物を400乃至500Gで約30乃至40分間
遠心分離する工程、および (4) ピペツトで白血球（主としてリンパ球）をフ
イコール パキユー相から分離し取り出す工
程。 上記現在行なわれている方法はいくつかの欠点
を有している。まず第１に、最初血液試料をフイ
コール パキユー上にピペツトで移す時、白血球
がもしフイコール パキユー媒体の表面より下に
広がつた場合には、フイコール パキユーの比重
が局部的に減少し、この減少した比重はリンパ球
および単核大白血球を分離するのに不適当であ
る。第２に、遠心分離の間に血液中のより軽い相
がフイコール パキユー媒体中に取り込まれた場
合、400乃至500Gによつて生じる浮力は小さいの
で取り込まれた相はフイコール パキユーを通つ
て上昇することができない。第３に、フイコール
パキユーは水溶性であり、より大きな遠心分離
速度は血液中でのフイコール パキユーの溶解度
を増加させ、このためにフイコール パキユーの
比重が変化するので、約400乃至500Gよりも大き
な遠心力を使用することができない。第４に、遠
心分離が終つた後、ピペツトによるフイコール
パキユー媒体からの白血球の分離は、フイコール
パキユー媒体がニユートン特性を有しているの
で非常に注意深く行なわれなければならない。第
５に、この方法を行なうのには１乃至２時間を要
し、従つてより迅速な方法が強く望まれている。 本発明は抗凝固性血液からリンパ球と単核大白
血球と血小板を分離する方法に関するものであ
り、本発明の方法よれば上述のフイコール パキ
ユーを使用する方法よりも著しく迅速に該分離を
行なうことができる。ツツカー氏およびカーセン
氏はリンパ球は赤血球および顆粒白血球よりも小
さな比重を有していると報告している（Blood、
34：591、1969）。単核大白血球はリンパ球とほぼ
同じ比重を有しており、血液中にリンパ球の数の
約25％以下の量存在している。血小板は約1.025
乃至1.03g／c.c.の比重を有している。 【表】 準偏差
一般には本発明の方法は (1) 血液成分に対して化学的に不活性であり、血
小板、リンパ球および単核大白血球よりは大き
いが血液のその他の血球成分よりも小さな比重
を有する不水溶性揺変性ゲル状物質、すなわち
グリースを血液試料中に入れ、 (2) ゲル状物質−血液試料を大きな相対遠心力、
すなわち少なくとも1200G、好ましくは1400G
以上の遠心力で、ゲル状物質が重たい血球と軽
い血球の間に障壁を形成するのに充分な時間の
間遠心分離し、 (3) 上記障壁の上に静止している上記血小板、上
記リンパ球および上記単核大白血球を残して、
上記血漿を上記障壁上から除去し、 (4) 上記ゲル状物質よりも小さな比重を有し、上
記血小板、上記リンパ球および上記単核大白血
球と相和し、かつ上記ゲル状物質に対して化学
的に不活性である緩衝溶液を上記障壁の上に置
き、 (5) 上記緩衝溶液を撹拌して上記血小板、上記リ
ンパ球および上記単核大白血球を上記緩衝溶液
中に懸濁させ、その後 (6) 上記血小板、上記リンパ球および上記単核大
白血球が上記緩衝溶液中に懸濁した懸濁液を、
この懸濁液と接触している上記障壁上から除去
することからなる。その後、血球の数の測定が
行なわれる。本発明のかかる構成により、血小
板、リンパ球および単核大白血球を血液から分
離することができ、前記緩衝溶液を用いた工程
によつて前記血小板、リンパ球および単核大白
血球をさらに血液の血漿成分からも効果的に分
離することができる。 ゲル状物質、すなわちグリースの組成は、以下
のような基準が満たされる限り重要な要因ではな
い。 (a) ゲル状物質は約1.065乃至1.077g／c.c.の比重
を有していなければならない。 (b) ゲル状物質は血液中に存在する成分に関して
化学的に不活性がなければならない。 (c) 遠心分離の後血小板、リンパ球および単核大
白血球が障壁中に浸透するのを最小にするため
に、ゲル状物質は揺変性でなければならない。
すなわち、ゲル状物質は１より大きく10以下の
揺変指数を有していなければならない。 (d) ゲル状物質は、約1200乃至2500Gの遠心力を
受けた時に流動し、これによつて血小板、リン
パ球および単核大白血球と重たい血球との間に
望みの障壁を形成するのに充分な粘度を示すも
のでなければならない。 本発明の方法は従来の開口採血管および閉口採
血管のいずれによつても行なうことができる。開
口採血管が使用される場合には、ゲル状物質は一
般に遠心分離操作の直前に管の中に入れられる。
ゲル状物質はしばしば管の内壁の血液試料の水平
面よりも高い位置に置かれる。閉口採血管が使用
される場合には、ゲル状物質はゴム栓あるいはそ
の他の通常の手段によつて管が閉口される前に、
管内のいかなる場所に置かれてもよい。一般に、
ガラスあるいはプラスチツク製の採血管が使用さ
れる。 米国特許第3852194号には、分離される２つの
中間の比重を有する揺変性ゲル状物質を用いて、
血液試料中に存在するより重たい相をより軽い相
から分離する方法が開示されている。ゲル状物質
は血液試料とともに遠心分離される。この遠心分
離操作の間にゲル状物質は流動して分離される２
つの相の間に障壁を形成する。この障壁はその上
に存在する相の容易な、かつほぼ完全な除去を可
能にする。 この特許には上記方法に使用される種々のゲル
状物質、すなわちグリースが述べられている。こ
れらの物質に必須の属性として、以下の３つの基
準が述べられている。 (1) 分離される２つの相の中間の比重を有するこ
と。1.035乃至1.06g／c.c.、好ましくは1.04乃至
1.055g／c.c.の比重を有する物質が有効である。 (2) 分離される２つの相と化学反応を起さないこ
と。 (3) 静止状態において非流動性（半剛体）である
こと。 この特許には、リンパ球よび単核大白血球の分
離に関しては何も開示されておらず、また少なく
とも1200G、好ましくは1400G以上の遠心力を使
用する分離方法に関しても何も開示されていな
い。上記のような大きな遠心力は、リンパ球およ
び単核大白血球をゲル状物質−血漿界面に浮き上
がらせるのに充分な浮力を生ぜしめるのに必要と
される。 米国特許第3920549号には、上記米国特許第
3852194号の発明の変形およびその改良が述べら
れている。上記米国特許第3852194号の発明につ
いて改良がなされた点は、「エナージヤイザー」
（energizer）と称せられる固体成分を採血管に挿
入して使用することである。このエナージヤイザ
ーはゲル状物質よりも大きな比重を有している。
遠心分離操作の間に、エナージヤイザーがゲル状
物質（通常採血管の底に置かれる）に衝撃を与
え、これによつてゲル状物質が採血管の壁にそつ
て上方に移動するのを容易にする。エナージヤイ
ザーを含ませることは、各血液成分の分離を促進
させ、各血液成分のより明確な分離を可能にす
る。 この特許には比較的大きな遠心力（1100G）の
使用が述べられているが、他の血液成分からリン
パ球および単核大白血球を分離することについて
何も述べられていない。ここでもまた使用される
ゲル状物質の比重は1.035乃至1.06g／c.c.、好まし
くは1.04乃至1.055g／c.c.の範囲にあることが述べ
られている。 米国特許第3963119号には、密閉剤を採血管に
設置するための装置が述べられている。この特許
で述べられている密閉剤は、上記米国特許第
3852194号および第3920549号で述べられているゲ
ル状物質と同じタイプものであり、同じ働きをす
るものである。 この特許には1.026乃至1.092g／c.c.の比重を有
する密閉剤が述べられているが、好ましい範囲は
1.030乃至1.050g／c.c.であることが述べられてい
る。他の血液成分からのリンパ球および単核大白
血球の分離に関しては何も述べられておらず、ま
た大きな遠心力、すなわち少なくとも1200Gの遠
心力が有効であることも指摘されていない。 本発明の方法の好ましい具体例を説明する以下
の実施例において、使用されるゲル状物質、すな
わちグリースはシリコン流動体と非常に細かい疎
水性のシリカ粉末との混合物からなる。用いられ
たシリコン流動体はダウコーニング社（Dow
Corning Corporation、Midland、Michigan）
によつて製造され、ダウ コーニング社社報の
CPO−1072およびCPO−158−１（Dow Corning
Bulletins CPO−1072、March、1972 and CPO
−158−１、March、1972）に記載されているジ
メチルポリシロキサン流動体であるダウ コーニ
ング200流動体（Dow Corning 200 Fluid）であ
る。キヤボツト社（Cabot Corporation、
Boston、Massachusetts）によつて製造され、
キヤボツト社パンフレツトSGEN−１に記載され
ているシラノツクス101（Silanox 101、登録商
標）がシリカ粉末として用いられた。この物質は
熱分解法シリカの表面にトリメチル基を結合させ
て疎水性を付与したものである。しかしながら、
先に説明したように、ゲル状物質に必要な特性基
準を満たすものであるならば非シリコン揺変性ゲ
ル状物質もまた同様に使用することができる。 人間の血液を採取し、充分なEDTA抗凝固剤
が入つた７mlガラス採血管中に入れた。約1.5ml
のシリコン流動体−疎水性シリカ粉末ゲル状物質
の塊りを上記血液試料が入つた管の内壁上に置い
た。 第１図は血液試料が入つた採血管の説明図であ
る。血液試料３が採取された後、開口採血管１の
内壁の上端（開口端）にゲル状物質の塊り２が置
かれた。 血液試料は平衡状態に到達するまで約1800Gで
遠心分離された。一般に平衡状態に到達するのに
約５乃至10分を要した。第２図は遠心分離操作に
おける平衡状態に到達する前のゲル状物質−血液
試料混合物を示すものである。ゲル状物質の塊り
２は管１の下方へ移動し、血液試料３の重たい成
分と軽い成分は互いに分離し始めている。第３図
は遠心分離が平衡状態に到達した時の状態を示す
説明図である。第３図から明らかなように、ゲル
状物質の塊り２は血液試料の重たい成分および軽
い成分を互に分離している。血液の血漿成分４と
血小板、リンパ球および単核大白血球５はゲル状
物質の障壁２の上に存在し、一方顆粒白血球６お
よび赤血球７はその他の重たい成分と共に障壁２
の下に保持されている。 次に血漿成分４を除去した。この血漿成分４の
除去は血小板、リンパ球および単核大白血球５を
乱さないように注意深く行なわれた。第４図はピ
ペツト８によつて血漿成分４を除去し、障壁２上
に血小板、リンパ球および単核大白血球５を残す
様子を示すものである。 その後Ca+2、Mg+2遊離塩等張緩衝溶液９を静
かに管１のゲル状物質の障壁２上に注いだ（第５
図）。 その後管１を静かに揺り動かすかあるいは撹拌
してゲル状物質の障壁２上に静止していた血小
板、リンパ球および単核大白血球５を緩衝溶液９
中に懸濁させ、この懸濁液を管１から除去した。
第６図はデカンテーシヨンによつて懸濁液をゲル
状物質の整壁２から除去する様子を示すものであ
る。 他の血小板、リンパ球および単核大白血球分離
方法の場合と同様に、回収された血球は緩衝溶液
で洗浄され、その後数が測定された血球は種々の
生物学的薬効試験に利用された。 比重および揺動指数が異なる３種類のシリコン
流動体−SiO2粉末混合物を用いて得た実験結果
を下表に示す。 【表】 第３図に示される血球の分布の正当性が上記デ
ータによつて確かめられる。いずれの場合におい
ても、元の血液試料に比較して好中球（主な顆粒
白血球）の比率は著しく減少したがリンパ球の比
率は著しく増加した。単核大白血球の比率もまた
増加したが、増加の程度はリンパ球よりもいくぶ
ん低かつた。トリパン青染料を使用して測定され
た血球生存能力は95％以上であつた。このような
データは本発明の血液試料からリンパ球を分離す
る方法が実用性を有するものであることを明白に
示している。 上記実験は開口採血管を用いて行なわれたが、
閉口採血管を用いても同様に行なうことができ
る。閉口採血管が用いられる場合には、血液試料
は揺変性ゲル状物質と充分な量のEDTAのよう
な抗凝固剤が入つた採血管中に採取される。採取
された血液試料はその後遠心分離され、血漿が取
り除かれ、そしてリンパ球と単核大白血球が回収
される。 先に述べたように、非シリコン揺変性ゲル状物
質も使用することができる。例えば、アモコ ケ
ミカル社（Amoco Chemicals Corporation、
Chicago、Illinois）から市販されており、同社の
社報12−Ｈに主成分が高分子量モノオレフイン
（85％−98％）であり、残成分がイソパラフイン
であるブチレン重合体であると記載されている炭
化水素ゲル状物質ポリプデンＨ−100に、デグツ
サ社（Degussa、Inc、Pigments Division、
New York、New York）から市販されている
熱分解法シリカ粉末アエロシルOX50（AEROSIL
OX50）を混合してなるゲル状物質を使用した場
合には、上述のシリコン物質の場合と同様の結果
が得られる。炭化水素重合体が用いられる場合に
は、充填物質を疎水性にする必要はない。 ポリプデンＨ−100 100gとOX50シリカ充填剤
39.42gとの混合物は、比重が1.0672g／c.c.であり、
揺変指数が2.77であつた。 有用な炭化水素ゲル状物質の別な例として、ア
ルコ ケミカル社（ARCO Chemical
Company、New York、New York）から市販
されており、同社の社報1976年４月号に重合度が
約50のヒドロキシル末端基を有するブタジエンの
ホモポリマーとして記載されているポリbdR−
45HT（Poly bd Ｒ−45HT、登録商標）が挙げ
られる。この重合体についてもまた非疎水性充填
物質を使用することができる。 上記ポリbd Ｒ−45HT100gとOX50シリカ充填
剤34.33gとからなる混合物は、比重が1.065g／c.c.
であり、揺変指数が1.25であつた。 これらの炭化水素重合体−シリカ混合物は、本
発明の方法に使用されるゲル状物質に要求される
上述の特性基準を満たすものである。すなわち、
これらの炭化水素重合体−シリカ混合物は、 (a) 約1.065乃至1.077g／c.c.の比重を有し、 (b) 血液成分に対して化学的に不活性であり、 (c) １より大きく10以下の揺変指数を有してお
り、また (d) 2000G以下の遠心力で流動し、血小板、リン
パ球および単核大白血球と重たい血球との間に
望みの障壁を形成するのに充分な粘度を有して
いる。
【図面の簡単な説明】
第１図乃至第６図は本発明の方法の好ましい具
体例の概略説明図である。第１図は血液試料とゲ
ル状物質を含む開口採血管を示すものである。第
２図は遠心分離の間のゲル状物質−血液試料混合
物を示すものであり、ゲル状物質が元の位置から
血液試料中に移動しているのを示している。第３
図は遠心分離の間に平衡状態に達したゲル状物質
−血液試料混合物を示すものであり、流動したゲ
ル状物質が血小板、リンパ球、単核大白血球およ
び血漿成分とその他の重たい血液成分との間に障
壁を形成しているのを示している。第４図は血漿
成分の除去を示すものである。第５図は緩衝溶液
の添加を示すものである。第６図はリンパ球が緩
衝溶液に懸濁した懸濁液のデカンテーシヨンを示
すものである。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ (a) 血液成分に対して化学的に不活性であ
    り、1.065乃至1.077g／c.c.の比重を有する不水
    溶性揺変性ゲル状物質を抗凝固処理された血液
    試料中に入れ、 (b) 上記ゲル状物質と上記血液試料とを、少なく
    とも1200Gの力で、上記ゲル状物質が血漿、血
    小板、リンパ球および単核大白血球とより重た
    い血球との間に障壁を形成するのに充分な時間
    の間遠心分離し、 (c) 上記障壁の上に静止している上記血小板、上
    記リンパ球および上記単核大白血球を残して、
    上記血漿を上記障壁上から除去し、 (d) 上記ゲル状物質よりも小さな比重を有し、上
    記血小板、上記リンパ球および上記単核大白血
    球と相和し、かつ上記ゲル状物質に対して化学
    的に不活性である緩衝溶液を上記障壁の上に置
    き、 (e) 上記緩衝溶液を撹拌して上記血小板、上記リ
    ンパ球および上記単核大白血球を上記緩衝溶液
    中に懸濁させ、その後 (f) 上記血小板、上記リンパ球および上記単核大
    白血球が上記緩衝溶液中に懸濁した懸濁液を、
    この懸濁液と接触している上記障壁上から除去
    する ことからなる抗凝固処理された血液から血小板、
    リンパ球および単核大白血球を分離する方法。 ２ 上記ゲル状物質がシリコン流動体と疎水性シ
    リカ粉末との混合物からなることを特徴とする特
    許請求の範囲第１項記載の分離方法。 ３ 上記ゲル状物質が炭化水素重合体とシリカ粉
    末との混合物からなることを特徴とする特許請求
    の範囲第１項記載の分離方法。 ４ 上記炭化水素重合体が、主成分が高分子量モ
    ノオレフインであり、残成分がイソパラフインで
    あるブチレン重合体と、重合度が約50のヒドロキ
    シル末端基を有するブタジエンのホモポリマーと
    からなる群より選ばれることを特徴とする特許請
    求の範囲第３項記載の分離方法。 ５ 上記ゲル状物質が１より大きく10以下の揺変
    指数を有していることを特徴とする特許請求の範
    囲第１項記載の分離方法。 ６ 上記遠心分離が1200乃至2500Gの力で行なわ
    れることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
    の分離方法。 ７ 上記遠心分離が約５乃至10分間行なわれるこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の分離
    方法。 ８ 上記緩衝溶液がCa+2、Mg+2遊離塩等張溶液
    であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
    載の分離方法。
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