JPH01501088A - 放射受容体検定のために受容体プレパレーションを製造するための方法およびその方法に従ったキット修正放射受容体検定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 放射受容体検定のために受容体プレバレージョンを製造するための方法およびそ の方法に従ったキット修正放射受容体検定 この発明は生化学的分析方法の分野に関するものであり、かつ安定した（多数成 分の）放射受容体検定のための安定した受容体プレバレージョン（ｐｒｅｐａｒ ａｔｉｏｎ）を製造するための方法と、この方法により得られる放射受容体検定 、そのキットおよび前記キットまたは前記検定の用途に関するものである。

放射線免疫検定に関するのと同じ方法において、放射受容体検定の原理は、たと えば放射線免疫検定における抗体または放射受容体検定における受容体のような 対応するターゲット分子またはアクセプタ分子で、たとえばホルモン、ファルナ コン（ｐｈａ　ｒｎａｃｏｎ）　、神経伝達物質などのようなリガンド（検定の ために計画された態様で使用される）のバイオスペシフィックな（ｂ　１ｏｓｐ ｅｃ　ｉ　ｆ　ｉＣ）検出に基づいている。計画された態様で使用されるそのよ うなリガンドの放射性標識化の結果、可観測分子、すなわちトレーサが得られる が、それは非標識化リガンド、それゆえ類似するが観測不可能な分子と競合相互 作用する。

そのような測定により検査システムが得られるが、それはそのようなリガンドの 未知の濃度を測定することを可能にする。

放射線免疫検定は広く利用される型にはまった方法になっでおり、かつ現在分析 方法としてかなりの程度まで利用されているが、放射受容体検定はこの目的のた めに稀に利用されるにすぎない。

このことに対する主な理由の１つは、生物学的に活性の受容体の扱いは抗体の扱 いよりも難しいことである。型にはまった方法の必要条件は、比較的簡単な扱い （方法の簡単さ）および付随する経済的局面を別として、主に化学反応物または 生物学反応物の「安定性」である。これの意味するところは、実際の分析物質の 安定性と分析反応内でのそれの安定性である。

しかしながら、溶解すると、生物学的に活性の受容体は不安定であり、それゆえ 分析的利用を受ける直前まで凍結物体でなければならない。さらに、たとえこの 条件が簡単には満たされないにしても、受容体が使用不能にされ得るほどそれら は不安定である。そのような鋭敏な特徴が型にはまった方法としてそのような基 本的に利用不能な分析機構を使用することを不可能にすることは明瞭である。

それゆえこの発明の目的は、問題、不利な点、およびそれらに関連するリスクが あったにもかかわらず凍結などのようなこれまで必要だった方法を回避し得る一 方で容易に実施し得る簡単な型にはまった方法にそのような敏感な物質を適用す る方法を提供することである。

この目的は、請求の範囲で与えられた放射受容体検定のための準備方法と、直接 の分析的用途のためにこの方法により作り出される放射受容体検定とにより達成 される。

その目標は、すべてのまたは最大数の反応物が共通の容器中に共に存在し得て、 さらに結合（ボンディングまたはパインディング）反応の開始が１つの一ピペッ トステップで実施され、それにより、分析される材料は別としてすべての反応関 与物がたとえば試験管中で安定した形態で得られることである。この型の従来の 方法は一般に３ないし４のピペット段階を必要とし、そのためこの発明によって 可能にされた１つの方法によるそのような分析方法に関連して、（検査を実施す る速度、精度および作業経費に関連して）かなりの経済的進歩がもたらされる。

さらにこの発明は、品質損なしに周囲の温度または冷蔵庫の温度で（凍結せずに ）貯蔵され得る検査キットをもたらし、輸送のためにこれまで必要だったドライ アイスが必要でなくなるので、このことは輸送に関連して特に重要である。

安定した放射受容体検定を作り出すために後で説明される方法は、乾燥し安定し た形態の獲得をもたらす。

受容体含有細胞膜の準備は、たとえばニー・ビュルギゼール（Ｅ、Ｂｉｉｒｇｉ ｓｓｅｒ）らによる、バイオケム・バイオフィズ・レス・コミュン（Ｂｉｏｃｈ ｅｍ、Ｂｉ。

ｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、）　、１３３巻、１２０２−１２０９頁（１ ９８５年）のような文献に記載された方法に従って実施される。これは、たとえ ば血液細胞のような適当な組織材料または細胞の獲得、または細胞培養をａむ。

この後にはホモジナイゼーション、超音波処理または何か別な適当な手順が続き 、その後にはたとえば遠心分離、Ｐｊ、過などによる、細胞質（可溶性）の分離 が、より粗の粒子の分離とともに続（。結果として生しる細胞膜プレバレージョ ンはここで放射受容体検定で使用され得る。

これまで、このプレバレージョンは検定で使用する直前に準備されるか、または 冷凍保存されてこの状態で使用するときまで貯蔵された。この発明の手順が先行 技術と異なるのはこの点である。

冷凍保存の代わりに、プレバレージョンはここでは凍結乾燥、すなわち冷凍乾燥 される。しかしながら、このステップだけが所望の目的へと通じ、すなわち適当 な添加物が細胞プレバレージョンに加えられるとランダムな期間の後に使用され 得る、安定しかつ敏感さがより少ない最終生成物における、受容体の生物学的活 性の獲得（それの結合する能力またはその力の獲得）へと通じる。冷凍乾煙自体 は使用可能な、生物学的に活性の分析用生成物をもたらしはしない。

これら添加物は次の特徴を有しているべきである。

１、それらは化学的かつ生化学的に不活性でなければならず、その意味するとこ ろは、それらは検査システムの反応物ではなく、かつそれに影響を及ぼさないこ とである。

２、　それらは最小限しかまたは全く吸湿性を有していてはいけない。

３、それらはまた検定のために使用される溶剤中で、すなわち凍結乾燥された生 成物を溶解するために使用される溶剤中で溶解可能でなければならない。

４、　それらはまた、凍結乾燥物か、検査容器中でこのようにして直接凍結乾燥 されて、大きな機械的動き（郵便発送されたときの揺れ）のもとてすら容器の壁 にしっかりと接続されたままである、より容積が大きくかつ密な形態をとること を確実にすることを任意で保証しなければならない。

これら物質は糖化合物およびそれらの誘導体であり、好ましくはマニトール、グ ルコース、フルクトース、さらにはアルドースおよびケトースのような単糖であ り、同様にラクトース、サッカロースのような三糖、およびグリシンなどのよう な弱反応性アミノ酸、および／または好ましくはウシ血清アルブミンである、付 加的なアルブミン、また可溶性多糖およびたとえばゼラチンのコラーゲンである 。

具体例１：細胞膜の凍結乾燥に適する水溶液は、たとえば次のようなものを含む 。

ｍ−トリスー緩衝液　５０ｍ〜１、ｐＨ７，６−−ウシ血清アルブミン　０．５ ９６ −−ｄ−マンニトール　２％ −一安定剤　システムに応じた割合 使用される安定剤は主に液相て必要とされ、それは凍結乾燥前のかつ分析におけ るインキュベーション中のプレバレージョンの状態に関連する。わずかな吸湿性 を何する物質の場合には、凍結乾燥物において早すぎる部分的反応および／また は変性（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）の危険がある。その安定剤は、たとえばア プロチニン（ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）［トラシロール（ｔｒａｓｙｌｏｌ）１、ロ イペプチンなどのようなプロテアーゼ阻害剤、またたとえばジチオトレイトール （ＤＴＴ）などのような酸化防止剤、およびたとえばアジ化ナトリウム、チメロ サールおよびＥＤＴＡやＥＧＴＡのようなコンブレクソンのような静菌物である 。それらの用途は準備される特定の検定システムに大いに依存し、かつ各個々の 検査システムに対し評価されかつ最適化されるべきである。これの基準は、従来 の方法で既に利用されているような、生物学的活性成分の従来の安定化に対応す る。

具体例２ニ ーーリン酸塩緩衝液　５０ｍＭ、ｐＨ７，４−一ヒト血清アルブミン　０１２％ −一アジ化ナトリウム（安定剤）　０．０１％具体例３ニ ーーＨＥＰＥＳ緩衝液　２０ｍＭ、ｐＨ７，４−一ゼラチン　１％ −一グリシン　２％ −一コンブレクソンｍ　（ＥＤＴＡ）　２ｍＭ次の変異体は上の方法から得られ る。検定の簡略化は、たとえば液体反応形態における凍結乾燥物の反応のような 、１つのピペット段階の使用に基づいている。キットがいくつかの反応物からな るならば、相互凍結乾燥によりこれら反応関与物が組入れられ得る。次に乾燥し た混合物は測定されるサンプルとともに溶解され、したがって反応が始まる。有 利には、その組成物は正確な量および組成で試験管またはマイクロテストプレー トのカップ中で凍結乾燥される。

凍結乾燥の準備中は不所望のインキュベーションを回避するために、個々の成分 は反応容器へ連続的に導入され得るが、それはたとえば次の方法で行なわれる。

検定において反応する各成分は、液相で完全に混合することを回避するために検 定容器中で連続的に冷凍保存される。有利なことに、２個の反応成分間に反応し ない分離層が存在する。

そのような分離層は、たとえば具体例１に記載された溶液すなわち緩衝液物質か らなる。これらの添加はアリコート検定を含むように検査容器中で直接行なわれ 、直接的な使用のためにユーザに利用できるようにされる。当然次の凍結乾燥も またこの検査容器中で行なわれ、それは後で適当にバックされる。

相互凍結乾燥のために準備されるそのような混合物は次の部分からなる。

具体例４：　（相互凍結乾燥物定性）ニー−プラズマ細胞プレパレーション ーートレーサ物質 ｍ−ことによると標準 ｍ−ことによると安定剤および／またはモジユレーター−ことよると異なる方法 で準備される検査の視覚識別のための染料 ｍ−具体例１または具体例２に従った凍結乾燥媒体モジュレータはリガンドの受 容体への結合特性に影響を及はし、そのため適当な物質が各検定のために選択さ れる。

したがって、たとえばアミロライド（ａｍｉｌｏｒｉｄｅ）のような物質はウシ 副腎皮質からのプラズマ細胞受容体に対するＡＮＦの結合親和力を改良する（文 献、ニー・デリーン（Ａ、Ｄｅ　ｌ　ｅａｎ）　、Ｌｉ　ｆ、ｓ　ｅ　ｉ、　３ ９．１１０９−１１１６．１９８６）。

具体例５：　（相互凍結乾燥定性）ニ ー−ウシ副腎皮質からのプラズマ細胞１０ｍｇ／検査生−−トレーサど要素１２ ５で標識化したＡＮＦ、ＡＮＰ（心房性ナトリウム排泄増加因子、心房性ナトリ ウム排泄増加ペプチド）：２０，０００ｃｐｍ０−一標準ＡＮＦ　（希釈液のシ リーズ、たとえば９６カツプ中１６カツプのマイクロテストプレートのような検 査キットの一部においてのみ）。

ｍ−フエナントロリン（安定剤）：１ｍＭ−一標準シリーズを標工化するための 染料：エバンズ・ブルー（Ｅｖａｎｓ　Ｂｌｕｅ）（所望の強度に応じた濃度） 。

個々の成分は好ましくは凍結乾燥媒体（５０ｍＭｈリスー緩衝液、ｐＨ７，６， ０，５％　ＢＳＡ、２％マンニトール）中で溶解され、上で説明された態様で連 続的に冷凍される。

凍結乾燥は公知の方法に従って実施され、その一方で冷凍された成分が簡単には 液化すらされ得ないこと、凍結乾燥が完全で、残留水分が全く残らないこと、お よび検査容器、試験管、マイクロテストプレートは凍結乾燥剤から除かれるとす ぐに水分の侵入に対し封止され、好ましくは検査容器は窒素またはアルゴンのよ うな乾燥性不活性ガスで充満されることを保証する。

この発明の方法に従って準備される放射受容体検定は次の基本的な組成を特徴と する。受容体含有細胞膜プレバレージョンは凍結乾燥された形態で存在し、先に 添加された担体物質（添加物）は検定緩衝液における再構成に続いてかつ機械的 動き（撹拌など）がなければ、乾燥した混合物か直ちに均一溶液へと変化するこ とを保証する。凍結乾燥は比較的容積の大きい材料を特徴とし、それは専門家に よって典型的な凍結乾燥物であると認められ得る。

凍結乾燥された膜プレバレージョンは単独の反応物としても、また他の反応物と の相互凍結乾燥物としても存在し得る。検定キットにおいては、凍結乾燥された 膜プレバレージョンは１個の容器中にあっちでよいし、また検査容器中に既に配 分されていてもよい。

この方法は試験管中で検査を実施するのに適しているのみならず、理想的なこと に、高い程度のオートメーションを可能にするマイクロテストプレートの使用に も適している。

市場で入手可能な検定キットは、たとえば各場合に９６検定の１個以上のマイク ロテストプレートを含み、それらは水分の浸透に対し適当な粘着フィルムにより 封止される。

マイクロテストプレート（平坦な品目）の幾何学的配置の結果、そのようなキッ トは郵送により難なく配送され得る。

冷却剤（ドライアイス）を利用する、これまで必要だった複雑かつ高価な発送手 順も必要でなくなる。

国際調査報告 国際調査報告

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．糖および／またはアミノ酸および／または蛋白質の添加に伴なって細胞膜プ レパレーションが凍結乾燥されることを特徴とする、生物学的に活性の受容体材 料から受容体プレパレーションを作るための方法。
2. ２．０．１ないし１０％ｗｔ／ｖｏｌのマンニトール、０．１ないし１．０％ｗ ｔ／ｖｏｌのウシまたはヒト血清アルブミンとの細胞膜プレパレーションの凍結 乾燥される水性混合物を特徴とする、請求の範囲第１項に記載の方法。
3. ３．０．１ないし１０％ｗｔ／ｖｏｌのグリシンおよび０．１ないし１．０％ｗ ｔ／ｖｏｌのウシまたはヒト血清アルブミンとの細胞膜プレパレーションの凍結 乾燥される水性混合物を特徴とする、請求の範囲第１項に記載の方法。
4. ４．付加的反応物が利用可能検定を得るために相互凍結乾燥されることを特徴と する、請求の範囲第１項に記載の方法。
5. ５．付加的反応物が検定システムのトレーサ物質および／まだは比較標準物質で あることを特徴とする、請求の範囲第４項に記載の方法。
6. ６．安定剤および／またはモジュレータもまた相互凍結乾燥されることを特徴と する、請求の範囲第４項または第５項に記載の方法。
7. ７．プレパレーションが最終消費者に適する検査容器中で凍結乾燥されることを 特徴とする、請求の範囲第１項ないし第６項のいずれかに記載の方法。
8. ８．検査容器が試験管かまたはマイクロテストプレートの検査カップであること を特徴とする、請求の範囲第７項に記載の方法。
9. ９．糖化合物および／またはアミノ酸および／または蛋白質とともに細胞膜を含 む、請求範囲第１項の方法に従って準備される、受容体プレパレーション。
10. １０．糖化合物および／またはアミノ酸および／または蛋白質ばかりでなく、ト レーサ物質および比較標準物質とともに細胞膜の相互凍結乾燥物を含む、請求の 範囲第１項および第４項に従って準備される、放射受容体検定。
11. １１．安定剤および／またはモジュレータがまた含まれることを特徴とする、請 求の範囲第１０項に記載の放射受容体検定。
12. １２．１検査あたりの細胞膜の生物学的開始材料２ないし５０ｍｇと、トレーサ 、すなわちヨウ素１２５で標識化されたＡＮＦ、ＡＮＰ（心房性ナトリウム排泄 増加因子、心房性ナトリウム排泄増加ペプチド）２０，０００ｃｐｍと、標準Ａ ＮＦ（希釈液のシリーズ、たとえば９６カップ中１６カップのマイクロテストプ レートのような検査キットの一部においてのみ）と、フェナントロリン（安定剤 ）１ｍＭと、標準シリーズを標識化するための染料、すなわちエバンス・ブルー （Ｅｖａｎｓ　Ｂｌｕｅ）（所望の強度に応じた濃度）とを含有する凍結乾燥物 を特徴とする、請求の範囲第１０項および第１１項に記載の放射受容体検定。
13. １３．糖化合物および／またはアミノ酸および／または蛋白質およびトレーサ物 質ならびに比較標準物質とともに細胞膜の相互凍結乾燥物を含有し、一方で安定 剤および／またはモジュレータがまたそこに含有される複数個の検査容器を特徴 とする、請求の範囲第１０項に従った放射受容体検定を使用する放射受容体検定 キット。
14. １４．検査容器が試験管であることを特徴とする、請求の範囲第１３項に記載の キット。
15. １５．検査容器がマイクロテストプレートのカップであることを特徴とする、請 求の範囲第１３項に記載のキット。
16. １６．生物学的活性物質の定量分析または定性分析のための、請求の範囲第１３ 項に記載のキットの用途。