JPS62299764A - 補体価測定試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の目的］ （産業上の利用分野） 本発明は、試料中の補体価を定量分析するための補体価
測定試薬に関する。

（従来の技術） 補体とは、新鮮な正常血清中に含まれている物質であり
、抗原と抗体との結合物に非特異的に結合する（補体結
合反応）性質を有している。そして、その主体活性によ
って異なる抗原抗体結合物に補体が定量的に結合するこ
とから、この補体結合反応は溶血反応を目印として抗原
および抗体の定量に用いられている。

この補体を定量する単位（補体価）としては、Ｍａｙｅ
ｒ法による単位（ＣＨ２Ｏ）が一般に用いられている。

このＩ　ＣＨｓｏとは、至適濃度の溶血素で感作された
ヒツジ赤血球５Ｘ１０”個の５０％を７．５ｍｌの反応
系の中で、３７℃、６０分間で溶血させるのに必要な量
と定義されている。実際に試料中の補体価を定量するに
は、従来は至適６度の溶血素で感作されたヒツジ赤血球
と試料とを至適条件下で反応させて、これより得られる
溶血の程度を比色によって測定していた。

一方、本発明者らが先に出願した特開昭６０−１１７１
５９号公報では、試料中の抗原または抗体を分析するた
めのリボソームを用いてなる試薬が開示されている。

（発明が解決しようとする問題点） しかしながらこのようなヒツジ赤血球を用いた補体価の
測定では、ヒツジ赤血球が冷蔵保存で釆 も１ケ月の寿命しかなく、また、末溶血の赤血球を反応
終了後、遠心操作で除去する必要があり、測定操作の簡
便化、自動化を妨げる要因となっていた。

また前記公報に記載されたリボソームには、親水性の抗
原あるいは抗体が固定化されている。これより試料液中
の抗体または抗原を精度良く容易に定量することはでき
るが、しかしながらこれを用いて補体価を測定するため
には、あらかじめリボソーム上に固定した抗原又は抗体
にそれと対応する抗体または抗原を反応させ、そこへさ
らに被検物質である補体を作用させてリボソームを破壊
し、これより中の封入物質を流出させなければならない
。よって、このような免疫分析用試薬を用いた補体価の
測定では測定感度の低下およびＳ／Ｎ比の減少等が生起
し、補体価を精度良く広範囲にわたって容易に測定する
ことはなし得なかった。

（発明の目的） 以上のような問題点から、本発明は広範囲にわたる濃度
の補体価を簡便に精度良く測定できかつ長期保存に耐え
る補体価測定試薬を提供することを目的とする。

［発明の概要］ （問題を解決するための手段） 本発明者らは、ピリジル基を有するリボソームが補体に
よって一定に崩壊することを新たに見出して、本発明を
完成するに至った。

すなわち本発明は、 リン脂質及び糖脂質の少なくとも一方とピリジル基含有
化学物質とを主要構成成分とするリボソームと、 前記リボソーム中に封入された親水性の標識物質とから
なることを特徴とする補体価測定試薬である。

本発明の補体（ｆＥＤ１定用試薬用試薬るリボソームは
、リン脂質及び糖脂質の少なくとも一方とピリジル基含
有化学物質とから構成されているが、抗原または抗体は
固定化されていない。またこれらの物質の構成比の範囲
としては（リン脂質又は糖脂質）：（ピリジル基含有化
学物質）がモル％でそれぞれ８０〜１２０：１〜２０で
あることが望ましい。これは、この範囲をはずれた場合
に、リボソームが形成できなかったり、形成しても不安
定で試薬として供給できなくなるからである。さらにリ
ボソームの安定性を増すためにリン脂質又は糖脂質８０
〜１２０モル％に対してコレステロールを８０〜１２０
モル％程度含有させることが好ましい。また本発明に係
るリボソームを調整するのに、脂質とピリジル基含有化
学物質とを混合して調製する他に、あらかじめ脂質だけ
でリボソームを調製し、これにピリジル基を修飾させて
、そのリボソームを構成する成分中にピリジル基が修飾
されてなるピリジル基含有化学物質を作っても良い。ま
た、用いるリン脂質中の脂肪酸残基は、リジル基含有化
学物質とは、ニコチン酸、ニコチンアミド、２−ヒドロ
キシピリミジン、２２’　　−ジピリジルジスルフィド
、ＪＮ−サクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プ
ロピオネート、ニコチン酸ベンジルエステル等があげら
れるが、特にジパルミトイルフォスフ７チジルエタノー
ルアε ミン（Ｄ　Ｐ　Ｐ　ｔｉｔ）にピリジル基を付与したす
なわちリン脂質にピリジル基を付与してなるＤＰＰＥ−
ＤＴＰ　（ＤＰＰＥ−ジチオビリジネート）か最適であ
る。このようなピリジル基を付与してなるリン脂質を用
いた場合は、これをリン脂質及びピリジル基含有化合物
質を兼ねるものとし、これだけでもリボソームが形成さ
れるが、この時さらにピリジル基が付与されていないリ
ン脂質または糖脂質を加えることは、より安定なリボソ
ームを形成することからも好ましい。

またリボソーム内に封入される標識物質は親水性であっ
て、リボソーム外に溶出された際に定量可能な物質でな
ければならない。かかる物質としては、例えばカルボキ
シフルオレセイン（ＣＦ）やカルセインのような蛍光物
質、キシレノールオレンジ（Ｘ　Ｏ）やメチルチモール
ブルー（ＭＴＢ）や、５−Ｂｒ−ＰＳＡＡ　（水溶性４
−（５−ブロモ−２−ピリジルアゾ）−１，３−ジアミ
ノベンゼン）などの吸光物質、グルコースオキシダーゼ
やアルカリフォスファターゼなどの酵素、グルコースや
尿素などの基質、などが望ましい。これらの物質は検出
方法、感度及びリボソームの安定性等の因子を考慮した
上で、適宜選択される。

（作用） 本発明の補体価測定試薬は、リボソームのピリジル基と
被検物質である補体との相互作用によってリボソームが
崩壊し、これより内部に封入されていた標識物質が流出
する。よって、この標識物質の流出量を測定することか
ら、試料の補体価を決定することができる。

（実施例） 以下、実施例により本発明の詳細な説明する。

実施例１ モルモット血清の補体価測定を次のようにして行なった
。

まず補体価測定試薬の調製をした。この調製で用いたＤ
ＰＰＥ、ＤＰＰＣ（シバミルドイルフォスフ７チジルコ
リン）、コレステロールはすべてシグマ社製のものを用
いた。またピリジル基を付与するためのＮ−サクシンイ
ミジル３−（２−ピリジルチジチオ）プロピオネート（
ＳＰＤＰ）は、ファルマシア社製のものを用いた。その
他は、市販品（特級）を精製せずに使用した。そして以
下のようにしてリボソームの調製を行なった。

（ａ）ＤＰＰＥ−ＤＴＰの調製 密栓付三角フラスコに７０ｍｇのＤＰＰＥを分取し、２
５ｍ１のクロロホルム／メタノール（５：　１）溶液に
溶解し、６０μ２のトリエタノールアミン及び５０■の
Ｓ　ＰＤＰを添加後窒素置換した。室温で１時間反応さ
せた後、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去した。

乾燥物を５　ｍｌのクロロホルム　メタノール（１０：
ｌ）に溶解させ、シリカゲルカラムを用いて精製した。

生成物面分を回収し、エバポレーターで約５　ｍｌまで
濃縮した。

収率は８０〜９５％であった。保存は窒素封入下使用す
る脂質はすべてクロロホルムまたはクロロホルム／メタ
ノール（２／１）に溶解した。まず５ｍＭ　　ＤＰＰＣ
（２００μｌ）、１０ｍＭ：）レスチロール（１００μ
ｍ）及び先に調製した１ｍＭ　　ＤＰＰＥ−ＤＴＰ　（
５０μｆ）を１０ｍ１のナス型フラスコに入れ、更に２
　ｍｌのクロロホルム兎 を加えて良く混合した。水溶中（約５０℃）でロータリ
ーエバポレーターにより溶媒を除去した。

再び２　ｍｌのクロロホルムを添加し、十分撹拌後、再
度ロータリーエバポレーターにより溶媒を蒸発させた。

この操作を数回繰り返すと、フラスコ壁面に薄膜が形成
された。フラスコをデシケータ−中に移し、真空ポンプ
で約１時間吸引し、溶媒を完全に除去した。次に、１０
０μでの０．２Ｍ　ＣＦ（クーストマン・コダック社製
：ｐＨ７，４）を添加し、フラスコ内部を窒素で置換し
た後に密栓し已后 て、６０℃程度の水着中に約１分間浸漬した。続いて、
Ｖｏｒｔｅｘミキサーを用い、壁面の脂質薄膜が完全に
消失するまでフラスコを激しく振とうした。この操作に
より、ＣＦが封入されたリボソームの懸濁液が調製され
た。これにゼラチンベロナール緩衝液（ＧＶＢ　　）を
少量添加して、この懸濁液を完全に遠心チューブに移し
た。そして４℃、１５．ＱＯＯｒ　ｐ　ｍて２０分間遠
心する操作を数回′繰り返して、余分なＣＦを洗浄した
。最後に２ｍｌのＧＶＢ−及び５μ２の１０％ＮａＮ３
を加え、Ｖｏｒｔｅｘミキサーで懸濁させ、窒素封入し
て本発明に係る補体価測定試薬を得た。これを４℃で冷
蔵庫に保存した。

次に、以上のようにして調製した補体価測定試薬を用い
て、モルモット血清の補体価の測定を行なった。

まず、この補体価測定試薬をＧＶＢ　　（ＧＶＢ２００
ｍｌに０．０３Ｍ　Ｃａ　Ｃ！！　２と　０．１Ｍ〜１
ｇＣ１２とを各１ｍｌずつ添加したもの）でＱ、００５
重量％の濃度になるように希釈した。次いで、補体価既
知のモルモット血清を適宜希釈して２５μλずつＵ型マ
イクロプレート（９６穴：ヌンク社製）のウェルに注入
した。そして、前記のように希釈した試薬を５μ！ずつ
分注し、３７°Ｃで１時間反応させた。反応後、各ウェ
ルに１００μ２の０，０１ＭＥＴＤＡ−ベロナール緩衝
液を加えて反応を停止させ、プレート用螢光分光光度計
（コロナ電気社製、Ｍ　Ｔ　Ｐ　−３２型）で各ウェル
の螢光を励起４９０ｎｍ、螢光５２０　ｎｍにて測定し
た。このようにして作成した検量線を第１図に示す。

尚、測定値の相対強度１００％とは、モルモット血清の
代りに脱イオン水２５μ乏に試薬５μ！を添加してすべ
ての標識物質が流出したときの値である。またこの第１
図では、試薬のバックグランドの影響を除去するため、
すべての測定値からモルモット血清の代りにＧＶＢ＋２
５μｌに試薬５μβを添加したときの値をひいて表示し
た。

第１図からも明らかなように、本実施例の補体価測定試
薬によれば、０．５〜３０ＣＨ５ｏの範囲で補体価が測
定できることが示された。また、この検量線により、未
知の補体価のモルモット血清の補体価を測定したところ
、ヒツジ赤血球を用いたＭａｙｅｒ法（従来法）と非常
によい一致を示した。この結果を第１表に示す。

第１表 一方、試薬としての保存安定性をヒツジ赤血球を使用し
た従来の補体［１１定試薬と比較したところ、本発明の
補体価測定試薬の方が３倍以上の期間の保存安定性が得
られた。

実施例２ 実施例１と同様にしてＣＦの代りに０．１Ｍの５覧 −Ｂｒ−ＰＳＡＡを封入したリボソームを調整して補体
価測定試薬とした。

こうして得た補体価測定試薬を用いヒト血清を試料とし
て、検量線を得るための測定を行なった。すなわち実施
例１と同様にウェル中で試薬５μ！と既知補体価血清２
５μ乏を反応させた後、ＧＶＢ−に溶解した０、ＯＩＭ
Ｆ　ｅ　Ｓ　Ｏａ　　１５　ＩＩ　ｊ！と［１，０１Ｍ
Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａベロナール緩衝液１００μＰとを添加し
て反応を停止させた。そしてプレート用分光器（ＭＴＰ
−３２型）で５５０　ｎｍにて測定した。このようにし
て得た検量線を第２図に示す。

これより２〜４０ＣＨ５ｏの範囲で補体価が測定できる
ことか示された。この検量線により、未知のヒト血清中
の補体価を測定したところ、従来法とよく一致した。こ
の結果を第２表に示す。

第２表 また保存安定性も実施例１と同様に良好であった。

実施例３ 実施例１と同様のモルモット血清の測定を次のようにし
て行なった。

まず補体価測定試薬の調製を行なった。この調製で用い
た試薬は実施例１と同じものを用いた。

そして以下のようにしてリボソームの調製を行なった。

（ａ）ピリジル基付与コレステロールの調製ＩＭのニコ
チン酸１０ｍ１及び３　Ｍの塩化チオニル１０ｍ１を５
０℃にて加熱し反応させた。こうして生成したＩＭ酸塩
化物５ｍｌ及びＩ　Ｍコレステロール５　ｍｌをＩＭの
ピリジン５　ｍｌを添加したジエチルエーテル５０ｍ１
中で反応させた。このようにして５！ｌ製したピリジル
基付与コレステロールをリボソームの調製に用いた。

（ｂ）　リボソームの調製 使用する脂質はすべてクロロホルム／メタノール（２／
１）ｌこ溶角琴しｔコ。まず５ｍＭＤＰＰＣ（２００μ
ρ）と１０ｍＭピリジル基付与コレスチロール（１００
μρ）を１０ｍ１ナシ型フラスコに入れ、更に２ｍｌの
クロロホルムを加えて混合した。以下実施例１の（ｂ）
リボソームの調製法と同様にしてＣＦの封入されたリボ
ソーム懸濁液を調製して、これを補体価測定試薬とした
。

次に、以上のようにして調製した補体価測定試薬を用い
て実施例１と同様にして検量線をとり未知の補体価のモ
ルモット血清の補体篩を測定したところ、１〜４０ＣＨ
５ｏの範囲で検量線が得られた。また第３表に示したご
とく、その測定値は従来法とよく一致した値を示した。

第３表 ［発明の効果］ 本発明によれば、広い範囲にわたって測定感度が良好で
、かつ保存安定性のよい補体価測定用試薬を得ることが
できる。

【図面の簡単な説明】

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）リン脂質及び糖脂質の少なくとも一方とピリジル
   基含有化学物質とを主要構成成分とするリボソームと、 前記リボソーム中に封入された親水性の標識物質とから
   なることを特徴とする補体価測定試薬。
2. （２）コレステロールを含有したリボソームであること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の補体価測定試
   薬。
3. （３）ピリジル基含有化学物質としてピリジル基を付与
   したリン脂質を用いたことを特徴とする特許請求の範囲
   第１項記載の補体価測定試薬。
4. （４）吸光物質、螢光物質及び酸素基質の中から選ばれ
   た標識物質であることを特徴とする特許請求の範囲第１
   項、第２項もしくは第３項のいずれかに記載の補体価測
   定試薬。