JPH01500369A - 細胞検出システム及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、吸収された溶液中の細胞と膜表面との接触を可能にする、調節された 毛管現象を有する膜構造に関する。この接触は、その膜表面上の親和性領域への 細胞の効果的な結合を可能にする。よシ詳しくは、本発明は、微孔性膜及び支持 体への血液細胞の免疫特異的な結合に基づいて、血液の里を検出するシステム及 び方法に関する。

発明の背景 細胞の親和性表面検出は、その表面上の特異的な結合領域への細胞の効果的な結 合を必要とする。細胞上の親和性領域、たとえば抗原性領域に対して特異的な抗 体は長く知られて来た。しかしながら、親和性表面による検出は、重大な機械的 問題、すなわち親和性領域と細胞（溶液中に比較的低い濃度で存在する）との間 の急速な効果的結合の困難性を有する。検出されるべき細胞がこわれやすい、た とえば赤血球細胞（ＲＢＣ）である場合、その問題はさらに　・一層重大である 。ＲＢＣが破壊するような接触又は条件である場合、その検出は非特異的な着色 のために不可能である。他の細胞に関してさえ、溶液中におけるＲＢＣの溶解が しばしば検出装置をひじょうに着色するので、そのアッセイを非機能的にする。

従って、細胞を溶解するための十分な力又は細胞損傷を引き起こす条件を伴わな いで、溶液中における細胞を検出する能力は、検出技術に相当な改良点を提供す る。大き過ぎる接触力に関するもう１つの問題は、非特異的な結合である。従っ て、たとえ細胞が溶解しなくても、その結合は、極端に強い毛管現象が存在する 場合、非特異的である。

血液細胞の検出 検出装置の１つの共通する設定は、血液のをを決定するように適合されている。

受容者が供与者の血液に対して高い免疫学的応答を持たないことを確保するため に、それらの２種の血液塑を合わせることが、供与者から受容者に血液を供給す ることにおいて必須である。受容者が供与者の血液細胞の表面抗原に対する抗体 を有し、又は抗体を増殖することができる場合、そのような応答が起こシ得る。

血液適合性の目的のための最っとも重要な細胞抗原はＡ及びＢ抗原であシ、これ らはヒトの間で４種の主要細胞塑：０型（抗原を持たない）、Ａｆｉ（Ａ抗原） 、ＢＷ（Ｂ抗原）及びＡＢ（両抗原）の基礎を形成する。それぞれの細胞型の個 体の血清は通常、その個体の血液細胞上に存在しないＡ及び／又はＢ抗原に対し て向けられた抗体を含む。すなわち、０世の個体は抗−Ａ及び抗−Ｂ抗体の両者 を有し、Ｂ型の個体は抗−Ａ抗体のみを有し、そして同様である。所望としない 免疫応答を避けるためには、供与者の血液細胞がＡ又はＢ抗原（受容体がその対 応する抗体を有するために）のいづれかを含ま々いことが必要とされる。

同様にもう１つの重要な抗原基は、赤血球細胞上のＤ抗原に関係するＲｈ基であ る。赤血球細胞がＤ抗原基を欠＜Ｒｈ（−）の個体がＲｈ（＋）供与者からの血 液を与えられる場合、特にＲｈ（＋）血液の後での輸血が与えられる場合、外来 性抗原に対する免疫応答は、その外来性細胞と反応することができる抗−り抗体 を導ひく。

いくつかの他の抗原基、たとえばヒト白血球抗原（ＨＬＡ　）に対する抗体がま た、このシステムを用いて決定することができる。これは二次血液抗原基のだめ の交差適合法であシ、そしてそれは、個体が慢性の輸血又はそのような二次抗原 への他の連続した畢露を受ける場合にのみ、適切である。

通常の血液銀行操作において、供与血液は、Ａ。

Ｂ、及びＲｈｆｉについて及び選択された二次抗原について初めに２．クリーン される。主な血液型のための細胞検出法は、細胞凝集反応法によってほとんど行 なわれ、ここで供与血液細胞は、試薬抗−Ａ及び抗−Ｂ抗体と共にインキュベー トされ、Ａ及び／又は３表面抗原の存在を決定される。凝集反応パターンに依存 して、血液はＯ，Ａ、Ｂ又はＡＢとして塁を検出され得る。類似する凝集反応試 験を用いて、Ｒｈ因子について試験、することができる。血液型は、定義された 血液群の試薬の赤血球細胞を凝集せしめる、抗原を抗体を欠く供与血清の能力を 示すことによって確かめられ得る。

血液型の検出に通常使用される凝集反応試験法は、その試験法においていくつか のタイプの技術的な誤シ及び書き誤シを受けやすい。専門家は、アッセイ混合物 に誤りだ試薬又は血液サンプルをうつかシして添加するであろうし、又は凝集反 応結果を読み違えるであろう。書き誤シは、適切な血液容器への血液凝集反応結 果を与す際に起こる。これらのタイプの技術的な誤シ及び書き誤シは、血液銀行 において普通であるが、数百のサンプルが１日に処理される場合、特に避けるの に困難である。

そのような誤シの可能性、及び正しく組合わされた供与体及び受容体の血液型の 重要性のために、本発明の血液供与システムは、主な血液型を確めるために多く のバックアップ検査を含む。すでに示したように、初期の血液型の検出は、供与 細胞の凝集反応、及び既知タイプの試薬細胞の血清凝集反応によるその血液型の 確認を含む。血液が血液銀行を離れる前、主な血液型の群（０，Ａ、Ｂ、ＡＢ、 及びＲｈ）が、初めのアッセイをくシ返すことによって確かめられる。その主な 血液群は、供与血液が病院又は診療所によって受け取られる際、再び検査される 。正しい供与血液型を確めるために必要とされる二重検査は、比較的費用が高く 、そして血液を供給する血液銀行及び血液を受ける両者にとって時間がかかシ過 ぎる。

細胞壓の特異的抗体によシ被覆された固体表面に結合する免疫特異性細胞に依存 する細胞型検出法がまた、提案されて来た。１つの方法においては、血液細胞が まず、加水分解酵素によシ消化され、表面に結合されている抗体への細胞結合を 妨げる表面の群が除去される。その酵素処理された細胞を洗浄し、希釈し、選択 された抗−血液群抗体によシ被覆されたマイクロ力価ウェルに添加し、そしてそ のマイクロ力価グレートを遠心分離し、それぞれのウェルにおいて抗体によシ被 覆された表面に対して細胞を向ける。陽性反応は、ウェル表面の被覆された部分 上に単層の細胞を生成し、そして陰性反応は、ウェルの底で分離した細胞ペレッ トを生成する。単層細胞の存在は、ペレット化された細胞の領域の外のウェル中 の単層領域を通して４０５ｎｍで単色光線の吸収度を読むことによって確立され る。（５ｉｎｏｒｔＬ、Ｔ、ｅなど、、　Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ（１９８５） 　２５　：　２１　］。

もう１つの固相法がアメリカ特許第４，２７５，０５３号に開示される。この方 法に使用される固相支持体は、選択された細胞表面抗原盤を有する細胞を支持マ トリックスに裏返し付着せしめ、次にその付着された細胞に抗原特異性抗体を結 合することによって調製される。選択された表面抗原を有する血液サンプルの存 在において、抗体は、サンプル中の懸濁された細胞を結合し、標準の計測法、た とえば濃度走査法によって検出される分析物細胞の単層を形成する。

ヨーロッパ特許出願第８４１０６８４４号（公告番号筒１３０．４３４号）は、 血液群の抗原に対して特異的な、固体ラッカーフィルムにおけるモノクローナル 抗体の使用を開示する。血液型を検出する他の特許又は出版物は、次のものであ る：　ＵＳＰ　２，７７０，５７２　：ＵＳＰ　４，２００，６９０　；　ＵＳ Ｐ　４，２４６，３３９　：及びＵＳＰ４．４０７，９４３；　ＰＣＴ　ＷＯ３ ５１０１３５４；及びヨーロッパ特許出願第８１１０８００９号（公告筒５１， ７４８号）。

血液型を検出するためにこれまで使用されて来た多くの方法は、血液細胞のペレ ット化及び血液細胞と抗体との接触を促進するために遠心分離の使用を必要とし た。そのような段階は、複雑な遠心分離装置を必要とし、そしてさらに、血液型 の検出過程の間に生じる誤りの可能性を高める。さらに、そのような血液型の検 定法は手間がかかシ、そして、血液型を決定するための相当な技術的練習を必要 とする。

固相血液型検出法は、固体表面上での単層の細胞の弱い色素反応のために、制限 された信頼性を有する。また、その単層の細胞は機器分析のために適切な脱水形 で便利に保存され得ないので、元の血液群の型の検出を確かめるための方法は、 単にそのアッセイを再び起なうことである。本発明は、弱い色素反応、容易な使 用及び便利な保存の問題を、親水性マトリックス中に水性相を吸上げ、それによ って暴露された抗体と赤血球細胞とを効果的に接触せしめる、水透過性非細胞破 裂性膜を用いる乾燥又は乾燥に近い膜構造を使用することによって解決する。

発明の要約 膜構造体上の親和性領域と細胞との効果的な接触によって、溶液中における細胞 の検出に使用するために調節された毛管現象を有する膜構造体を調製するための 新規方法が記載されている。その膜表面は、その内部への細胞の浸入を許さない 。

この方法の１つの用途は、技術的誤シ又は書き誤シの可能性及びそれによって、 血液型の複数検査の必要性を大まかに除去する血液型検出システムを提供する。

この血液型検出システムは、血液細胞を含む液体と接触される場合、血液細胞と 膜に結合されたタイプ特異性抗体との間の堅い接触を引き起こす湿潤性の水透過 性マトリックス中にその液体を吸上げる乾燥膜構造体を含んで成る。この乾燥膜 構造体は、調節された毛管現象又は吸収作用によって、水性相の材料を膜中に正 確に吸い取シ又は吸い上げ、それによって、細胞を破壊しないで又は細胞を非特 異的にトラッピングしないで、その細胞と特異的な抗体とを効果的に接触せしめ る、水透過性吸上げ材料と一緒に膜表面を提供する。

図面の簡単な説明 第１図は、固体支持体（１０）、微孔性で水透過性非細胞破壊性膜表面、及び該 膜表面（１２）、任意のスペーサー（１４）及び温特異性抗体（１６）と関連す る調節された毛管現象を有するように処理された内部領域を含むインジケーター 膜支持性構造体を例示する。

第２図は、赤血球細胞を含む水性液体との接触の後、膜−表面−内部ｍ＜　１２ 　）が液体を吸収し、そして赤血球細胞（１８）が特異的な凰の抗体（１６）に 結合している、第１図のインジケーターを例示する。

第３８及び第３ｂ図は、Ａ、Ｂ又はＤ塑（又はＤｕ）の血液抗原及び陽性及び陰 性対照に対する特異的抗体を担持する膜領域を含む血液凰検出スティックを例示 する。

第４図は、Ａ、Ｂ、Ｄｇ（又はＤｕ）及び対照領域Ｃ＋　（抗−ＲＢＣを含む） 並びに中性ポリマーを含む領域Ｃ−に対する特異的抗体を担持する膜−表面−内 部領域を含む血液バッグのタッグを例示する。

第５図は、Ａ　、　Ｂ　、　Ｄ　（又ハＤｕ）、対照領域Ｃ＋（抗−ＲＢＣを含 む）及び非−ＲＢＣ結合阻止ポリマーを含む対照領域Ｃ−に対する抗体を担持す る色をコードされた膜領域を含む血液型検出スティックを例示する。

発明の特定の記載 調節された毛管現象を有する乾燥又はほぼ乾燥状態の膜検出器システムが、血液 型の検出のためにその膜システムを適合する例と供に記載される。ヒトのＡＢＯ 型及びＲｈｆｉを決定するためにそのような血液凰検出システムを使用する方法 が例示される。

１、調節された毛管現象 膜検出器装置は、正しい機能のために調節された毛管現象を必要とする。吸着性 の多孔性材料が、２段階の過程を通して、調節された毛管現象を有する材料を生 成するために変性される。その第１段階は、適度な親水性特徴を示す、すなわち 中ぐらいの速度で液体を吸収するであろう基礎膜を選択することである。第２段 階は、その基礎膜材料の毛管作用を効果的に制御する化学薬剤によるその膜の被 覆である。

そのような被覆剤の１つの例として、その基礎膜をわずかに疎水性にし、それに よって毛管現象を調節するポリマーを挙げることができる。そのような特性を有 する多くのポリマーが被覆材料として使用するために予期されるが、タンノクク 質、たとえば血清アルブミン、又は有機ポリマー、たとえばポリ塩化ビニル（ｐ ｖｃ　）及びポリビニルピロリジン（ｐｖｐ　）が好ましい。これらの被覆材料 は水に溶解され、そして多孔性吸着材料の調節された毛管現象をもたらすのに十 分な濃度で適用される。その被覆溶液の容量は、過剰の乾燥、固化、被膜又は毛 管作用による液体の多孔性材料への一定の吸収又は吸上げの妨害を伴わないで、 その吸着性膜材料じゅうへのポリマー、塩及び界面活性剤の均一の分配を引き起 こすのに十分であるべきでおる。

ポリマーの他に、被覆溶液は塩及び界面活性剤を含む。その塩濃度は、等侵食塩 水の濃度と同じか又はわずかに低くあるべきである。それは、ひじように急速な 水の取シ込みによって細胞膜の破裂を引き起こさないであろうナトリウム、カリ ウム、カルシウム又は他の塩であシ得る。膜の水和化に基づいて、水がその膜中 に取シ込まれ又は吸上げられ、その膜体積内にほぼ等張の環境をもたらす。

界面活性剤は、局部領域における塩又は溶解された材料の有害な付着を伴わない で、膜表面及び多孔性内部の一定の被覆を促進するために前記被覆溶液中に導入 される。いずれの界面活性剤でも使用され得るが、好ましい界面活性剤は、追加 成分として塩及びポリマーと供に、０．０１〜１％溶液（最っとも好ましくは０ ．１％体体積体積の濃度）でのＴｗｅｅｎ　２０（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ ｌ　Ｃｏ、）である。

調節された毛管現象を作シ出すだめの被覆溶液中におけるポリマーの適切な濃度 は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ　）　、ポリビニルピロリジン（ｐｖｐ　）及 びポリビニルアルコールのために決定された。５〜３０％のＢＳＡ　（Ｗ／Ｖ） の溶液を配合し、そしてそれぞれの溶液２〜２０μノを６ｍＸ６ｍ＋の膜（Ｉｍ ｍｏｂｉｌｏｎ″′）に適用した。被覆のための最適なりＳＡ濃度は１７％でお υ、そしてその４ｐｌが適用された。ＰＶＰのためには、１０〜４０％を含む溶 液が、６■×６■の膜（ＩｍｍｏｂｉｌｏｎＴＭ）に適用された。２〜２０μｌ のサンプルを、それぞれの表面に適用し、そして最適な被覆は２５％ｐｖｐ及び ４μｌの体積で生じた。ＰＶＡのためには、３〜′ｔ、０％の溶液が調製され、 そして６ｍＸ６１ｍの膜（ＩｍｍｏｂｔｌｏＨ”　）に適用された。適用される サングルは２〜２０μでの溶液であった。最適な被覆は、１２％のＰＶＡ及び腹 当シ４μｌで生じた。

被覆溶液中の塩は、いづれかの非妨害性塩であることができるが、しかし好まし くは塩化ナトリウム又は塩化カリウムである。その濃度は等張又はわずかに低い 等張状態である。界面活性剤は、膜表面及び膜の多孔性内部（又は他の多孔性材 料）の被覆を促進するために被覆溶液の一部として適用される。

界面活性剤の使用は、被覆材料の付着又は被膜を伴わないで、膜の表面及び内部 じゅうにポリマー及び塩の均一の分配を促進する。

使用する場合、親和性リガンド（抗体、抗原、ホルモン、レセプター、タンパク 質、等）が膜に結合された後、ポリマー、塩及び界面活性剤を含む被覆溶液が適 用される。被覆溶液の体積は、吸収性材料の内部体積をちょうど満たすべきであ る。１つの例において、膜は６　ｍ　Ｘ　６　ｓｗ　Ｘ　１４０μであシ、そし てその内部体積は、７０％空隙率であシ、被覆は、溶解されたポリマー、塩及び 界面活性剤の適切な分配を得るために約４／μｌの体積を必要とする。それぞれ の新規の膜設針のためには、必要とされる実際の量は、それがもはや完全に吸収 されなくなるまで、多量に溶液を適用することによって決定され得る。

血液アッセイシステムにおける膜構造体は、選択された赤血球細胞表面抗原に対 して特異的な表面に付着された抗体を有する支持体から成る。

その膜構造体を調製するのに使用される支持体は、（ａ）膜構造体中への液体相 の吸上げ；（ｂ）その支持体表面への抗原特異性抗体の結合；（Ｃ）その結合さ れた抗体への赤血球細胞の免疫特異的結合；及び（ｄ）膜マトリックス中の塩、 非特異的なタンパク質濃度又は電荷を変えることによって、膜構造体による水吸 収の速度の調節を可能にするものである。種々の材料、たとえば多くのポリマー 及びガラスが、膜の支持構造体のために適切である。代表的なポリマー材料は、 ラテックス、ボリカーデネート、ポリビニルシフロリド（ＰＶＤＦ　）　、セル ロース、ナイロン、ポリ酢酸ヒニル、ポリスチレン及びポリエチレンを含む。そ の膜支持材料は、他の支持体形、たとえばビーズ又はロッドも使用され得るが、 下記に評価されるであろうように、好ましくは、小さなノぐツチ又はノぐラド、 たとえば２〜８閣の円形、正方形、等に切断され得るシート又は膜である。その 支持体は、表面の化学基、たとえばカルボキシル、ヒドロキシル、アルデヒド、 スルホヒドリル、アミド又はアミン基（これらは、抗体をその支持体に結合する ことに使用゛される化学的な共有結合に関係することができる）を提供し、又は 提供するために変性され得る。同様に、結合はまた、エーテル結合を通しても存 在する。例１−Ｉｔ／に記載されている支持体を調製するのに使用される１つの 好ましい支持体材料は、化学的に活性ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによるＩｍｍｏｂ ｉｌｏｎ”　（これに抗体が共有結合され得る）である。

Ｉｔｎｍｏｂ　ｉ　１　ｏｎ”膜の基礎膜材料は、非相互反応性フルオロカーボ ンポリマーである。しかしながら、細胞の浸入を排除し、そして本来の活性を保 持するが、タンパク質又は他の親和性物質の固定化を可能にするいづれかの膜で も十分であろう。Ｉｍｍｏｂ　ｉ　１　ｏ　ｎＴＭ膜の孔サイズは、０，６５μ ｍ〜５−の範囲である。

親水性の微孔性膜は、毛管現象によって調節される適切な速度で水性相を吸収す るように調節されるべきである。吸収の速度は、塩、たとえばカリウム又はナト リウム塩の添加によって、及び非特異的ポリマーの添加によって調節される。表 面の電荷又は声はまた、結合に影響を及ぼすことができる。水吸収の速度がひじ ょうに早い場合、それは細胞の非特異的結合又は細胞破裂をもたらし、次に非特 異的ポリマーが増大せしめられ、それによって水吸収の速度を高める。

血液群の決定を行なうための好ましい温度は室温、±５℃である。しかしながら 、脂質成分に富む血液の存在において、その最適温度は、高く、３０〜４０℃又 はそれ以上の範囲である。高温は、脂質相によって引き起こされる血液画分の高 められた粘度のために必要とされる。

親和性領域の中に、いづれかのリガンド／リガンドレセプター、たとえば抗体− 抗原、ホルモン−レセプター、酵素−基質又はお互い結合親和性を有するいづれ か２種の分子手段（溶液中における１つの手段及び膜に結合されている他の手段 ）が存在し、それによって溶液中における細胞の検出可能な単離を促進する。

支持体に結合された細胞特異性抗体は、通常、選択されたヒト赤血球細胞抗原、 及び特定にはＡ、Ｂ。

及びａｈ（＋）ヒト血液群に関連するＡ、Ｂ、及びＤ細胞抗原に対して特異的で あるマウス又はヒトＩｇＭ又はＩｇＧ抗体である。ヒト血液群のＡ、Ｂ群に対し て特異的なマウス及びヒ）ＩｇＭ抗体は、一部精製された抗血清として又は精製 された形で、商業的に入手可能である。Ｒｈ−関連の抗原への結合のための抗− Ｄ抗血清又はモノクローナル抗体もまた、商業的に入手可能でアシ、そしてその 抗−〇抗体は既知の方法によってさらに精製され得る。その抗体はポリクローナ ル又はモノクローナルのいづれかであシ得る。

抗体の結合は、カップリング剤、たとえばグルタルアルデヒド、カルがニルジミ ダゾール又はトリクロロトリアジンの使用によシ当業界で既知の方法によって行 なわれ得る。

Ｂｓｔｈｅｌｌ、　Ｇ、Ｓ−＋　Ａｙｅｒｓ＋　Ｊ、Ｓ、ｔ　Ｈａｎｃｏｃｋ、 　Ｗ、Ｓ、及びＨｅａｒｎ、　Ｍ、Ｔ、Ｗ、（１９７９）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃ ｈｅｍ、　２５４　：２５７２〜２５７４゜ Ｚｕｋ＋　Ｒ，Ｆ、　Ｇｉｎａｂｅｒｇ＋　Ｖ、に、、　Ｈｏｕｔａ、　Ｔ−ｐ 　Ｒａｂｂｌｅ。

Ｊ、、　Ｍｅｒｒｉｃｋ、　Ｈ，、Ｕｌｌｍａｎ、　Ｅ、Ｆ、、　Ｆｉｓｈｅｒ 、　Ｍ−Ｍ、ｅＳｉｚｔｏ、　Ｃ，Ｃ，、５ｔｉｓｏ、　Ｓ、Ｎ、ｅ　Ｌｉｔｍ ａｎ、　Ｄ、Ｊ、（１９８５）Ｃ１ｉｎ、Ｃｈｅｍ、３　１　二　１１４４〜１ １５０　。

典型的な方法においては、抗体タンパク質は、支持体表面上の反応性化学基によ って膜支持体に共有結合される。その結合は、反応性表面基、たとえばアルデヒ ド基及び適切なタンパク質基、たとえば第一アミンの間の直接的な化学結合を含 むことができ、又は適切な二官能価の結合試薬、たとえばグルタルアルデヒドに よる架橋を含むことができる。種々の既知の結合反応が利用できる。他方、いく つかの支持体材料に関しては、二次抗体は、共有結合によらないで支持体に強く 吸着され得る。いづれの方法においても、支持体は、結合反応の後、結合されな かった材料を除去するために十分に洗浄される。結合されなかった抗体材料を除 去するために洗浄した後、残る活性タンパク質結合性部位を、他のタンパク質性 又はポリマー性材料の添加によって阻止テることかできる。このタンパク質又は ポリマー材料は、抗体によって結合されないそれらの結合部位に結合し、それに よって試験材料におけるタンｉ？り質の非特異的結合を減じ又は除去する。その ようなタンパク質群の１つは、血清の非免疫グロブリン成分、たとえばα−２− マクログロブリン及びアルブミンである。

これらのタン・ぐり質は、結合反応及び阻止反応を同時に完結するために抗体を 伴うことができる。そのような阻止のために有用なもう１つのタンパク質は、乳 タンパク質カゼイン又は検出されるべ、き抗原のために親和性を持たないいづれ か他のタン／４’り質である。

膜材料自体、たとえばＩｍｍｏｂｉｌｏｎＴＭは水吸収性であシ、又はそれは、 いづれかの水吸収性材料、たとえば紙又は親水性ポリマーの膜であシ得る。

膜及び支持成分を集成するための１つの好ましい方法は、まず、両面接着剤の使 用によって膜成分を支持成分に結合し、続いて特異的抗体を結合し、そして調節 された毛管現象として選定された速度でその膜表面抗体と血液細胞とを接触する ために適切な速度でその膜が水を吸収するように調節することから成る。すでに 抗体を担持する膜の支持成分への接着性集成は、水吸収の予期できない速度をも たらし、それによって赤血球細胞の非特異的結合の可能性又は赤血球細胞の溶解 を高める。

第１図は、水透過性膜（１２）、化学的リンカ−（１４）及び抗体（１６）と共 に支持体（１０）を例示する。いづれか二官能価の化学物質又はポリマーが、リ ンカ−として使用され得、又はリンカ−は使用されなくても良い。第２図は、細 胞、たとえば赤血球細胞に概略的結合される抗体（１６）に順に結合されるリン カ−（１４）に結合される膜（１２）に隣接する支持体（１０）を例示する。そ れぞれの細胞は、それを膜支持体装置に保持するために複数の抗体によって結合 される。細胞に結合する抗体の数は、洗浄過程の間、それを保持するのに十分な 数、好ましくは細胞接触表面領琥当シ抗体分子２０又はそれ以上である。

第３ａ　、３ｂ及び４図は、第１及び２図に関して記載された現の膜・やラド領 域を含むスティック（２０）又はタッグ（３３）を示す。１つの態様において、 その寸法は６酒Ｘ６ｗＸ１４０μ（７０％の空隙率）である。Ａ、Ｂ及びＤで示 された３種の膜は、それぞれ血液群Ａ、Ｂ及びＤ（Ｒｈ）に対して特異的な表面 抗原を有する。４及び５番目のパッド、すなわち抗−ＲＢＣ抗体を含む陽性の対 照及び非特異的抗体又は非抗体タンパク質もしくは他のポリマーを有する陰性の 対照が、場合によっては存在し得る。支持体は別々の膜上に形成され、そして接 着剤によってタッグに接着され得、又はタッグ自体が、５種のパッド領域が形成 される膜であシ得る。タッグは、好ましくは、その膜支持体上に展開される血球 細胞のマトリックスとの色の対照を高めるために、白色又は薄く着色されたもの である。

第３ａ図は、抗−Ａ抗体領域（２５）、抗−Ｂ抗体領域（２４）、抗−り抗体領 域（２３）、すべての赤血球細胞に対する抗体を担持する陽性の対照パッド（２ ２Ｌ及び赤血球細胞のための親和性を持たない中性タッグ＋り質又はタンパク質 を担持する陰性の対照）９ツド（２１）である５種の膜パッド領域を有するステ ィック（２ｏ）を例示する。第３ｂ図において、パッド領域２８，２９，３０及 び３１は、小はん点を付けられ、そして赤血球の結合を示す。

これは、血球壓がＡＢ陽性であシ、そしてアッセイが陽性の対照（２８）を有す ることを示し、そして透明な陰性の対照（２７）は赤血球細胞の非特異的吸収を 示す。それぞれのパッドは、赤血球細胞表面抗原に対する抗体の種々の親゛和性 を補うために、水吸収の速度について個々に調整され得る。すなわち、水吸収の 速度が早くなるほど、細胞表面抗原と親和性抗体とのよシ低い有効的な接触が必 要とされ得る。

タッグは、好ましくは内容物の血液型を同定する容器上にタッグを提供するため に血液溶器に張シ付けるために企画されている。第４図においては、血液型の同 定カード、たとえばバッグの横に接着されたタッグ（３３）の部分が示されてい る。そこに示された特定のカードは、Ｂ　／　Ｒｈ　（＋　）の血液凰を示す。

カード上の血液群の決定アッセイを行なう方法が下記に記載されるであろう。

試験される血液群の抗原よシも他の細胞表面抗原に対して特異的である可溶性抗 体がまた、本発明の方法の細胞型を検出するために使用され得る。１つのそのよ うな方法は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ　）特異性抗体を用いることである。その ような抗体を調製するだめの方法は良く知られている。

３、血液型アッセイ方法 本発明の方法は、選択された細胞表面抗原、典型的には血液群Ａ、Ｂ、又はＲｈ 因子の特性を示す抗原を有する赤血球細胞に特異的に結合し、且つ高い親和性を 有するように構成される、上記型の膜支持体の提供をまず含む。その膜は、膜内 への水性相の吸上げを促進するために使用される場合、乾燥又はほぼ乾燥状態で あるべきである。

型を検出されるべき完全な血液又は血液細胞のサンプルが、膜をおおうのに十分 な量、それぞれの膜に添加され、そしてその膜は懸濁されたサンプル細胞に暴露 される。他方、その膜を担持するスティック又はタッグがそのサンプルに浸され る。比較的少ない細胞を含む希釈されたサンプルにおいては、よシ厚い膜が、そ の膜表面と必要とされる数の細胞とを接触するために、よシ多くの量の溶液の吸 収を必要とされる。たとえば、サンプルがＮ回希釈された場合、その関連する内 部の吸収領域はまた、約Ｎ倍、上昇されるべきである。

第３ｂ図は、膜が水溶液又は完全な血液溶液中における細胞に暴露される場合に 生じる膜を担持する診断用スティックへの細胞の結合を例示する。第３ｂ図にお ける診断用スティックは、支持体（２０）、及び第１．２及び３＆図におけるよ うにして膜表面に結合される抗−ヒト血液型抗体を担持する膜−吸上げ領域（２ ２〜２５）から成る。第３ｂ図においては、結合された赤血球細胞が、眼によっ て又は走査装置によって容易に検出される密集した細胞層（２８〜３１）を形成 する。

洗浄された支持体は、乾燥せしめることによって、強く着色された乾燥マトリッ クス領域を有する永久的な形に保たれ得る。所望によシ、その乾燥された支持体 （又はカード上の支持領域）は、吹付用ラッカー又は同様のものによ）保護され 得る。

本発明の方法が、例示的に血液銀行によって行なわれる場合、供与血液が血液バ ッグ、たとえばバッグ（３２）（第４図）に集められる。次に、このバッグから の血液を、タッグ（３３）の支持体領域に適用する。室温で１〜３分間インキュ ベージジンした後、生理食塩水によシタラグをすすぐことによって、又はそのよ うな溶液中にタッグを浸たし、そして軽く撹拌することによって、カードを洗浄 する。

すぐに、タッグは、強く着色された領域（ここで、免疫特異的な細胞結合が起っ ている）及び陰性領域のための実質的に着色さｎていない領域を示す。例示され た態様において、アッセイはＡＢ／Ｒｈ（刊血液型を示す。カードは、乾燥せし められ、容易に読みやすい永久的な血液型の記録を与えられる。そのカードは、 血液供与設定において、たとえばステープルで留め、締付は又は接着性基材によ って血液容器に永久的に接着され得る。血液受容の場合、カード又はストリップ が、受容者の病院の記録に又はブレスレットの形で患者に直接的に取り付けられ 得る。

細胞検出膜システムの多くの態様が予想さｎる。

予想される哺乳類細胞の中に、ヒト及び他の哺乳類、たとえば馬、牛、羊、ヤギ 、豚、犬、ネコ、ウサギ。

ネズミ及びマウスの血液細胞；及び真核性組織培養細胞系が存在する。細胞がそ れ自体の固有の特性、たとえば赤血球細胞のための赤色によって検出できる場合 、追加の薬物が検出のために必要とさ扛る。

しかしながら、細胞が十分に検出され得ない場合、薬物、たとえば染料、検出で きるラベルされた抗体又は検出できるラベルされた親和性リガンドが使用される べきである。検出できる薬物の中に、放射性同位体、酵素、螢光染料及び電子不 透明材料が存在する。

細胞検出装置の一般的態様は、第１〜５図に例示され、そして特定の検出器が第 ５図に示されている。

その細胞検出支持装置は、検出を妨害しないいづｎかの材料提供支持体であり得 る。検出器は、・々ラド、スティック、タッグ、プレスレッド、カードＸｔｆ容 易な利用性且つ製造のために適切な他の態様を含む種々の形で存在することがで きる。

第５図に示されているような特定の態様は、特定の型の赤血球細胞を検出するた めに適切な膜表面を有する細胞検出器である。その診断用ストリップは、血液容 器中への挿入のための手で持つために適切な支持ストリッｆ（４４）から成る。

予定されるその寸法は長さ２〜６インチ、好ましくは３〜５インチ、及び最っと も好ましくは４．２５インチである。その幅は２〜１５　ｍ　、好ましくは３〜 ９ＩＩＩＩ１１、及び最っとも好ましくは６■である。例Ｉに記載さｎているよ うな抗体親和性領域を含む膜表面が支持体に取り着けられている。この態様にお いて、血液型の検出装置上に次の明確な領域が存在する：溶液の底部での沈殿物 が検出を妨害しない確保するために膜を持たない領域（３４）：ヒ）Ｄ又はＤｕ に対する抗体を有する膜を含む領域（３５）：灰色の文字″Ｒｈ”又は灰色のバ ックグラウンド及び異なった色の文字を有する領域（３６）：ヒ）Ｂ抗原に対す る抗体を有する膜を含む領域（３７）；黄色の文字“Ｂ”又は黄色のバックグラ ウンド及び異なった色の文字を有する領域（３８）：ヒＩ−Ａ抗原に対する抗体 を有する膜を含む領域（３９）；青色の文字″Ａ′又は青色のパックグランド及 び異なった色の文字を有する領域（４０）；オーノンスペースの領域（４１）； 特表昭６４−５００３６９　（９） 対照目的のための膜である領域（４２）及び（４３）（１つは赤血球細胞を非特 異的に結合する抗体を含む陽性の対照膜であシ、そして他は赤血球細胞のための 特異的な親和性が存在しないような阻害剤を有する陰性の対照膜である）。ステ ィック上の膜の順序は変えることができ、膜及び文字の大きさは変えられ得るが 、しかしながらそれらの色は、本発明の態様の臨界的な観点である。血液型の検 出のだめの診断用スティックのユニークなデザインは、２１　ＣＦＲ８ｅｅｔ４ ｏｎ６６０．２８　に従って、調節さ扛た毛管現象及び色の指示薬を有する膜を 具体化する。

本発明の他の態様は、ピンク色のＣ”、褐色の’Ｅ”、オレンジ色の’　ＣＤＥ ″、薄紫色のＣ”又は緑色の′ｅ”；又は文字に対して異なった色を有する類似 する色のバクフグラウドを有する指示領域を有するであろう。

前記から、いかに種々の本発明の目的及び特徴が満たされるかを正しく評価する ことができる。この血液型検出システムは、血液サンプル又は試薬中における混 合による技術的な誤差の可能性を実質的に除去する。第４図に例示さｎている本 発明の態様において、血液サンプルは、血液バッグ又はサングルからカードに直 接的に移さＣ１そしてそのカードに添加される試薬のみが生理食塩水によシ洗浄 さ【る。

血液型の視覚による記録がカード自体上に含ま扛るので、書き誤シは最少にさ扛 る。

こ扛までに提案された他の血液型検定法とは異なる、本発明の結合反応は、すな わち特定の分光光度計又は濃度計装置なしに、及び複雑な説明又は分析なしに容 易に視覚的に読まれる。

本発明のもう１つの重要な利点は、初めのアッセイがそのアッセイ結果の永久的 な記録を提供し、その結果、再試験が血液型を確認するために必要とさｎないこ とである。

次の例は、限定するものではなく、むしろ本発明の特定の態様を例示する。

支持又は基材材料のシートに、両面接着剤（ＩｍｍｏｂｉｌｏｎＴＭ、　Ｍｉｌ ｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ：　Ａｄｂｅｓｊｙａｓ。

３Ｍ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の使用により膜材料の一連のストリップを適用 する。Ａ、Ｂ又はＤヒト血球細胞抗原に対する抗体は、商業的に入手可能である （Ｇａ、ｍｍａＢｉｏｌｏｇｉｅｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｈｏｕｓｔｏｎ、　ＴＸ） 。こｎらの抗体は天然でモノクローナル又はポリクローナルのいづれかであり得 る。支持体表面への膜の適用に続いて、５段階：結合、染色、被覆、乾燥及び貯 臓が存在する。

第１段階において、リン酸緩衝溶液中における抗体＋任意の不活性タン・ぐり質 又はポリマー、たとえばＣ２−マクログロブリンを、膜に適用する。抗体を含む この液体約１０μｔを、膜の６霞２の面積当シに適用する。その抗体溶液は、１ ０μを当ｆｉ０．０５μ９〜０，５μｇの抗体を含む。存在する場合、ポリマー 又はタンノ９り質の濃度は、約１００μ＃／１０ｔＡ！である。

抗体の結合の前、その膜表面は必要なカクゾリング剤によシ処理された。膜への 抗体の結合に続いて、２７℃で２０分の乾燥期間又は乾燥するまでよシ長い期間 が存在する。乾燥期間が完結した後、次の段階は、調節された毛管現象を作シ出 すための膜の被覆である。毛管現象を調節するために、塩、界面活性剤及びポリ マー、たとえばタンＩＪ？り質又は他のポリマーを含む被覆溶液を適用した。脱 イオン化さｎた水において２０％ＢＳＡ　、界面活性剤Ｔｖｅｅｎ　２０及び塩 化ナトリウムを含む１つのそのような被覆溶液を、使用した。この被覆溶液のサ ンプル５μｔを、膜のそれぞｎ　６　ｍ２面積に適用した。

被覆段階の後、その被覆さｎた膜は、３７℃で２０分間又は乾燥まで乾燥せしめ らｎた。

例　■ 次にその処理された膜を担持するシートを、６ｍの幅のストリップに切った。次 に、こｎらのストリップを、必要とさ扛るまで、乾燥、冷却又は凍結条件下で保 存した。ストリップ上のそｎぞｎの膜領塚は、６　ｗｍ　Ｘ　６■×１４０μの 膜領域及び３．５〜５μｔの内部体積を有した。

ヒト抗原Ａ、Ｂ及びＤに対する抗体溶液によ逆処理さｎた膜を担持する支持体シ ートを、幅６閣又はそｎ以下及び長さ４．２５インチ又はそれ以上のストリップ に切断した。次に、これらの切断さｔたストリップを、乾燥剤を含む乾燥容器に 保存した。それらは、冷却又は凍結条件下で維持さｎ得る。必要とさ扛る場合、 その診断用ストリップを使用のために取シ出す。

例　■ 診断用タッグの調製 診断用タッグを、例Ｉの方法に類似する方法によって調製する。但し、抗体溶液 及び被覆溶液が支持体基材に接着された膜ディスクに適用さｎる。その支持体基 材は、容器、ブレスレット又は記録への適用のために適切な接着性基材をその反 対側に有する。

例　■ Ａ、ＡＢ及び０群の供与者からの完全な血液を、地方の血液銀行から得た。

例１及び例■のようにして調製さ扛た、膜表面に結合されたマウス抗−ヒト血液 群Ａ、Ｂ、Ｄ及びＲＢＣを有する個々の膜診断用スティックを、６０秒間、完全 な血液を有する試験管中にそれぞ扛装置した。次に、その診断用スティックを取 シ出し、そして生理食塩水（約５〜ＩＣ１ｔＡ’）によシ洗浄し、又は生理食塩 水を満たさ扛た試験管（３０〜５０ｍＪ）中に１０〜３０秒間、浸した。次に、 その診断用スティックを読んだ。

膜の視覚的な検査は次のことを示した：（ａ）　Ａ及びＡＢ血液型は、表面に結 合さ扛た抗−Ａ抗体を含むディスク上に強い着色反応（膜表面被膜）を与え； （ｂ）　Ｂ及びＡＢ血液型は、表面に結合された抗−Ｂ抗体を含むディスク上に 強い着色反応を与え；（ｃ）　抗−Ａ又は抗−Ｂ膜のいづｎかへのＯ血液型の評 価可能な血液細胞の結合は、検出されなかった。

第　１　表は、　Ａ十　、Ａ−、Ｂ十　、Ｂ−＋　ＡＢ＋　、ＡＢ−。

０＋及びＯ−ヒト血液に関する試験のための結果を要約する。第３ｂ及び４図は 、ＡＢ十のためのパターンを示す。

第　１　表 血液型 抗　−ＲＢＣ（Ｃ＋）　十　十　十　十　十　十　十　十負の対照（Ｃ−）　− −−−−−−− キー：十＝赤；−＝白 従って、第１表の結果は、調整さ扛た毛管現象を有する膜装置を用いての哺乳類 の赤血球細胞の検出を示す。

国際調査報告

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．膜と溶液中の細胞とを接触せしめるのに使用するために調節された毛管現象 を有する構造体であって： ａ）多孔性膜表面； ｂ）前記膜表面と前記細胞とを効果的に接触せしめるために十分な、調節された 速度で前記溶液を導入することができる多孔性内部を含んで成る構造体。
2. ２．前記膜表面及び前記多孔性内部が異なった材料から構成される請求の範囲第 １項記載の構造体。
3. ３．前記膜表面及び前記多孔性内部が同じ材料から構成される請求の範囲第１項 記載の構造体。
4. ４．前記膜が、操作の間、膜のトポロジ−を維持することがてきる支持体手段に 取り付けられる請求の範囲第３項記載の構造体。
5. ５．前記細胞が次のもの：赤血球細胞、白血球細胞、組織培養細胞又は完全な血 液の１つである請求の範囲第４項記載の構造体。
6. ６．前記細胞がヒト赤血球細胞である請求の範囲第５項記載の構造体。
7. ７．約５ミクロンよりも小さな孔サイズを有する、非−細胞破壊性膜表面を有す る前記膜表面；前記膜表面と接触される液体サンプルを該膜表面を通して吸い込 むための調節された毛管現象を有する前記内部膜；及び サンプルが膜に対して配置され、そして赤血球細胞がその膜に対して吸い取られ る場合、選択された型の血液サンプル中の赤血球細胞を免疫特異的に結合するこ とができる表面配列の型特異的抗体を付着された前記膜表面を、赤血球細胞の型 を検出するのに使用するために含んで成る請求の範囲第６項記載の構造体。
8. ８．前記内部の液体容量が、前記膜表面上に免疫特異的に結合された赤血球細胞 の見える層を形成するのに必要な赤血球細胞の少なくとも必要な数を含む血液サ ンプルの体積を前記膜を通して吸収するのに十分である請求の範囲第７項記載の 構造体。
9. ９．水性アッセイ媒体によりＮ倍に希釈された血液サンプル中の血液型を決定す るために、前記膜及び関連する内部が、少なくとも約Ｎ×２０ミクロンの厚さを 有する単位構造体として形成される請求の範囲第８項記載の構造体。
10. １０．前記膜が次のもの：ＰＶＤＦ，ＰＴＦＥ，変性されたナイロンニトロセル ロース、再生されたセルロース、又はセルロースの１つから成るポリマー繊維か ら構成される請求の範囲第８項記載の構造体。
11. １１．前記膜表面が実質的に電荷されていない請求の範囲第１０項記載の構造体 。
12. １２．前記抗体が前記膜表面に吸着により付着されている請求の範囲第７項記載 の構造体。
13. １３．前記抗体が前記膜表面に共有結合されている請求の範囲第７項記載の構造 体。
14. １４．前記膜表面及び内部がＦＶＤＦ繊維の単位膜として形成され、そして前記 抗体がカルボジイミジゾールカップリング剤により前記膜表面に結合される請求 の範囲第１３項記載の構造体。
15. １５．前記抗体を、抗−Ａ，抗−Ｂ及び抗−Ｄ抗体から成る群から選択する請求 の範囲第７項記載の構造体。
16. １６．前記抗体が免疫グロブリンＭ抗−ヒトＤモノクローナル抗体であり、そし て前記膜表面上の抗体が、該膜表面上に目で確認てきる細胞層を形成するのに十 分な表面濃度でＤ及びＤｕ型のヒト赤血球細胞の両者を結合するのに効果的であ る請求の範囲第１５項記載の構造体。
17. １７．Ａ，Ｂ，ＡＢ，Ｏ，ＲｈＤ及びＲｈＤｕの血液型を決定するための血液型 検出装置であって；第１，第２及び第３膜構造体； 約５ミクロンよりも小さな孔サイズを有する、湿潤性、水透過性、非細胞破壊性 膜表面，及び前記膜表面に対して置かれた液体サンプルを調節された毛管現象に より前記膜表面を通して吸い取るために、前記膜表面に効能的に関連する内部領 域から構成されているそれぞれの膜構造体； Ａ又はＡＢ型の血液サンプルが前記膜に対して置かれ、そしてその細胞が前記膜 構造体の内部の前記調節された毛管作用により前記膜を通して吸い取られる場合 、赤血球細胞を免疫特異的に結合することができる表面配列の抗−Ａ血液型抗体 をその膜に付着されている前記第１構造体； Ｂ又はＡＢ型の血液サンプルが前記膜に対して置かれ、そしてその細胞が前記膜 構造体の内部の前記調節された毛管作用により前記膜を通して吸い取られる場合 、赤血球細胞を免疫特異的に結合することができる表面配列の抗−Ｂ血液型抗体 をその膜に付着されている前記第２構造体；及び Ｄ又はＤｕ型の血液サンプルが前記膜に対して置かれ、そしてその細胞が前記膜 構造体の内部の前記調節された毛管作用により前記膜を通して吸い取られる場合 、赤血球細胞を免疫特異的に結合することがてきる表面配列の抗−Ｄ血液型抗体 をその膜に付着されている前記第３構造体を含んで成る装置。
18. １８．前記第３構造体に付着された抗−Ｄ抗体が免疫グロブリンＭヒトモノクロ ーナル抗体である請求の範囲第１７項記載の装置。
19. １９．血液サンプルが前記膜に対して置かれ、そしてその細胞が前記膜構造体の 内部の前記調節された毛管作用により前記膜を通して吸い取られる場合、赤血球 細胞を免疫特異的に結合することができる表面配列の抗−ヒト赤血球細胞抗体を その膜に付着された第４膜構造体及び赤血球細胞に対して免疫特異的な結合親和 性を持たないポリマー配列をその膜表面に付着された第５膜構造体をさらに含む 請求の範囲第１７項記載の装置。
20. ２０．前記抗体が次のようにして次の選択された膜の１つに： （ａ）臭化シアンによってＰＶＤＦフィルターに共有的に；及び （ｂ）ＰＴＦＥ，ニトロセルロース，変性されたナイロン，再生されたセルロー ス又はセルロースフィルターへの吸収により付着されている請求の範囲第１７項 記載の装置。
21. ２１．血液サンプル中の赤血球細胞の型を検出するための方法であって； 約５ミクロンよりも小さな孔サイズを有する、湿潤性、水透過性、非細胞破壊性 の膜表面、該膜表面と接触される液体サンプルを調節された毛管現象によって前 記膜表面を通して吸い上げるための該膜表面に効果的に関連する内部領域、及び 選択された型の血液サンプル中の赤血球細胞を免疫特異的に結合することができ る表面配列の型特異的抗体を付着された前記膜表面から成る膜構造体を提供し； そしてサンプルを前記膜に接触せしめ；そしてこの接触によって、内部の調節さ れた毛管現象の作用による前記膜を通してのサンプル中の赤血球細胞の吸収を引 き起こし、それによって型特異性細胞が、前記膜上で赤血球細胞の単層を形成す るために、そのような抗体と免疫特異的に反応し；そして前記膜に非特異的に付 着する赤血球細胞を除去するために該膜を洗浄し；そして 血液型の指示として前記赤血球の層の存在を検出することを含んで成る方法。
22. ２２．３種の膜構造体，すなわちＡ及びＡＢ型の血液に対して特異的な抗−Ａ抗 体を有する第１膜構造体、Ｂ及びＡＢ型の血液に対して特異的な抗−Ｂ抗体を有 する第２膜構造体及びＤ及びＤｕ型の血液の両者に対して特異的なヒト抗−Ｄ抗 体を有する第３膜構造体がＡ，Ｂ，ＡＢ，Ｏ，ＲｈＤ及びＲｈＤｕの血液型の決 定に使用されるために、提供されている請求の範囲第２１項記載の方法。
23. ２３．前記水平寸法が６ｍｍ又はそれ以下であり、そして垂直寸法が４，２５イ ンチ又はそれ以上である請求の範囲第１７項記載の装置。
24. ２４．前記孔サイズが２ミクロンよりも小さい請求の範囲第７項記載の方法。
25. ２５．前記孔サイズが約０．６５ミクロンである請求の範囲第２４項記載の方法 。
26. ２６．前記装置が、第５図に実質的に例示され、そして説明されている血液型の 検出用スティックである請求の範囲第２３項記載の装置。