JPH0139553B2 - - Google Patents
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Description
ハイ・デンジイテイ・リポプロテイン（High
Density Lipoprotein＝HDL）は、最近重要視さ
れるようになつて来た。HDL―コレステリンと
心筋硬塞との間には逆の関係があることが立証さ
れた。血液中のHDL―コレステリンの割合が低
ければ、心筋硬塞の危険性が高いことが考慮され
るできである。HDL―コレステリンの測定が可
能であることは、個人のアテローム性動脈硬化を
診断するために著しく役立つ。それというのも
HDL―コレステリン値を確認すれば、上記のア
テローム性動脈硬化を予防するリポプロテインフ
ラクシヨンに関して証言することができるだけで
なく、また公知の近似値式： LDL―コレステリン＝総コレステリン―1/5総ト
リグリセリド―HDL―コレステリン を介してアテローム性LDL―コレステリンの量
を導き出すことができる。 HDL−フラクシヨンのコレステリン含量を測
定するための普通の前提条件は、別の全てのリポ
プロテイン類を分離することである。これには乳
糜脂粒、ベリー・ロー．デンジイテイ・リポプロ
テイン（Very Low Density Liposproteine＝
VLDL）及びロー・デンジイテイ・リポプロテイ
ン（Low Density Lipoprotein＝LDL）が属し、
これらはアポ―Ｂ含有レポプロテインの類に数え
られる。 このアポ―Ｂ含有リポプロテインを分離するた
めには、特に超遠心分離、電気永動及び沈殿法が
使用される。これらの３つの方法の内では、大低
は多価の陰イオン及び２価の陽イオンから成る混
合物が使用される沈殿法が最も頻繁に実施され
る。ヘパリン／マンガンイオン又は硫酸デキスト
ラン／マグネシウムイオンを用いる沈殿の他に、
屡々燐タングステン酸塩／マグネシウムイオンを
用いた沈殿が使用される。後者の方法は、例えば
“ジヤーナル・オブ・リピツト・リサーチ
（Jonrnal of Lipid Research）”第11巻（1970
年）、583〜595頁に記載されている。 この方法を実施するには、燐タングステン酸溶
液をカセイソーダ溶液で一定のPH値、有利にはPH
6.1〜7.6に調整する。こうして得られた燐タング
ステン酸溶液を測定すべき試料、例えば血清又は
血漿に加えかつ塩化マグネシウム溶液を加える。
以下の量比が一般的である： 試料 1.000ml 燐タングステン酸溶液（40ｇ／、PH6.1〜
7.6） 0.100ml 塩化マグネシウム・6H2O溶液（２モル／）
0.025ml このようにして、アポ―Ｂ含有リポプロテイン
を沈殿させかつ遠心分離によつて分離する。次い
で、沈殿上澄み内で、HDL―コレステリン及び
その他のHDL―パラメータ、例えばアポリポプ
ロテイン及びホスホリピドを測定することができ
る。 試料への燐タングステン酸塩及び塩化マグネシ
ウム溶液の添加は、混合物の形でも行なうことが
できる〔“クリニカル・ケミストリー（Clin.
Chem.）”第25巻（1979年）、939〜942頁及び“リ
ポプロテイン・ウント・ヘルツインフアルクト
（Lipoproteine und Herzinfarkt）”編集者グレ
ーテン（H.Greten）、ランダ（P.D.Lang）及び
シエツトラー（G.Schettler）、ゲルハンド・ビツ
ツロツク（Gergard Witzrock）出版社、バーデ
ン―バーデン、ケルン、ニユーヨーク在（1979
年）、39〜44頁参照〕。この処置は試験法の実用性
を高める。この変法によれば、試料1.0mlに燐タ
ングステン酸塩／塩化マグネシウム溶液混合物
0.1mlが加えられる。しかしながら、個別の溶液
とは異なり、燐タングステン酸塩溶液と塩化マグ
ネシウム溶液との混合物は長時間に渡つては安定
ではない、それというのも沈殿試薬中に沈殿物が
形成されるからである。 更に、従来記載された沈殿法の大きな欠点は、
トリグリセリド富有試料の場合には遠心分離後に
沈殿物が一部浮遊することである。清澄な沈殿上
澄みを得るためには、高いｇ値及び長い遠心分離
時間が必要である。 燐タングステン酸塩／マグネシウムイオンを用
いた公知の沈殿法のもう１つの欠点は、沈殿がPH
値に左右されることである。沈殿を燐タングステ
ン酸塩溶液のPH値6.1〜7.4で実施することが推奨
される。しかしながら、一定のPH値を調整するこ
とは既に困難である。それというのも燐タングス
テン酸は従来沈殿のために使用される濃度範囲で
はPH値測定用ガラス電極に影響を及ぼすからであ
る。 更に、従来の沈殿法の欠点は、添加すべき試率
の容量が少なければ、試薬の体積を正確に測定す
ることを可能にする市販の希釈剤を使用すること
ができないことである。希釈剤を使用するための
前提条件は、一般に試料１容量部に対して沈殿試
薬２容量部の割合である。 ところで、本発明の課題は、前記の欠点をもは
や有していずかつ精確に容易に実施可能なアポ―
Ｂ含有リポプロテインの沈殿及び遠心分離のため
に適当であり、従つて遠心分離上澄み内で問題の
ない、支障の生じないHDL―コレステリン測定
を可能にする、アポ―Ｂ含有リポプロテインを沈
殿させる試薬を提供させることであつた。 この課題は、適当な溶剤中に燐タングステン酸
0.2〜３ｇ／、有利には0.25〜２ｇ／及びマ
グネシウムイオン２ミリモル／より多く、有利
には４〜25ミリモル／を含有することによつて
解決される。マグネシウムイオンは、試薬に適当
なマグネシウム塩の形で、有利には塩化マグネシ
ウム・6H2Oとして加えることができる。溶剤と
しては、特に水が適当である。 本発明の試薬の著しい利点は、添付図の第１図
から明らかなように、アポ―Ｂ含有リポプロテイ
ンの沈殿後に検出されるHDL―コレステリン値
がPH依存性を示さないことである。従つて、沈殿
試薬を一定のPH値、公知技術水準によれば有利に
は中性のPH値に調整することはもはや不必要であ
る。従つて、本発明の沈殿試薬は、使用溶剤中で
燐タングステン酸及びマグネシウム塩を溶解する
際に生じるPH値を有する本発明の沈殿試薬を使用
するのが特に有利である。このPH値は、例えば塩
化マグネシウム・6H2O又は硫酸マグネシウムを
使用する際にはPH2.2〜2.7、酢酸マグネシウムを
使用する際にはPH5.4〜5.7である。 第１図に示されているように、本発明の沈殿試
薬を用いる場合、なお沈殿試薬混合物のPH値を高
い値に調整すれば、アポ―Ｂ含有リポプロテイン
の完全な沈殿を達成することができる。この調整
は、必要量の適当な塩基、例えばカセイソーダ溶
液を添加することにより行なうことができる。し
かしながら、沈殿混合物中のPH値は約8.0までに
制限される。それというのもそれ以上のPH値では
マグネシウムイオンが水酸化マグネシウムの形で
析出するからである。従つて、沈殿試薬のPH値は
有利には２〜８である。 驚異的にも、燐タングステン酸塩及びマグネシ
ウム塩から成る公知の沈殿試薬と異なり、本発明
の沈殿試薬は優れた安定性を有していることが判
明した。50℃で12ケ月貯蔵した後、本発明の試薬
はなお完全に有効である。試薬内での沈殿物形成
は生じない。 更に意想外にも、本発明の沈殿試薬混合物を使
用すれば、リポプロテイン含有沈殿物は問題なく
遠心分離可能であることが判明した。沈殿物を完
全に分離するためには、一般に1500ｇで５〜10分
間の遠心分離時間で十分である。この利点は、特
に高い脂質含量を有する試料の遠心分離の際に明
らかになる。 第１表には、このような脂質含有血清試料に対
して公知の沈殿試薬（試料／試薬＝1.0／0.1）
と、本発明の沈殿試薬（試料／試薬＝1.0／2.0）
とを用いて、アポ―Ｂ含有リポプロテインの沈殿
後に測定したHDL―コレステリン値が対比させ
てある。
Density Lipoprotein＝HDL）は、最近重要視さ
れるようになつて来た。HDL―コレステリンと
心筋硬塞との間には逆の関係があることが立証さ
れた。血液中のHDL―コレステリンの割合が低
ければ、心筋硬塞の危険性が高いことが考慮され
るできである。HDL―コレステリンの測定が可
能であることは、個人のアテローム性動脈硬化を
診断するために著しく役立つ。それというのも
HDL―コレステリン値を確認すれば、上記のア
テローム性動脈硬化を予防するリポプロテインフ
ラクシヨンに関して証言することができるだけで
なく、また公知の近似値式： LDL―コレステリン＝総コレステリン―1/5総ト
リグリセリド―HDL―コレステリン を介してアテローム性LDL―コレステリンの量
を導き出すことができる。 HDL−フラクシヨンのコレステリン含量を測
定するための普通の前提条件は、別の全てのリポ
プロテイン類を分離することである。これには乳
糜脂粒、ベリー・ロー．デンジイテイ・リポプロ
テイン（Very Low Density Liposproteine＝
VLDL）及びロー・デンジイテイ・リポプロテイ
ン（Low Density Lipoprotein＝LDL）が属し、
これらはアポ―Ｂ含有レポプロテインの類に数え
られる。 このアポ―Ｂ含有リポプロテインを分離するた
めには、特に超遠心分離、電気永動及び沈殿法が
使用される。これらの３つの方法の内では、大低
は多価の陰イオン及び２価の陽イオンから成る混
合物が使用される沈殿法が最も頻繁に実施され
る。ヘパリン／マンガンイオン又は硫酸デキスト
ラン／マグネシウムイオンを用いる沈殿の他に、
屡々燐タングステン酸塩／マグネシウムイオンを
用いた沈殿が使用される。後者の方法は、例えば
“ジヤーナル・オブ・リピツト・リサーチ
（Jonrnal of Lipid Research）”第11巻（1970
年）、583〜595頁に記載されている。 この方法を実施するには、燐タングステン酸溶
液をカセイソーダ溶液で一定のPH値、有利にはPH
6.1〜7.6に調整する。こうして得られた燐タング
ステン酸溶液を測定すべき試料、例えば血清又は
血漿に加えかつ塩化マグネシウム溶液を加える。
以下の量比が一般的である： 試料 1.000ml 燐タングステン酸溶液（40ｇ／、PH6.1〜
7.6） 0.100ml 塩化マグネシウム・6H2O溶液（２モル／）
0.025ml このようにして、アポ―Ｂ含有リポプロテイン
を沈殿させかつ遠心分離によつて分離する。次い
で、沈殿上澄み内で、HDL―コレステリン及び
その他のHDL―パラメータ、例えばアポリポプ
ロテイン及びホスホリピドを測定することができ
る。 試料への燐タングステン酸塩及び塩化マグネシ
ウム溶液の添加は、混合物の形でも行なうことが
できる〔“クリニカル・ケミストリー（Clin.
Chem.）”第25巻（1979年）、939〜942頁及び“リ
ポプロテイン・ウント・ヘルツインフアルクト
（Lipoproteine und Herzinfarkt）”編集者グレ
ーテン（H.Greten）、ランダ（P.D.Lang）及び
シエツトラー（G.Schettler）、ゲルハンド・ビツ
ツロツク（Gergard Witzrock）出版社、バーデ
ン―バーデン、ケルン、ニユーヨーク在（1979
年）、39〜44頁参照〕。この処置は試験法の実用性
を高める。この変法によれば、試料1.0mlに燐タ
ングステン酸塩／塩化マグネシウム溶液混合物
0.1mlが加えられる。しかしながら、個別の溶液
とは異なり、燐タングステン酸塩溶液と塩化マグ
ネシウム溶液との混合物は長時間に渡つては安定
ではない、それというのも沈殿試薬中に沈殿物が
形成されるからである。 更に、従来記載された沈殿法の大きな欠点は、
トリグリセリド富有試料の場合には遠心分離後に
沈殿物が一部浮遊することである。清澄な沈殿上
澄みを得るためには、高いｇ値及び長い遠心分離
時間が必要である。 燐タングステン酸塩／マグネシウムイオンを用
いた公知の沈殿法のもう１つの欠点は、沈殿がPH
値に左右されることである。沈殿を燐タングステ
ン酸塩溶液のPH値6.1〜7.4で実施することが推奨
される。しかしながら、一定のPH値を調整するこ
とは既に困難である。それというのも燐タングス
テン酸は従来沈殿のために使用される濃度範囲で
はPH値測定用ガラス電極に影響を及ぼすからであ
る。 更に、従来の沈殿法の欠点は、添加すべき試率
の容量が少なければ、試薬の体積を正確に測定す
ることを可能にする市販の希釈剤を使用すること
ができないことである。希釈剤を使用するための
前提条件は、一般に試料１容量部に対して沈殿試
薬２容量部の割合である。 ところで、本発明の課題は、前記の欠点をもは
や有していずかつ精確に容易に実施可能なアポ―
Ｂ含有リポプロテインの沈殿及び遠心分離のため
に適当であり、従つて遠心分離上澄み内で問題の
ない、支障の生じないHDL―コレステリン測定
を可能にする、アポ―Ｂ含有リポプロテインを沈
殿させる試薬を提供させることであつた。 この課題は、適当な溶剤中に燐タングステン酸
0.2〜３ｇ／、有利には0.25〜２ｇ／及びマ
グネシウムイオン２ミリモル／より多く、有利
には４〜25ミリモル／を含有することによつて
解決される。マグネシウムイオンは、試薬に適当
なマグネシウム塩の形で、有利には塩化マグネシ
ウム・6H2Oとして加えることができる。溶剤と
しては、特に水が適当である。 本発明の試薬の著しい利点は、添付図の第１図
から明らかなように、アポ―Ｂ含有リポプロテイ
ンの沈殿後に検出されるHDL―コレステリン値
がPH依存性を示さないことである。従つて、沈殿
試薬を一定のPH値、公知技術水準によれば有利に
は中性のPH値に調整することはもはや不必要であ
る。従つて、本発明の沈殿試薬は、使用溶剤中で
燐タングステン酸及びマグネシウム塩を溶解する
際に生じるPH値を有する本発明の沈殿試薬を使用
するのが特に有利である。このPH値は、例えば塩
化マグネシウム・6H2O又は硫酸マグネシウムを
使用する際にはPH2.2〜2.7、酢酸マグネシウムを
使用する際にはPH5.4〜5.7である。 第１図に示されているように、本発明の沈殿試
薬を用いる場合、なお沈殿試薬混合物のPH値を高
い値に調整すれば、アポ―Ｂ含有リポプロテイン
の完全な沈殿を達成することができる。この調整
は、必要量の適当な塩基、例えばカセイソーダ溶
液を添加することにより行なうことができる。し
かしながら、沈殿混合物中のPH値は約8.0までに
制限される。それというのもそれ以上のPH値では
マグネシウムイオンが水酸化マグネシウムの形で
析出するからである。従つて、沈殿試薬のPH値は
有利には２〜８である。 驚異的にも、燐タングステン酸塩及びマグネシ
ウム塩から成る公知の沈殿試薬と異なり、本発明
の沈殿試薬は優れた安定性を有していることが判
明した。50℃で12ケ月貯蔵した後、本発明の試薬
はなお完全に有効である。試薬内での沈殿物形成
は生じない。 更に意想外にも、本発明の沈殿試薬混合物を使
用すれば、リポプロテイン含有沈殿物は問題なく
遠心分離可能であることが判明した。沈殿物を完
全に分離するためには、一般に1500ｇで５〜10分
間の遠心分離時間で十分である。この利点は、特
に高い脂質含量を有する試料の遠心分離の際に明
らかになる。 第１表には、このような脂質含有血清試料に対
して公知の沈殿試薬（試料／試薬＝1.0／0.1）
と、本発明の沈殿試薬（試料／試薬＝1.0／2.0）
とを用いて、アポ―Ｂ含有リポプロテインの沈殿
後に測定したHDL―コレステリン値が対比させ
てある。
【表】
第１表にまとめられた値は、本発明の沈殿試薬
を用いてアポ―Ｂ含有リポプロテインを沈殿させ
かつ沈殿物を遠心分離する場合には、公知の沈殿
試薬を用いる場合よりも著しく高い脂質（トリグ
リセリド）含量の際に初めて支障が生じることを
示している。このことは従来公知の燐タングステ
ン酸塩／マグネシウム塩沈殿とは異なり付加的な
利点をもたらす、即ち沈殿試薬の添加前の脂質性
試料の希釈は極めて高いトリグリセリド値におい
て初めて必要である（1000mg／dl以上）。従来記
載された沈殿法では、約400mg／dlのトリグリセ
リド値で既に測定すべき試料の前希釈が必要であ
つた。 更に、本発明の対象は、本発明の試薬を製造す
る方法である。この方法は、燐タングステン酸を
マグネシウム塩と一緒に適当な溶剤、有利には水
に溶解させることを特徴とする。PH値が主として
使用したマグネシウム塩に左右される溶液が得ら
れる。こうして得られた溶液を即座に本発明に基
づいて使用することができる。場合によりカセイ
ソーダ溶液を加えることによつて別のPH値に調整
することができる。タングステン酸とマグネシウ
ム塩を別々に溶解しかつ引続き得られた溶液を相
互に混合するのが有利である。 本発明の沈殿試薬は燐タングステン酸及びマグ
ネシウムイオンを公知の沈殿試薬よりも著しく低
い濃度で含有しているので、第一に従来公知の燐
タングステン酸塩／マグネシウムイオンを用いる
沈殿法における場合よりも著しく大量の試料に添
加することができる。このことは、本発明の沈殿
法では直接希釈剤を使用することができるという
利点を提供する。希釈剤を使用することは公知の
如く、特に試験法の実用性に関して、例えば大き
な時間的倹約、改善された精密度、減少せしめら
れた材料使用等について顕著な利点を提供する。
試料及び沈殿試薬の手による調量を行なう必要が
ないので、ミスを犯す可能性が決定的に減少せし
められる。容量を精確に測定することができる。
従つて、アポ―Ｂ含有リポプロテインの沈殿、ひ
いては後続のHDL―コレステリン測定の精度が
著しく高められる。沈殿バツチの総容量における
沈殿試薬の容量配分が大きくなるにつれ、希釈剤
を使用することによるHDL―コレステリン測定
を自動化する際に一方のバツチから別のバツチへ
の進行妨害の問題が一層少なくなる。 総容量における沈殿試薬の容量配分の限界は、
遠心分離上澄み内の測定すべきHDL―パラメー
タの引続いての測定を行なうための方法の鋭敏度
によつて規定される。測定される個々の場合にと
つて最も望ましい試料／試薬比は、当業者にとつ
て数回の前実験によつて確認することができる。
１／２〜1/20の試料／試薬比が、HDLｇパラメータ
を測定するための従来公知の方法にとつて有利で
あることが立証された。 沈殿試薬の至適濃度も、数回の前実験によつて
容易に確認することができる。試料／試薬比1/2
では、燐タングステン酸1.8〜1.9ｇ／、有利に
は1.84ｇ／及びマグネシウムイオン25ミリモ
ル／を含有する沈殿試薬が特に適当であること
が判明した。試料１容量部に試薬2.5容量部を加
える場合には、燐タングステン酸1.4〜1.5ｇ／
、有利には1.47ｇ／及びマグネシウムイオン
20ミリモル／が特に有利である。試料／試薬の
比が１／20である場合には、燐タングステン酸
0.25〜0.35ｇ／、有利には0.306ｇ／及びマグ
ネシウムイオン4.16ミリモル／を有する沈殿試
薬を使用するのが有利である。 血清又は血漿試料の多くのものはトリグリセリ
ド含量が高ければ清澄な沈殿上澄みを生じないか
又はその沈殿物は遠心分離後に浮遊することが公
知である。この欠点を排除するには、このような
試料は前希釈する必要がある。このように前希釈
した試料はアポ―Ｂ含有リポプロテインの沈殿後
にHDL―コレステリン酸に関して低すぎる値を
もたらすことが公知である。アポ―β含有リポプ
ロテインの沈殿時にHDLの部分的共沈が行なわ
れる。本発明の沈殿試薬を使用すれば、既述のよ
うに、試料の前希釈は、従来公知の沈殿法を使用
する際よりもトリグリセリド含量が高い場合に初
めて必要である。この前希釈した試料において認
められるHDLの共沈は、沈殿試薬又は試料の希
釈剤（水又は生理食塩水）に適当な洗浄剤を添加
することにより阻止することができる。本発明に
おける洗浄剤としては、特に非イオン性及び陰イ
オン性洗浄剤が適当である。非イオン性洗浄剤と
しては、特にポリオキシエチレンラウリルエーテ
ル、アルキルアリールエーテル、ポリオキシエチ
ル化オクチルフエノール、ヒドロキシポリエトキ
シドデカンが適当である。陰イオン性洗浄剤とし
ては、例えばテトラナトリウム―Ｎ―（１，２―
ジカルボンキシエチル）―Ｎ―オクタデシルスル
ホスクシナメート、ジナトリウム―Ｎ―オクタデ
シルスルホスクシナメート、ナトリウム―ジオク
チルスルホスクシネート及びジナトリウム―ドデ
シルスルホスクシネートのようなスルホスクシナ
メート又はスルホスクシネートのような洗浄剤を
使用することができる。 洗浄剤を沈殿試薬に添加する場合には、非イオ
ン性洗浄剤では0.03〜0.1％及び陰イオン性洗浄
剤では0.1〜0.3％の濃度が特に適当であることが
立証された。洗浄剤を希釈剤に添加する場合、希
釈剤中の洗波剤の濃度は非イオン性洗浄剤では
0.1〜0.5％、陰イオン性洗浄剤では0.3〜１％であ
る。 次に実施例で本発明を詳細に説明する。 例 １ １ 沈殿試薬の製造 燐タングステン酸1.84ｇを蒸留水500mlで溶か
し、塩化マグネシウム・6H2O 5.08ｇを蒸留水
500mlで溶かす。両者の溶液を相互に混合する。
この試薬は即座に使用可能である。 ２ アポ―Ｂ含有リポプロテインの沈殿 試料0.5mlを沈殿試薬１mlと混合する。1500ｇ
で５〜10分間遠心分離した後に、全てのアポ―β
含有リポプロテインが沈殿物として遠心分離器の
底に沈積した。清澄な沈殿上澄みはHDLを含有
する。沈殿物上澄み内で、例えばHDL―コレス
テリンを酵素コレステリン試験で測定することが
できる。 ３ HDL―コレステリン測定 沈殿上澄み0.2mlに、以下の成分から成る、コ
レステリン測定用の試薬溶液を加える。 燐酸塩緩衝剤（PH＝7.8） 0.2モル ４―アミノフエナゾン １ミリモル／ ３，４―ジクロルフエノール ５ミリモル／ 脂肪アルコールポリグリコールエーテル 0.48％ コレステリンエステラーゼ 0.1U／ml コレステリンオキシダーゼ 0.14U／ml ペルオキシダーゼ 0.12U／ml 室温で20分間放置した後、試料の546nmでの吸
光度を常法で試薬の空値に対して測定する。 計算は係数：HDL―コレステリンmg／dl＝
302.2×△E試料で行なう。 第２表には、前記方法に基づいて試料／本発明
の沈殿試薬の比1.0／2.0を用いて得られた値が、
前記第９頁に述べた別の沈殿法に基づいて試料／
公知沈殿試薬の比1.0／01を用いて得られた値
（＝33.5mg／dl）に対して示されている。第２
図から、両者の方法で得られた値が良好に一致し
ていることが明らかである。 例 ２ 試料／沈殿試薬の比１／2.5でのアポ−Ｂ含有
リポプロテインの沈殿 例１の１に記載の沈殿試薬を水で４＋１の割合
で希釈する。こうして製造された試薬は、燐タン
グステン酸1.47ｇ／及び塩化マグネシウム・
6H2O 20ミリモル／を含有する。 試料（血清、血漿）0.2mlを希釈した沈殿試薬
0.5mlと混合する。1500ｇで５〜10分間遠心分離
した後、清澄な沈殿上澄みが得られ、これを例３
に相応してコレステリン測定のためにコレステリ
ン試験に使用することができる。 ここに記載の方法で得られたHDL―コレステ
リン値も、公知方法に基づいて得られた値に良好
に一致する。 例 ３ 試料／沈殿試薬の比１／20でのアポ−Ｂ含有リ
ポプロテインの沈殿、引続いての高精度のコレス
テリン試験でのHDL―コレステリン測定 例１の１に記載の沈殿試薬を水で１＋５の割合
で希釈する。燐タングステン酸0.306ｇ／及び
塩化マグネシウム・6H2O 4.16ミリモル／を有
する試験が得られる。 試料（血清、血漿）0.05mlを希釈した沈殿試薬
１mlと混合しかつ1500ｇで５〜10分間遠心分離す
る。 透明な沈殿上澄み0.2mlを以下の試薬溶液２ml
と混合する： 燐酸塩緩衝剤（PH＝7.7） 0.4モル／ ２，４―ジクロルフエノールスルホン酸
2.5ミリモル ４―アミノフエナゾン １ミリモル／ メタノール 1.85モル／ ヒドロキシポリエトキシドデカン 0.2％ コレステリンエステラーゼ 0.2U／ml コレステリンオキシダーゼ 0.1U／ml ペルオキシダーゼ 0.1U／ml 室温で15分間放置した後、試料の546nｍでの
吸光度を試薬の空値に対して測定する。評価に試
料と同様に処理したコレステリン標準値に基づい
て行なう。 第２表には、ここに記載した方法で種々の血清
試料から、HDL―コレステリンに関して得られ
た値が、試料／試薬の比１：２（例１参照）で沈
殿させた後に得られた値に対比させてある。
を用いてアポ―Ｂ含有リポプロテインを沈殿させ
かつ沈殿物を遠心分離する場合には、公知の沈殿
試薬を用いる場合よりも著しく高い脂質（トリグ
リセリド）含量の際に初めて支障が生じることを
示している。このことは従来公知の燐タングステ
ン酸塩／マグネシウム塩沈殿とは異なり付加的な
利点をもたらす、即ち沈殿試薬の添加前の脂質性
試料の希釈は極めて高いトリグリセリド値におい
て初めて必要である（1000mg／dl以上）。従来記
載された沈殿法では、約400mg／dlのトリグリセ
リド値で既に測定すべき試料の前希釈が必要であ
つた。 更に、本発明の対象は、本発明の試薬を製造す
る方法である。この方法は、燐タングステン酸を
マグネシウム塩と一緒に適当な溶剤、有利には水
に溶解させることを特徴とする。PH値が主として
使用したマグネシウム塩に左右される溶液が得ら
れる。こうして得られた溶液を即座に本発明に基
づいて使用することができる。場合によりカセイ
ソーダ溶液を加えることによつて別のPH値に調整
することができる。タングステン酸とマグネシウ
ム塩を別々に溶解しかつ引続き得られた溶液を相
互に混合するのが有利である。 本発明の沈殿試薬は燐タングステン酸及びマグ
ネシウムイオンを公知の沈殿試薬よりも著しく低
い濃度で含有しているので、第一に従来公知の燐
タングステン酸塩／マグネシウムイオンを用いる
沈殿法における場合よりも著しく大量の試料に添
加することができる。このことは、本発明の沈殿
法では直接希釈剤を使用することができるという
利点を提供する。希釈剤を使用することは公知の
如く、特に試験法の実用性に関して、例えば大き
な時間的倹約、改善された精密度、減少せしめら
れた材料使用等について顕著な利点を提供する。
試料及び沈殿試薬の手による調量を行なう必要が
ないので、ミスを犯す可能性が決定的に減少せし
められる。容量を精確に測定することができる。
従つて、アポ―Ｂ含有リポプロテインの沈殿、ひ
いては後続のHDL―コレステリン測定の精度が
著しく高められる。沈殿バツチの総容量における
沈殿試薬の容量配分が大きくなるにつれ、希釈剤
を使用することによるHDL―コレステリン測定
を自動化する際に一方のバツチから別のバツチへ
の進行妨害の問題が一層少なくなる。 総容量における沈殿試薬の容量配分の限界は、
遠心分離上澄み内の測定すべきHDL―パラメー
タの引続いての測定を行なうための方法の鋭敏度
によつて規定される。測定される個々の場合にと
つて最も望ましい試料／試薬比は、当業者にとつ
て数回の前実験によつて確認することができる。
１／２〜1/20の試料／試薬比が、HDLｇパラメータ
を測定するための従来公知の方法にとつて有利で
あることが立証された。 沈殿試薬の至適濃度も、数回の前実験によつて
容易に確認することができる。試料／試薬比1/2
では、燐タングステン酸1.8〜1.9ｇ／、有利に
は1.84ｇ／及びマグネシウムイオン25ミリモ
ル／を含有する沈殿試薬が特に適当であること
が判明した。試料１容量部に試薬2.5容量部を加
える場合には、燐タングステン酸1.4〜1.5ｇ／
、有利には1.47ｇ／及びマグネシウムイオン
20ミリモル／が特に有利である。試料／試薬の
比が１／20である場合には、燐タングステン酸
0.25〜0.35ｇ／、有利には0.306ｇ／及びマグ
ネシウムイオン4.16ミリモル／を有する沈殿試
薬を使用するのが有利である。 血清又は血漿試料の多くのものはトリグリセリ
ド含量が高ければ清澄な沈殿上澄みを生じないか
又はその沈殿物は遠心分離後に浮遊することが公
知である。この欠点を排除するには、このような
試料は前希釈する必要がある。このように前希釈
した試料はアポ―Ｂ含有リポプロテインの沈殿後
にHDL―コレステリン酸に関して低すぎる値を
もたらすことが公知である。アポ―β含有リポプ
ロテインの沈殿時にHDLの部分的共沈が行なわ
れる。本発明の沈殿試薬を使用すれば、既述のよ
うに、試料の前希釈は、従来公知の沈殿法を使用
する際よりもトリグリセリド含量が高い場合に初
めて必要である。この前希釈した試料において認
められるHDLの共沈は、沈殿試薬又は試料の希
釈剤（水又は生理食塩水）に適当な洗浄剤を添加
することにより阻止することができる。本発明に
おける洗浄剤としては、特に非イオン性及び陰イ
オン性洗浄剤が適当である。非イオン性洗浄剤と
しては、特にポリオキシエチレンラウリルエーテ
ル、アルキルアリールエーテル、ポリオキシエチ
ル化オクチルフエノール、ヒドロキシポリエトキ
シドデカンが適当である。陰イオン性洗浄剤とし
ては、例えばテトラナトリウム―Ｎ―（１，２―
ジカルボンキシエチル）―Ｎ―オクタデシルスル
ホスクシナメート、ジナトリウム―Ｎ―オクタデ
シルスルホスクシナメート、ナトリウム―ジオク
チルスルホスクシネート及びジナトリウム―ドデ
シルスルホスクシネートのようなスルホスクシナ
メート又はスルホスクシネートのような洗浄剤を
使用することができる。 洗浄剤を沈殿試薬に添加する場合には、非イオ
ン性洗浄剤では0.03〜0.1％及び陰イオン性洗浄
剤では0.1〜0.3％の濃度が特に適当であることが
立証された。洗浄剤を希釈剤に添加する場合、希
釈剤中の洗波剤の濃度は非イオン性洗浄剤では
0.1〜0.5％、陰イオン性洗浄剤では0.3〜１％であ
る。 次に実施例で本発明を詳細に説明する。 例 １ １ 沈殿試薬の製造 燐タングステン酸1.84ｇを蒸留水500mlで溶か
し、塩化マグネシウム・6H2O 5.08ｇを蒸留水
500mlで溶かす。両者の溶液を相互に混合する。
この試薬は即座に使用可能である。 ２ アポ―Ｂ含有リポプロテインの沈殿 試料0.5mlを沈殿試薬１mlと混合する。1500ｇ
で５〜10分間遠心分離した後に、全てのアポ―β
含有リポプロテインが沈殿物として遠心分離器の
底に沈積した。清澄な沈殿上澄みはHDLを含有
する。沈殿物上澄み内で、例えばHDL―コレス
テリンを酵素コレステリン試験で測定することが
できる。 ３ HDL―コレステリン測定 沈殿上澄み0.2mlに、以下の成分から成る、コ
レステリン測定用の試薬溶液を加える。 燐酸塩緩衝剤（PH＝7.8） 0.2モル ４―アミノフエナゾン １ミリモル／ ３，４―ジクロルフエノール ５ミリモル／ 脂肪アルコールポリグリコールエーテル 0.48％ コレステリンエステラーゼ 0.1U／ml コレステリンオキシダーゼ 0.14U／ml ペルオキシダーゼ 0.12U／ml 室温で20分間放置した後、試料の546nmでの吸
光度を常法で試薬の空値に対して測定する。 計算は係数：HDL―コレステリンmg／dl＝
302.2×△E試料で行なう。 第２表には、前記方法に基づいて試料／本発明
の沈殿試薬の比1.0／2.0を用いて得られた値が、
前記第９頁に述べた別の沈殿法に基づいて試料／
公知沈殿試薬の比1.0／01を用いて得られた値
（＝33.5mg／dl）に対して示されている。第２
図から、両者の方法で得られた値が良好に一致し
ていることが明らかである。 例 ２ 試料／沈殿試薬の比１／2.5でのアポ−Ｂ含有
リポプロテインの沈殿 例１の１に記載の沈殿試薬を水で４＋１の割合
で希釈する。こうして製造された試薬は、燐タン
グステン酸1.47ｇ／及び塩化マグネシウム・
6H2O 20ミリモル／を含有する。 試料（血清、血漿）0.2mlを希釈した沈殿試薬
0.5mlと混合する。1500ｇで５〜10分間遠心分離
した後、清澄な沈殿上澄みが得られ、これを例３
に相応してコレステリン測定のためにコレステリ
ン試験に使用することができる。 ここに記載の方法で得られたHDL―コレステ
リン値も、公知方法に基づいて得られた値に良好
に一致する。 例 ３ 試料／沈殿試薬の比１／20でのアポ−Ｂ含有リ
ポプロテインの沈殿、引続いての高精度のコレス
テリン試験でのHDL―コレステリン測定 例１の１に記載の沈殿試薬を水で１＋５の割合
で希釈する。燐タングステン酸0.306ｇ／及び
塩化マグネシウム・6H2O 4.16ミリモル／を有
する試験が得られる。 試料（血清、血漿）0.05mlを希釈した沈殿試薬
１mlと混合しかつ1500ｇで５〜10分間遠心分離す
る。 透明な沈殿上澄み0.2mlを以下の試薬溶液２ml
と混合する： 燐酸塩緩衝剤（PH＝7.7） 0.4モル／ ２，４―ジクロルフエノールスルホン酸
2.5ミリモル ４―アミノフエナゾン １ミリモル／ メタノール 1.85モル／ ヒドロキシポリエトキシドデカン 0.2％ コレステリンエステラーゼ 0.2U／ml コレステリンオキシダーゼ 0.1U／ml ペルオキシダーゼ 0.1U／ml 室温で15分間放置した後、試料の546nｍでの
吸光度を試薬の空値に対して測定する。評価に試
料と同様に処理したコレステリン標準値に基づい
て行なう。 第２表には、ここに記載した方法で種々の血清
試料から、HDL―コレステリンに関して得られ
た値が、試料／試薬の比１：２（例１参照）で沈
殿させた後に得られた値に対比させてある。
【表】
例 ４
洗浄剤含有沈殿剤を用いたアポ―Ｂ含有リポプ
ロテインの沈殿 例１の１に記載の沈殿試薬100mlにテトラナト
リウム―Ｎ―（１，２―ジカルボキシエチル）―
Ｎ―オクタデシルスルホスクシナメートの30％の
水溶液0.5mlを加える。 水で１／１に希釈した試料0.5mlを洗浄剤含有
沈殿試薬と混合する。遠心分離（1500ｇで５〜10
分間）後、HDL―コレステリンを測定すること
ができる清澄な沈殿上澄みが得られる。 第３表には、希釈した試料と希釈しなかつた試
料に関する、沈殿剤に洗浄剤を添加した場合と添
加しなかつた場合とに得られたHDL―コレステ
リン値がまとめられている。
ロテインの沈殿 例１の１に記載の沈殿試薬100mlにテトラナト
リウム―Ｎ―（１，２―ジカルボキシエチル）―
Ｎ―オクタデシルスルホスクシナメートの30％の
水溶液0.5mlを加える。 水で１／１に希釈した試料0.5mlを洗浄剤含有
沈殿試薬と混合する。遠心分離（1500ｇで５〜10
分間）後、HDL―コレステリンを測定すること
ができる清澄な沈殿上澄みが得られる。 第３表には、希釈した試料と希釈しなかつた試
料に関する、沈殿剤に洗浄剤を添加した場合と添
加しなかつた場合とに得られたHDL―コレステ
リン値がまとめられている。
【表】
第３表に記載の測定値から、希釈した試料にお
いて洗浄剤を添加しなければ得られるHDL―コ
レステリン値は低すぎるが、この誤差は洗浄剤を
添加することによつて補償することができること
が明らかである。 類似した結果は、前記の例においてテトラナト
リウム―Ｎ―（１，２―ジカルボキシエチル）―
Ｎ―オクタデシルスルホシクシナメートの代り
に、その他の非イオン性もしくは陰イオン洗浄
剤、例えば ヒドロキシポリエトキシドデシル（Thesit） ポリオキシエチレンラウリルエーテル
（Brij35） ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテル
（Triton―Ｘ―100） を沈殿試薬に添加した場合にも得られる（第４表
参照）。この場合には、前記洗浄剤は沈殿試薬の
PH範囲が低ければ溶解性が低いために、そのPH値
を、有利にはカセイソーダ溶液を添加することに
よつて高めた。
いて洗浄剤を添加しなければ得られるHDL―コ
レステリン値は低すぎるが、この誤差は洗浄剤を
添加することによつて補償することができること
が明らかである。 類似した結果は、前記の例においてテトラナト
リウム―Ｎ―（１，２―ジカルボキシエチル）―
Ｎ―オクタデシルスルホシクシナメートの代り
に、その他の非イオン性もしくは陰イオン洗浄
剤、例えば ヒドロキシポリエトキシドデシル（Thesit） ポリオキシエチレンラウリルエーテル
（Brij35） ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテル
（Triton―Ｘ―100） を沈殿試薬に添加した場合にも得られる（第４表
参照）。この場合には、前記洗浄剤は沈殿試薬の
PH範囲が低ければ溶解性が低いために、そのPH値
を、有利にはカセイソーダ溶液を添加することに
よつて高めた。
【表】
例 ５
洗浄剤含有希釈剤で試料を希釈した後のアポ―
Ｂ含有リポプロテインの沈殿 水100mlにテトラナトリウム―Ｎ―（１，２―
ジカルボキシエチル）―Ｎ―オクタデシルスルホ
スクシナメートの30％の溶液1.25mlを加える。 試料（血清、血漿）0.5mlを洗浄剤含有水0.5ml
と混合する。この混合物0.5mlに、例１の１に記
載の沈殿試薬１mlを加える。1500ｇで５〜10分間
遠心分離した後に、清澄な沈殿上澄みが得られ
る。 第５表には、希釈しなかつた血清試料、水だけ
で希釈した血清試料及び洗浄剤含有水で希釈した
血清試料に関して得られたHDL―コレステリン
値がまとめられている。
Ｂ含有リポプロテインの沈殿 水100mlにテトラナトリウム―Ｎ―（１，２―
ジカルボキシエチル）―Ｎ―オクタデシルスルホ
スクシナメートの30％の溶液1.25mlを加える。 試料（血清、血漿）0.5mlを洗浄剤含有水0.5ml
と混合する。この混合物0.5mlに、例１の１に記
載の沈殿試薬１mlを加える。1500ｇで５〜10分間
遠心分離した後に、清澄な沈殿上澄みが得られ
る。 第５表には、希釈しなかつた血清試料、水だけ
で希釈した血清試料及び洗浄剤含有水で希釈した
血清試料に関して得られたHDL―コレステリン
値がまとめられている。
【表】
得られた測定データから、予め希釈した試料に
おいて低すぎるHDL―コレステリン値は、既に
希釈に非イオン性もしくは陰イオン性の洗浄剤を
添加することによつても回避することができるこ
とが明らかである。
おいて低すぎるHDL―コレステリン値は、既に
希釈に非イオン性もしくは陰イオン性の洗浄剤を
添加することによつても回避することができるこ
とが明らかである。
第１図は、燐タングステン酸1.84ｇ／及び塩
化マグネシウム・6H2O25ミリモル／でアポ―
Ｂ含有リポプロテインを沈殿させた（試料／試薬
＝1.0／2.0）後のHDL―コレステリン値のPH値依
存性を示す図、第２図は試料／本発明の沈殿試薬
比＝1.0／2.0（沈殿法1.0／2.0、方法Ｙ）と、試
料／公知沈殿試薬比＝1.0／0.1（沈殿法1.0／0.1、
方法Ｘ）とでアポ―Ｂ含有リポプロテインを沈殿
した後に得られたHDL―コレステリン値の比較
を示す図である。
化マグネシウム・6H2O25ミリモル／でアポ―
Ｂ含有リポプロテインを沈殿させた（試料／試薬
＝1.0／2.0）後のHDL―コレステリン値のPH値依
存性を示す図、第２図は試料／本発明の沈殿試薬
比＝1.0／2.0（沈殿法1.0／2.0、方法Ｙ）と、試
料／公知沈殿試薬比＝1.0／0.1（沈殿法1.0／0.1、
方法Ｘ）とでアポ―Ｂ含有リポプロテインを沈殿
した後に得られたHDL―コレステリン値の比較
を示す図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 水溶液中に燐タングステン酸0.2〜３ｇ／
及びマグネシウムイオン２ミリモル／より多く
を含有することを特徴とするアポ―Ｂ含有リポプ
ロテインを沈殿させる試薬。 ２ 燐タングステン酸0.25〜２ｇ／及びマグネ
シウムイオン４〜25ミリモル／を含有する、特
許請求の範囲第１項記載の試薬。 ３ PH値２〜８を有する、特許請求の範囲第１項
又は第２項記載の試薬。 ４ 付加的に非イオン性もしくは陰イオン性洗浄
剤を含有する、特許請求の範囲第１項から第３項
までのいずれか１項に記載の試薬。 ５ 非イオン性洗浄剤として、 ポリオキシエチレンラウリルエーテル、 ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテ
ル、 ポリオキシエチル化オクチルフエノール、 ヒドロキシポリエトキシドデカン をかつ陰イオン性洗浄剤として、 テトラナトリウム―Ｎ―（１，２―ジカルボキ
シエチル）―Ｎ―オクタデシルスルホスクシナメ
ート、 ジナトリウム―Ｎ―オクタデシルスルホスクシ
ナメート、 ナトリウム―ジオクチルスルホスクシネート ジナトリウム―ドデシルスルホスクシネート を使用する、特許請求の範囲第４項記載の試薬。 ６ 洗浄剤を0.03〜0.3％の濃度で含有する、特
許請求の範囲第４項又は第５項記載の試薬。 ７ 水溶液中に燐タングステン酸0.2〜３ｇ／
及びマグネシウムイオン２ミリモル／より多く
を含有するアポ―Ｂ含有リポプロテインを沈殿さ
せる試薬を製造する方法において、燐タングステ
ン酸及び適当なマグネシウム塩を水中に溶かしか
つ２〜８の所望のPH値に調整することを特徴とす
る、アポ―Ｂ含有リポプロテインを沈殿させる試
薬の製法。 ８ 燐タングステン酸とマグネシウム塩を別々に
水に溶かしかつ引続き両者の溶液を相互に混合す
る、特許請求の範囲第７項記載の方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19813117455 DE3117455A1 (de) | 1981-05-02 | 1981-05-02 | Reagens zur praezipitation apo-b-haltiger lipoproteine, verfahren zu dessen herstellung und dessen verwendung bei der bestimmung von hdl-cholesterin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS57186171A JPS57186171A (en) | 1982-11-16 |
| JPH0139553B2 true JPH0139553B2 (ja) | 1989-08-22 |
Family
ID=6131335
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57073506A Granted JPS57186171A (en) | 1981-05-02 | 1982-05-04 | Reagent precipitating riboprotein containing apo-b, its manufacture and method of precipitating riboprotein containing apo-b by using said reagent |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4521519A (ja) |
| EP (1) | EP0064665B1 (ja) |
| JP (1) | JPS57186171A (ja) |
| AT (1) | ATE12699T1 (ja) |
| CA (1) | CA1192822A (ja) |
| DD (1) | DD203154A5 (ja) |
| DE (2) | DE3117455A1 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0648044U (ja) * | 1992-11-26 | 1994-06-28 | 三菱樹脂株式会社 | メモリカード読み書き装置 |
| EP2065708A1 (en) | 2007-11-28 | 2009-06-03 | Fujifilm Corporation | Method for measuring high-density lipoprotein cholesterol |
| EP2108961A1 (en) | 2008-04-10 | 2009-10-14 | Fujifilm Corporation | Dry analytical element for measurement of high density lipoprotein cholesterol |
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|---|---|---|---|---|
| EP0174478B1 (de) * | 1981-09-10 | 1991-12-11 | B. Braun Holding AG | Verfahren zur selektiven extrakorporalen Präzipitation von Low Density Lipoproteinen aus Vollserum oder Plasma |
| DE3215310A1 (de) * | 1982-04-23 | 1983-10-27 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur bestimmung der low density lipoproteine (ldl) und reagenz zu seiner durchfuehrung |
| US5149501A (en) * | 1990-01-29 | 1992-09-22 | Cirrus Diagnostics, Inc. | Multichambered container and instrument for performing diagnostic tests |
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| JP2600065B2 (ja) * | 1994-03-08 | 1997-04-16 | 協和メデックス株式会社 | 高密度リポ蛋白中のコレステロールの定量法 |
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| US5770451A (en) * | 1995-03-30 | 1998-06-23 | Streck Laboratories, Inc. | Liquid lipoprotein control |
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| US7544515B2 (en) * | 2002-12-06 | 2009-06-09 | Denka Seiken Co., Ltd. | Method of quantifying small-sized low density lipoprotein |
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| EP2455760B1 (en) * | 2009-07-15 | 2016-04-13 | Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd. | Analysis reagent and analysis device having the analysis reagent carried therein |
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|---|---|---|---|---|
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| US4226713A (en) * | 1978-04-24 | 1980-10-07 | Goldberg Jack M | Diagnostic agents |
| US4215993A (en) * | 1978-12-04 | 1980-08-05 | Data Medical Associates, Inc. | Precipitating reagent and method for isolation and determination of high density lipoproteins in human serum |
| US4210557A (en) * | 1978-12-15 | 1980-07-01 | Beckman Instruments, Inc. | Non-high density lipoprotein precipitant |
| DE2944138A1 (de) * | 1979-11-02 | 1981-06-11 | Technicon Gmbh, 6368 Bad Vilbel | Verfahren und vorrichtung zur durchfuehrung von analysen in automatischen analysensystemen unter abtrennung von niederschlaegen |
-
1981
- 1981-05-02 DE DE19813117455 patent/DE3117455A1/de not_active Withdrawn
-
1982
- 1982-04-19 US US06/369,382 patent/US4521519A/en not_active Expired - Lifetime
- 1982-04-27 EP EP82103570A patent/EP0064665B1/de not_active Expired
- 1982-04-27 DE DE8282103570T patent/DE3262945D1/de not_active Expired
- 1982-04-27 AT AT82103570T patent/ATE12699T1/de not_active IP Right Cessation
- 1982-04-29 CA CA000401988A patent/CA1192822A/en not_active Expired
- 1982-04-30 DD DD82239482A patent/DD203154A5/de not_active IP Right Cessation
- 1982-05-04 JP JP57073506A patent/JPS57186171A/ja active Granted
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| CLIN CHEM=1979 * |
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| EP2108961A1 (en) | 2008-04-10 | 2009-10-14 | Fujifilm Corporation | Dry analytical element for measurement of high density lipoprotein cholesterol |
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|---|---|
| DD203154A5 (de) | 1983-10-12 |
| EP0064665B1 (de) | 1985-04-10 |
| EP0064665A1 (de) | 1982-11-17 |
| ATE12699T1 (de) | 1985-04-15 |
| DE3117455A1 (de) | 1982-11-25 |
| DE3262945D1 (en) | 1985-05-15 |
| JPS57186171A (en) | 1982-11-16 |
| US4521519A (en) | 1985-06-04 |
| CA1192822A (en) | 1985-09-03 |
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