JPH01320985A - 生理活性物質の固定化法および固定化生理活性物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は生理活性物質の固定化法および固定化生理活性
物質に関するものである。さらに詳しくは新規な架橋剤
を用いることにより担体に多量の生理活性物質を安定に
固定化する方法およびそうして作られた固定化生理活性
物質に関するものである。

（従来の技術） 酵素・抗体・ホルモン、レセプター・阻害剤等の生理活
性物質を不溶性担体に固定して得た固定化生理活性物質
は、バイオリアクター、バイオセンサー、アフィニティ
ークロマト用材料などとして医薬品・食品・化学薬品の
製造、臨床診断・治療等に広く用いられている。現在知
られている生理活性物質の固定化法は、大別すると■担
体と生理活性物質を共有結合により固定化する方法■担
体表面あるいは内部で生理活性物質どうしを共有結合さ
せて不溶化する方法■静電引力・疎水性相互作用又は担
体による包括などの共有結合以外の手段によって生理活
性物質を担体に固定化する方法の３つがある。しかし、
いずれの方法もまだ解決すべき問題点が多く存在し、満
足できるものでは無い、すなわち、上記■の方法におい
ては生理活性物質の脱離による活性の低下が起こりやす
く、■、■に於ては固定化の工程が複雑であったり、共
有結合の形成による生理活性物質の低下が起こったりし
て工業用などに用いるには問題があった。

（発明が解決しようとする課題） 固定化生理活性物質が備えるべき条件としては、担体に
対して多量の生理活性物質が固定化されていて高活性で
あること、使用中に生理活性物質の脱離が少なく活性の
低下が少ないことなどが挙げられる。しかしながら従来
の共有結合を利用した固定化法において用いられる架橋
剤は、グルタルアルデヒド、ジイソシアネート等の少数
に限られており新規な架橋剤の利用はほとんどなされて
いない。

本発明の目的はしたがって、生理活性物質の固定化に新
規な架橋剤を用いることによって一段階の反応操作で生
理活性物質を多量かつ安定に固定化する方法および活性
の高い固定化生理活性物質を提供することである。

（課題を解決するための手段） 本発明のこれらの目的は、担体の存在下、−Ｉｎ式日）
で表わされる化合物と生理活性物質を反応させることを
特徴とする生理活性物質の固定化法およびそれによって
得られた固定化生理活性物質により達成された。

（−線式■） ｘ’−ｓｏ、−ｔ、−ｓｏｗ−ｘ” 上記−綴代中、ＸｌおよびＸＩは−ＣＨ＝　ＣＩ＋　。

または−ＣＨ□ｃｒｔｉ−ｙのいずれかであり、ＸＩお
よびＸｔは同じであっても異なってもよい。Ｙは求核試
薬（求核性基）によって置換されるか、塩基によってＨ
ＹＯ形で脱離し得る基を表わす。

Ｌは２価の連結基であり、置換されていてもよい。

以下に本発明で用いる素材について詳細に説明する。

本発明で用いる担体は、水に不溶性の物質であり、その
形態は粒子、繊維、膜、中空糸など何であっても良く、
上記一般式（１）で表わされる化合物と反応する基（例
えばアミン基）を持っていてもあるいは持っていなくて
も良い。−線式（Ｉ）で表わされる化合物と反応する基
を有する担体を用いた場合、生理活性物質は一般式（＋
）の化合物を介して担体と化学結合することにより担体
上に固定される。また−線式（１）で表わされる化合物
と反応する基を持たない１）体を用いた場合には、生理
活性物質どうしが一般式（１）表わされる化合物によっ
て架橋され担体表面にからみつくように固着することに
よって固定化されるものと思われる。

このような担体の材質としては例えば次の様なものが挙
げられるがこれらに限定されるものでは無い。

１、多Ｐ！類系 アガロース、セルロース、デキストラン、カードラン、
キチン、キトサン、プルラン、グルコマンナンなどおよ
びその誘導体。

２、合成高分子 ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリ
レート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニルクロ
ライド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスルホン
、ポリウレタン、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリビ
ニルアルコール、架橋ポリヒドロキシエチルメタクリレ
ート、エチレン−ビニルアルコール共重合体、ナイロン
、ポリエステル、ポリアミド、ポリイミド、など。

３、無機物 シリカゲル、セラミックスなど。

担体は生理活性物質に対して乾燥ｍｕで１倍から１００
０倍好ましくは３倍〜１００倍の範囲で用いられる。

本発明によって固定化される生理活性物質は、酵素、補
酵素、抗体ホルモン、レセプター、レクチン、疎外剤等
である。酵素としては、例えばトリブシン、キモトリプ
シン、サーモライシン、パパイン、アスパラギナーゼ、
リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、リゾチーム、ウレ
アーゼなどの加水分解酵素、アルコールデヒドロゲナー
ゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、
アルデヒドデヒドロゲナーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダー
ゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、スーパーオキシド
ディスムターゼなどの酸化還元酵素、ヘキソキナーゼ、
クレアチンキナーゼ、アラエントランスアミドナーゼな
どの転移酵素、フマラーゼ、アスパルテートアンモニア
リアーゼ、スレオニンアルドラーゼ、ピルビン酸デカル
ボキシラーゼなどのリアーゼ、グルコースリン酸イソメ
ラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼなどの異性化酵
素、グルタミンシンセターゼ、アセチルＣｏＡカルボキ
シラーゼ、ＤＮＡリガーゼなどのりガーゼ等をあげるこ
とができる。その他の生理活性物質としてはＮｈ−（ｂ
−アミンヘキシル）　−ＡＭＰなどの補酵素誘導体免疫
グロブリンおよびそのＦａｂフラグメント、プロティン
Ａ等のベタテリアルＦｃレセプター、コンカナバリンＡ
や小麦胚芽アグルチニンなどのレクチン、大豆トリプシ
ン、インヒビターなどの阻害剤、フェニルアラニン、ト
リプトファンなどのアミノ酸などがあげられる。

次に一般式Ｉで表わされる本発明の架橋剤につしてさら
に詳細に説明する。Ｘｌ、Ｘ２は−ＣＨ−ＣＨ，あるい
は−ＣＨｚＣＨｇ−Ｙ　（Ｙは求核試薬あるいは塩基の
作用によって、置換されるか脱離する基）を表わし、そ
の好ましい具体例としは例えば以下のものを挙げること
ができる。

−ｃｕ＝ｃｕｚ、　　　　　　−Ｃ１ｈＣＩｂ−ＣＩ−
Ｃ１）□Ｃ１），−Ｂｒ、　　　　　−Ｃ１ｌＩＣ１ｌ
□−０３Ｏ□Ｃ１）ｆｆ−ＣＨ，ＣＨｚ−ＯＳＯ，ＣＪ
ｓ、　　−ＣＨｚＣＨｚ−Ｏ５（ｈｃＪ４−ＣＨｓ−Ｃ
ＬＣＩＩｚ−Ｏ３ＯＪａ、　　　　−ＣＩＩｘＣＬ−Ｏ
ＳＯＪ−ＣｌｂＣＨｇ−ＯＣＯＣＩｌｉ、　　　−Ｃ１
ｈＣＩｂ−ＱＣＯＣＦ３−Ｃ１，Ｃ１，〜０ＣＯＣＩＩ
Ｃ１ｘ これらの中でも、特に −ＣＨ＝ＣＨ宏、　　　　　　−ＣＨｔＣＨｔ−ＣＩ−
ＣＨｚＣＨｇ−Ｂｒ、　　　　　　−ＣＨｚＣＨｇ−Ｏ
５ＯｚＣＨｓ−ＣＨｔＣｌｌｇ−Ｏ５ＯＪａ、　　　　
−ＣＨｌＣ）Ｉｔ−Ｏ５Ｏｓにが好ましく、さらに−Ｃ
Ｈ−ＣＨ，が最も好ましい。

２価の連続基りは、アルキレン基（ジクロアルキレン基
を含む）、アリーレン基（複素芳香環基を含む）、また
はこれらの基と、−Ｃ−１−ＮＲ’−１−Ｓ−１−ＳＯ
−１−Ｓ　Ｏ，−１−ＳＯ３−１−３ＯＮＲ’−２−Ｃ
Ｏ−１−ＣＯＯ−１−ＣＯＮＲ’−１−ＮＲ’ＣＯＯ−
１ −ＮＲ’　Ｃ０ＮＲ’−で示される結合を１つあるいは
複数個組み合わせることにより形成される２価の基であ
る。ＲＩは水素原子、または１から１５個の炭素原子を
有するアルキル基、アリール基、アラルキル基を表わす
。またーＮＲ’−１−３ＯＮＲ’−１−ＣＯＮＲ’−１
−ＮＲ’Ｃ○０−１−ＮＲ’Ｃ０ＮＲ’　−で示される
結合を２つ以上含む場合、それらのＲ１同士が結合して
環を形成してもよい、さらにしは置換基を有してもよく
、置換基としては、ヒドロキシ基、アルコキシ基、カル
バモイル基、スルファモイル基、スルホ基またはその塩
、カルボキシル基またはその塩、ハロゲン原子、アルキ
ル基、アラルキル基、アリール基などが例として挙げら
れる。またその置換基は、１つ以上のｘ３−ｓＯＸ−で
表わされる基によってさらに置換されていてもよい。Ｘ
３は前述のＸｌおよびＸ２と同義である。

Ｌの代表的な例としては次のものを挙げることができる
。但し例中のａ　％　ｋは１から６の整数である。ｅの
みは０であってもよく、２または３が好ましい。ａ　ｗ
　ｋのｅを除いたものは１または２が好ましく、ｌが特
に好ましい。式中、Ｒ１は水素原子、炭素数１から６の
アルキル基が好ましく、水素原子、メチル基、メチル基
が特に好ましい。

−（ＣＨｚ）−− −（Ｃｌｈ）ｂ−Ｑ−（ｃｏ、）ｃ−’−（ｃｎ、Ｌ−
Ｃ０ＮＲ’−（ＣＨｚ）ｅ−ＮＲ’Ｃ０−（ＣＨｚ）ｒ
−−（ＣＩｌ□Ｌ−５（ｈ−（ＣＩ（りｋ−ＣＯ−（Ｃ
Ｈり　ｗｌ− 次に本発明で使用する架橋剤の代表的な例を挙げるが、
本発明はこれに限定されない。

（化合物例） １、　　ｃＨｔ　＝　Ｃｌｌ５Ｏ□ｃＨｚｓｏ□ＣＨ＝
Ｃ１）゜２、　　ＣＨ２＝　Ｃ１）ＳＯ□ＣＨ，θＣ１
ｌ□５（ｈｃＩＩ＝ｃｌＩｚ３、　　ＣＩｌ□＝　ＣＨ
３（ｈｃＨｚｃＨｚｃＨｘｓＯ□Ｃｌｌ＝Ｃｌ１寞４、
　　ｃｏｚ＝ｃｕｓｏ□ＣＨｚＣＩＩ（ＯＨ）Ｃ１）Ｓ
Ｏ□ＣＨ＝ＣＨ。

５、　　Ｃｌ１ｚ　＝　Ｃｌｌ５ＯｚＣＨｉＣＯＮＨＣ
ＩＩｚＣＨｚＮＨＣＯＣＨｚＳＯｚＣＨ＝　ＣｕＩ２、
　　Ｃ１ｈ＝Ｃ１）ＳＯｔＣ１ｈＣＯＮＨＣＨｚＣＩｈ
ＣＨｚＮ１）Ｃ：０ＣＩＩ□ＳＯ□Ｃｌ１＝Ｃ１）１「 Ｃ０ＣＨｚＣＨｉＳＯ□ｃｏ＝ｃｔ＋ｚ■　　　　　　
　　エ　　　　　　−　　　　　＋１　　　　　　＋１
これら、本発明で使用する架橋剤の合成法は、例えば特
公昭４７−２４２９号、同５０−３５８０７号、特開昭
４９−２４４３５号、同５３−４１２２１号、同５９−
１８９４４号等の公報に、ハロゲン化銀写真用硬膜剤と
して詳細に記載されている。

本発明に用いられる架橋剤は単独で用いてもよく、本発
明の架橋剤を２種以上混合して用いてもよい、またその
他の公知の架橋剤と併用して用いても差し支えない。

本発明において生理活性物質の固定化に用いる架橋剤の
添加量は、生理活性物質に対して０．０１から２０重重
量、特に好ましくは０．１から１０重重量の範囲である
。

また本発明の架橋剤とともに、蛋白質の架橋反応を促進
する化合物を併用することもできる。

例えば、特開昭５６−４１４１号に記載のスルフィン酸
基を含むポリマーを架橋促進剤として、本発明の架橋剤
と併用することは効果的である。

本発明では固定化に際し、ｐＨ３〜りＨ９，５のバッフ
ァ液を用いるのが好ましい。すなわち、ｐＨ３〜ｐＨ９
，５のバッファ液に担体、生理活性物質および一般式（
ｒ）で表わされる化合物を加えて数時間反応させること
により、生理活性物質を多量かつ安定に含有する活性の
高い固定化生理活性物質を得ることができる。

反応温度は任意であるが、一般に０〜６０℃、特にＬ　
〜ＡＭ　’Ｃの範囲で行うことができる。

（発明の効果） 従来、晟も多く用いられているグルタルアルデヒドによ
る固定化では、グルタルアルデヒドと生理活性物質問に
形成される結合が不安定なため・経時で生理活性物質の
脱落が見られた。

一方、ジイソシアネート型架橋剤による固定化法では、
架橋剤が水に不安定なためが、有効に作ｍしない場合が
あった。

しかし、本発明によると、生成する化学結合は化学的に
安定であり、又、水による架橋剤の分解も少ないため容
易に安定な固定化生理活性物質を調製することができる
。

又、本発明で用いる架橋剤は、二つの活性期間に距離が
ありそれがスペーサーとして働くためか、高い固定化を
持ち、又、高活性な固定化生理活性物質を得ることがで
きる。

（実施例） 次に実施例をあげて本発明を更に詳細に説明するが、本
発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１ 生理活性物質としてサーモライシンを多孔性ポリマービ
ーズ（担体）に次のように固定化した。

サーモライシン（大和化成製、９．２６０．０ＯＯＰｕ
／ｇ）１５０■を氷冷した０、０２５Ｍ　Ｉ−リスバッ
ファー３ｄ（ｐ　ＩＩ？、５．５　ＭのＮａＢｒと１６
．６ｍ　Ｍ　Ｃａ　ＣＩ！　。

を含む）に溶解し、さらに０．３ｇの乾燥したアンバー
ライトＸＡＤ−７樹脂（ローム・アンド・ハース社製の
多孔性ポリマービーズ）を加えた。４℃で一夜ゆっくり
振とう後、化合物例の６に示した架橋剤を８．５ａ＋＋
ｒ添加し４℃で３時間振とうして反応させた。その後０
．ＩＭＦリスバッファーｐＨ７，５，５ｍＭ　Ｃａ　Ｃ
１ｚを含む）で洗浄して固定化されなかったサーモライ
シンを取り除いた。

比較のために、上記と同じ手順で架橋剤のみグルタルア
ルデヒド（５０％水溶液を１８０μ！添加）に変えて固
定化サーモライシンを作製した。サーモライシンの固定
化量の定量は、洗浄液中のサーモライシンをＵ■吸収で
定量することにより行なった。固定化サーモライシンの
活性は、文献（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ
、　３　、Ｐ、　４５９　（１９５８）　）に従って、
水〜酢酸エチルニ相系でＺ−１−Ｐｈｅ−１−Ｐｈｅ−
ＯＭｅを合成する時の速度で評価した。

この結果を第１表に示した。

第１表　　固定化サーモライシンの性質（＊　同じ蛋白
量のフリーのサーモライシンに対する固定化サーモライ
シンの活性、） 化合物６に代えて化合物１．２．３を用いたが、上記と
同様にグルタルアルデヒドよりも優れたサーモライシン
固定化率と活性保持率が得られた。

この結果より、本発明に従って製造した固定化生理活性
物質は、従来の方法に比較して活性が高いことがわかる
。また、従来のグルタルアルデヒドによる固定化法では
、生成した化学結合（シンフヘース）の安定化のために
還元剤による後処理を行なうことも多いが、本発明では
その必要がないため固定化操作が容易である。

特許出願人　富士写真フィルム株式会社昭和６３年！月
ｌダ日

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）担体の存在下、下記一般式（ I ）で表される化
   合物と生理活性物質とを反応させることを特徴とする生
   理活性物質の固定化法。 一般式（ I ） Ｘ＾１−ＳＯ＿２−Ｌ−ＳＯ＿２−Ｘ＾２ 上記一般式中、Ｘ＾１およびＸ＾２は−ＣＨ＝ＣＨ＿２
   または−ＣＨ＿２ＣＨ＿２−Ｙのいずれかであり、Ｘ＾
   １およびＸ＾２は同じであっても異なってもよい。Ｙは
   求核試薬によって置換されるか、塩基によってＨＹの形
   で脱離し得る基を表わす。Ｌは２価の連結基であり、置
   換されていてもよい。
2. （２）第１項の固定化法によって得られる固定化生理活
   性物質。