JPH012570A - バチルス・ズブチルス菌株及び該菌株によるアフラトキシン汚染の防除法 - Google Patents

バチルス・ズブチルス菌株及び該菌株によるアフラトキシン汚染の防除法

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JPH012570A
JPH012570A JP62-155998A JP15599887A JPH012570A JP H012570 A JPH012570 A JP H012570A JP 15599887 A JP15599887 A JP 15599887A JP H012570 A JPH012570 A JP H012570A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 アフラトキシンは、現在知られている物質の中で発癌性
の最も強い物質の一つと考えられている。
このアフラトキシンは、アスペルギルス・フラバス(A
spergillus flavus)又はアスペルギ
ルス・パラシティカス(Asper3i11us pa
rasiticus)などのアフラトキシン産生菌によ
り産生され、B1.61など鏝つかの誘導体が知られて
いる。
小麦、大麦、米、コーンなどの穀類やハーゼルナッツ、
アーモンド、ブラジルナツツ、ピーナツツなどのナツツ
類などにアフラトキシンで汚染されたもの(Am、 A
ss、 Cereal Chemists lnc、、
595゜+974;603.1975:JAOC59B
OA、1981;j、 Agric、 FoodChe
m、4fi、249.+978;Dtsch Lebe
nsm、 Rudsch、 7B。
47.1980; Lebensm、−wiss、 u
、 −Technol、、14,252゜1981など
)が見つかっており、これらの汚染された作物が栽培、
収穫された地域は、アフラトキシン産生菌で汚染されて
いる可能性が大きい、このようなアフラトキシンに汚染
されたIIIやナツツ類は、**上問題があるため、多
くの国で輸入を厳しく規制している。
これらの穀類やナツツ類がアフラトキシン産生菌で汚染
された畑で栽培された場合、その畑で収穫されるl[や
ナツツ類は、アフラトキシンで汚染される可能性が大き
くなる。特に、熱帯地方や亜熱帯地方では、アフラトキ
シン産生菌で汚染されているところが多く見つかってい
る。
この発明は、穀類やナツツ類がアフラトキシンで汚染さ
れるのを防除するとき用いられ、アフラトキシンで汚染
される心配のない穀類やナツツ類を供することを目的と
している。
従来の技術 アブラドキシンが土壌で減少すること(5oilSci
、 Soc、 Ao+、 J、、44.1237.19
80)が知られており、土壌への吸着や微生物の関与が
考えられる。また、多くの微生物がアフラトキシンを溶
解した溶液中のアフラトキシンを減少することも報告さ
れている(J、 Bact、、93,464,1967
; J、 1<en、 Microbiol、。
54 、185 + 1968 :Naturw 1s
senschaf ten 、6J 、 53? 、 
1975 :Proc、 Jpn、 As5oc、 M
ycotoxicol、、12,33.1980)*そ
のなかで、溶液中のアフラトキシンを特に減少する微生
物としてフラボバクテリウム・オウランテイアカム(F
Iavobacteriu+m aurantiacu
s+)、バチルスΦメガテリウム(Bacillus 
w+egaterium )、コリネバクテリウム・ル
アラム(Corynebacteri+imr +i 
h r u m )、ペニシリウム・イスランデイカム
(Pe−nicillium islandicum 
)、スタキボトリス・ロブラータ(5tachybot
rys Iobulata)、カニングハメラΦ工、キ
ヌラータ(Cunninghasella echin
ulata)、ストレプトコッカス−ラクチス(Str
eptococus 1a−ctis)などが報告され
ている。
発明が崎決しようと讐る問題点 しか′し、これらの微生物によるアフラトキシンの減少
の多くは、菌体に吸着するものであると報告(J、 g
en、旧crobio1..54.185.1968;
 J、 Bac−1erio1.+ 93,464.1
967 )されており、しかもm液中のアフラトキシン
を減少するのであって、アフラトキシン産生菌の繁殖を
阻害したり、収穫した穀類やナツツ類又は畑で栽培され
ている穀類やナツツ類のアフラトキシンを減少するかど
うかなどは調べられていない、したがって、これらの微
生物を用いて畑で栽培されているn類やナツツ類からア
フラトキシンを除去したり、アフラトキシンに汚染され
るのを防ぐことは、行われていない。
また、収穫後の穀類やナツツ類からアブラドキシンを除
去するにしても多量の菌体を用いなければならず、食品
に不向きな方法である。しかも、穀類やナツツ類の内部
に存在するアフラトキシンを完全に除去することは、困
難である。その上、これらの菌は、食品に用いた場合、
人体に無害であるかどうか不明であり、病原性などで衛
生上問題がある菌も考えられる。さらに、例えばストレ
プトコッカス中ラクチスなどのように菌の栄養要求性が
高いため、穀類やナツツ類を処理するのに適さないもの
もある。
この発明の発明者は、食品に用いても安全な微生物を用
いて穀類やナツツ類がアフラトキシンに汚染されるのを
防ぎ除く方法を開発すべく各地の土壌菌を検索し、昔か
ら食品と関係の深いバチルス・ズブチルス(Bacil
lus  5ubtilis)に属する菌株で溶液中の
アフラトキシンを減少し、しかもアフラトキシン産生菌
の生育とアフラトキシンの産生を阻害する性質を有する
バチルス・ズブチルスNK−33011株微工研菌寄第
9162号(FERM  P−9162)を見つけ、先
に特願昭62−25476号として特許出願をしている
が、今回この菌株と同様にアフラトキシンの産生を阻害
し、穀類やナツツ類がアフラトキシンにより汚染するの
を防除する性質を有するバチルス・ズブチルスに属する
新しい菌株(NK−C−3株)を見いだし、この発明を
完成させた。
なお、R,Mannは、バチルス・ズブチルスのなかに
アフラトキシンを除去する菌株(ATCC6633株、
ATCC9372株)があること(Z、Lebensm
、−Unters、−Forsch、 、出、39,1
977)を報告している。この報告は、アフラトキシン
産生菌液を用い20日晴間理して40〜50%減少した
としているが、この程度の減少では畑で栽培している穀
類やナツツ類に用いてもほとんど効果が期待できない。
問題点を解決するための手段 この発明は、アフラトキシン産生菌の繁殖を抑制し、ア
フラトキシンの産生を防ぎ、アフラトキシンを減少する
働きを持ったバチルス・ズブチルスNK−C−3株に間
するものであり、該バチルス拳ズブチルスNK−C−3
株をIll又はナツツ類に作用させてn5ii又はナツ
ツ類がアフラトキシンで汚染されるのを防除するもので
ある。
この発明に用いるバチルス[相]ズブチルスNK−C−
3株は、土壌中からスクリーニング中に得た菌株であり
、その−膜内性質は、次の通りである。
(1)形態、大きさ      桿菌、0.4〜0.6
μ×1.8〜2.2μ (2)細胞の多形性      無 (3)運動性         陽 性(4) N毛 
         側 毛(5)胞子        
  有、0.8〜1.8μ(6) lS!子の部位  
     中 央(7)ダラム染色性      陽 
性(8)抗酸性         陰 性(9)肉汁寒
天平板に     やや不規則な円形おけるコロニー 
    極く薄い黄銅色(10)硝酸塩の還元    
  陽 性(II)V Pテスト       陽 性
(12)澱粉の加水分解     陽 性(13)クエ
ン酸の利用     陽 性(14)オキシダーゼ  
    陽 性(15)カタラーゼ       陽 
性(16)好気下での生育     陽 性(17)嫌
気下での生育     陰 性(18)pH6,7での
生育   陽 性(19)7%食塩下での生育   陽
 性(20)O−Fテスト      0(酸化的)(
21)酸の生成 (21−1) D−グルコース   陽 性(21−2
) L−アラビノース  陽 性(21−3) D−マ
ンニット   陽 性(21−4) D−キシロース 
  陽 性以上の性質からBergey’s  Man
ual of Detervi−native Bac
teriology、 8版及びManual for
 theIdentification of Med
ical Bacteriology(Covan& 
5teeり、 2版を参照し、この菌株をバチルスφズ
プチルスに属する菌株と同定し、バチルス・ズブチルス
NK−C−3株として微生物工業技術研究所に寄託(微
工研菌寄第9404号)しである。
なお、この菌株は、平板培地におけるコロニーの色及び
オキシダーゼが陽性であることからバチルス・ズブチル
スNK−330株と区別される。
このバチルス舎ズプチルスNK−C−3株のアフラトキ
シン産生菌の生育に対する阻害効果は、ポテト・デキス
トロース寒天の平板培地上に画線して確かめた。
また、例えば実施例1. 2に見られるように、この菌
株の培養液を添加したポテト・デキストロース寒天の平
板培地上で、アフラトキシン産生菌(アスペルギルス・
フラバノ NRRL3357株又はアスペルギルス争バ
ラシティカス NRRL2999株)の胞子の発芽を阻
害した。
一方、この菌株は、例えば実施例3に見られるように、
アフラトキシンB1を添加したニュートリエンド・プロ
ス培地に接種して30℃で1週間培養したときアフラト
キシンB1の約88%を除去した。これは先に述べたR
、Mannの用いたバチルスφズプチルス(ATCC6
633株及びATCC9372株)が3週間培養しても
約40〜50%除去したにすぎないのに比へ、はるかに
効率的である。
また、例えば実施例4.5.6.7に示すように、バチ
ルスφズブチルスNK−C−3株を殺菌したビーナツツ
又はコーン粒にアフラトキシン産生菌の胞子と共に接種
すると、これらのアフラトキシン産生菌の胞子の発芽を
著しく阻害Cた。このような性質は例えば比較例7.9
.11,13にその例を示すように同じバチルス自ズブ
チルスニ属スるIAM1028株などのほかの菌には認
められなかった。
さらに、バチルス・ズブチルスNK−C−3株は、例え
ば実施例8.9に示すように、土壌中のアフラトキシン
産生菌によるアフラトキシンの産生を阻害し、穀類やナ
ツツ類がアフラトキシンで汚染されるのを防除する働き
がある。
従って、収穫した後の穀類やナツツ類をこの菌株で処理
することによりアフラトキシンによる汚染を防除するこ
とができる。また、収穫前の畑にこの菌株を散布、混合
すると簡単に処理でき、その畑で収穫した穀類やナツツ
類がアフラトキシンにより汚染するのを防ぐことができ
る。
なお、この発明のバチルス争ズプチルスN K −C−
3株を作用させると言うことには、菌体を作用させるの
みならず、この菌を培養した培II液を作用させること
も含めるものである。
発明の効果 R,Mannの用いたバチルス・ズブチルスATCC6
633株及びATCC9372株が3週間の培養で溶液
中のアフラトキシンを40〜50%除去したにすぎない
のに対し、この発明のバチルス・ズブチルスNK−C−
3株は、例えば実施@3の場合1週間の培養でその88
%を除去したように、溶液中のアフラトキシンを減少し
た。しかも、実施例8.9に例を示すようにアフラトキ
シン産生菌が存在する土壌に加えることにより穀類やナ
ツツ類に産生ずるアフラトキシンを減少し、押開するこ
とができる。
したがって、畑にこの発明のバチルス・ズブチルスNK
−C−3株を散布、混入させることにより、その畑で収
穫する穀類やナツツ類がアフラトキシンで汚染されるの
を防ぐことができ、アフラトキシンの汚染の心配の少な
い穀類やナツツ類が得られる。
さらに、バチルス・ズブチルスNK−C−3株の持って
いるアフラトキシン又はアフラトキシン産生菌に対する
防除機構に間する遺伝子を遺伝子組替えの資源として利
用することも可能である。
実施例1 100mlのポテト・デキストロース液体培地にバチル
ス・ズブチルスNK−C−3株を1白金耳接種し、30
℃で2日問擺盪培養し、生じた菌体を8,000gで分
離した。この菌体を分離した培養液に粉末のポテト・デ
キストロース寒天培地を39.6g/10割合で加え、
121’Cのオートクレーブで殺菌後、平板培地とした
この培地にアスペルギルスΦパラシティカスNRRL2
999株の胞子を塗布し、25℃で9日問培養したとき
の胞子の発芽数、コロニーの大きさは、第1表のように
なった。
なお、比較例1は、バチルス・ズブチルスNK−C−3
株を培養していないポテトφデキストロース渣体培地に
粉末のポテト・デキストロース寒第1表 天培地を同様に加え処理した平板培地に胞子を塗布した
ものであり、比較例2はポテト・デキストロース液体培
地の代わりに水を用い同様に粉末のポテト・デキストロ
ース寒天培地を39.6g/lの割合で加え平板培地と
したものに胞子を塗布したものを同様に処理したもので
ある。
あらかじめバチルス・ズブチルスNK−C−3株を培養
した培地を用いた場合(実施例1)は、バチルス拳ズプ
チルスNK−C−3株を培養していない培地(比較例1
及び2)に比ペアフラトキシン産生菌の胞子の発芽が著
しく少なく、しかも生じたコロニーの大きさも小さかっ
た。すなわち、実施例10発芽は、個数で比較した場合
、比較例1と比ベア0.0%、また比較例2と比ベア1
゜7%が阻害されたことになる。
実施例2 実施例1のあらかじめバチルス・ズブチルスNK−C−
3株を培青し、菌体を分離した培lI濯を加えたポテト
・デキストロース寒天平板培地に、アスペルギルス・フ
ラバスNRRL3357株の胞子を塗布し、25℃で9
日間培養した。このときの胞子の発芽数及びコロニーの
大きさは、第2表のようになった。
第2表 なお、比較例3及び比較例4は、あらかじめバチルスφ
ズプチルスNK−C−3株を培養していないポテト・デ
キストロース液体培地(比較例3)及び水(比較例4)
にポテト・デキストロース寒天培地粉末を加え平板培地
とした培地に胞子を塗布し実施例2と同様に処理したも
のである。
あらかじめバチルス・ズブチルスNK−C−3株を培養
した培地を用いた場合(実施例2)は、バチルスφズプ
チルスNK−C−3株を培養していない培地(比較例3
及び4)に比ベアフラトキシン産生菌の胞子の発芽が著
しく少なく、しかも生じたコロニーの大きさが小さかっ
た。すなわち、実施例2の発芽は、個数で比較した場合
、比較例3と比べ80.7%、比較例4と比べ82.2
%が発芽を阻害されたことになる。
実施例3 ニュートリエンド・ブロス培地5mlに、ジメチルスル
フォオキサイド(DMSO)に溶解したアフラトキシン
B1を約30μg添加し、これにバチルスΦズブチルス
NK−C−3株を約106細胞接種し、30℃で振盪培
養したときの培養開始前(以下0日目とする)及び培!
I7日目のアフラトキシンの含量は、第3表のようにな
った。
第3表 すなわち、7日目のアフラトキシンの量は、比較例5の
7日目の量に比べ88%(0日目の量に比べると92.
3%>m少し、効率よく除去された。
なお、比較例5は、バチルス・ズブチルスNK−C−3
株を接種しないアフラトキシン含有培地を同様に処理し
たときのアフラトキシンの含量である。
実施例4 ′85年産南アフリカ産の小粒ビーナツツ(ナタールコ
モン種)をおよそ2時間水に浸漬しく吸水率約50%)
、その15gを三角フラスコにとり、オートクレーブで
121℃、15分間加熱殺菌した後、アスペルギルス・
フラバスNRRL3357株(約20胞子/フラスコ)
と共にバチルス書ズプチルスNK−C−3株(約200
纏胞/フラスコ)を接種した。25℃で培養したときの
ビーナツツ中のアフラトキシンB+ (第4表)の量を
経時的に測定した結果、バチルス・ズブチルスNK−C
−3株を加えたものは、比較例6に比ペアフラトキシン
の産生量が著しく少なく、その産生を阻害した。
第4表 表のN、0.は、検出されないことを示す。
なお、比較例6は、バチルス・ズブチルスNK−〇−3
株を接種せずアスペルギルス・フラバノ’ NRRL3
357株のみを接種したときのアフラトキシンの産生量
である。
また、比較例7は、バチルス・スブチルスIAMl 0
2e株を用いて実施例4と同様に処理したときのビーナ
ツツ中のアフラトキシンの産生量である。この菌株は、
バチルス・ズブチルスに属するが、アフラトキシンの産
生を阻害しなかった。
実施例5 1月 実施例4で殺菌処理した南アフリカ産のビーナツツにア
スペルギルス・バラシティカスNRRL2999株(約
20胞子/フラスコ)と共にバチルス・ズアチルスNK
−C−3株(約200細胞/フラスコ)を接種し、25
℃で培養したときのビーナツツ中のアフラトキシンB+
 (第6表)及びアフラトキシンG+ (第6表)の量
を経時的に測定した。その結果、バチルス・ズブチルス
NK−C−3株を加えると比較例8に比ペアフラトキシ
ンの産生量が著しく少なく、アフラトキシンの産生を阻
害した。
第5表 第6表 なお、比較例日は、バチルス会ズブチルスNK−C−3
株を接種せずにアスペルギルス・バラシティカスNRR
L2999株のみを接種し、同様に処理したときのビー
ナツツ中のアフラトキシンの産生量である。
また、比較r149は、バチルス・ズブチルスIAM1
026株を用いて実施例5と同様に処理したときのアフ
ラトキシンの産生量である。この菌株は、アフラトキシ
ンの産生を阻害しなかった。
実施例6 実施fF14と同様に殺菌処理した15gのコーン校に
、アスペルギルス・フラバノNRRL3357株(約2
0胞子/フラスコ)と共にバチルス争ズブチルスNK−
C−3株(約200細胞/フラスコ)を接種した。25
℃で培養したときのコーン粒中のアフラトキシンB+ 
(表7)の量を経時的に測定した結果、バチルス・ズブ
チルスNK−C−3株を加えたものは比較例10に比ペ
アフラトキシンの産生量が著しく少なく、その産生を阻
害した。
なお、比較例10は、バチルス拳ズプチルスNK−C−
3株を接種せず、アスペルギルス・フラバノNRRL3
357株のみを接種したときのアフラトキシンの産生量
である。
第7表 また、比較例11は、バチルス・ズブチルスIAM10
28株を用いて実施例6と同様に処理したときのコーン
粒中のアフラトキシンの産生量であも この菌株は、ア
フラトキシンの産生を阻害しなかった。
実施例7 L至1且立月 実施例4と同様に殺菌処理した15gのコーン粒に、ア
スペルギルス・パラシティカスNRRL2999株(約
20胞子/フラスコ)と共にバチルス・ズ7fルア、N
K−C−3株(約200細胞/フラスコ)を接種した。
25℃で培養したときのコーン粒中のアフラトキシンB
+ (第8表)及びアフラトキシンG+ (第9表)の
量を経時的に測定した。その結果、バチルス・ズブチル
スNK−C−3株を加えたものは、比較例12に比ペア
フラトキシンの産生量が著しく少なく、その産生を阻害
した。
ts8表 なお、比較例12は、バチルス・ズブチルスNK−C−
3を接種せずアスペルギルス命パラシティカスNRRL
2999株のみを接種したときのアフラトキシンの産生
量である。
また、比較例13は、バチルス・ズブチルス!AM10
26株を用いて実施例7と同様に処理したときのコーン
粒中のアフラトキシンの産生量である。この菌株は、ア
フラトキシンの産生を阻害しなかった。
第9表 実施例8 市販の培養土を500m1の三角フラスコに約25g入
れ、オートクレーブで121℃、1時間殺菌し、アスペ
ルギルス・フラバスNRRL3357株(約20r&子
/フラスコ)とバチルス・ズブチルスNK−C−3株(
約200細胞/フラスコ)を棲挿した。この菌を接種し
た培養土に、実Ii1!例4に記載の殺菌処理した南ア
フリカ産ビーナツツ15gを加え25℃で培養した。ビ
ーナツツのアフラトキシン含量を測定した結果第10表
のようになり、NK−C−3株を接種しないで同様に処
理した比較例14と比ペアフラトキシンの産生が著しく
阻害されている。
第1θ表 実施例9 シン  に す 実施例日の殺菌した土壌に、アスペルギルス・パラシテ
ィカスNRRL2999株(約20胞子/フラスコ)と
バチルス・ズブチルスNK−C−3株(約200細胞/
フラスコ)を接種した。この菌を接種した土壌に実施例
4に記載の殺菌処理したビーナツツの15gを加え25
℃で培養し、ビーナツツに生じたアフラトキシンの量を
測定した結果第11表のようになった。NK−C−3株
を接種しない比較例15と比ペアフラトキシンの産′生
が著しく阻害された。
第11表 特許出順人   森永製菓株式会社

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1、バチルス・ズブチルス(Bacillus sub
    tilis)に属する菌株であり、かつ次の(イ)〜(
    ハ)のすべての性質を有することを特徴とするバチルス
    ・ズブチルスNK−C−3株。 (イ)アフラトキシンを含有する溶液のアフラトキシン
    を減少させる。 (ロ)アスペルギルスフラバス(Aspergillu
    s fla−vus)又はアスペルギルス・パラシティ
    カス(As−pergillus parasitic
    us)などのアフラトキシンを産生する菌(以下アフラ
    トキシン産生菌と言う)の生育を阻害する。 (ハ)アフラトキシン産生菌と共に穀類又はナッツ類に
    接種したとき、アフラトキシンの産生を阻害し、しかも
    該アフラトキシン産生菌の生育をも阻害する。 2、穀類又はナッツ類にバチルス・ズブチルスNK−C
    −3株を作用させることを特徴とする穀類又はナッツ類
    のアフラトキシン汚染の防除法。 3、穀類又はナッツ類にバチルス・ズブチルスNK−C
    −3株を作用させることが、穀類又はナッツ類を栽培す
    る畑にバチルス・ズブチルスNK−C−3株を散布、混
    入させることである特許請求の範囲第2項記載の穀類及
    びナッツ類のアフラトキシン汚染の防除法。
JP15599887A 1987-02-05 1987-06-23 Bacillus subtilis strain and elimination of aflatoxin contamination using said strain Pending JPS642570A (en)

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