JPH01168291A - コレステロールの吸着物質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１）発明の目的 Ｕ上立丑■犬１ 本発明はロードコツカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）に
属する微生物によるコレステロール吸着物質のｆＪｌ！
造方法に関する。

本発明の方法で製造されるコレステロール吸着物質とは
コレステロールを吸着してそのコレステロールを水に可
溶化せしめ、コレステロールを吸着した状態で１０テア
ーゼ・アミラーゼ・リパーゼ等に対し安定な物質である
。

コレステロールは卵・肉・魚・花笠広範囲の動物性食品
に含まれる物質でこれらの食品を摂食することにより消
化吸収されてヒトの体内では血液、筋肉、皮膚、脳、神
経系、結合組織等に広く分布することとなる。コレステ
ロールは一方では生体組織たとえば細胞膜、血漿リポタ
ンパク質、ミニリン等の構成成分として、またステロイ
ドポルモンの前駆体として必須な有用物質である反面、
食餌性コレステロールの過剰摂取が家族性高コレステロ
ール血症や心筋梗塞、脳梗塞等の動脈硬化性疾患の原因
となることは周知のことである。これらの疾患は食習慣
の相異から欧米にくらべるとわが国の方が少ないとされ
ていたが、近年わが国の食生活の欧米化に伴いこれら疾
患の増加傾向が国民保健上の重大問題となって来ている
。

本発明はコレステロールを多量に含む食品・飼料の低コ
レステロール化およびこれら食品・飼料を摂食した場合
のコレステロールの消化・吸収を抑制する手段を提供す
ることを目的とする。

延未血韮亘 人体内でのコレステロール低下剤の研究は数多くたとえ
ば遠藤らによるコレステロール合成阻害剤ＨＬ−２３６
ＢｆＪ、＾ｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、２９，１３４６（１
９７６）、特開昭５９−１５１８９Ｏｒコレステロール
低下剤の製造方法及び同剤を含有する飲食物」）等があ
る。

これらの研究・発明は体内での生理作用による血中コレ
ステロール量の低下を目的とするものであって、薬理効
果のある物質の摂取を手段とするものであり血中コレス
テロールの適正なコントロールのためには医薬品と同様
な健康管理体制の中で使用されるべきものである。−力
木発明のように食品そのもののコレステロールを低下さ
せ若しくはその吸収を抑制する栄養管理の手段としての
研究・報告は知られていない。なお最近食品加工技術の
進展に伴い、いわゆる疑似食品として「カニアシ」　「
人エイクラ」等の食品が作られるようになりこれらはそ
の素材を例えば動物性素材から植物性に切り替えること
により本来の自然食品が高コレステロール食品であって
も、低又は無コレステロール化することは出来るように
なって来た。

しかしこれらはあくまで「にせもの」であり、食文化の
向上に伴うコレステロール摂取増加とは異質の流れであ
って、低コレステロールでかつ高１１！好（いわゆるグ
ルメ指向）の食生活の要請に応えるものではない。

ｌが解２１シようとしている１１ｎＪ！″前記の如く、
国民食生活・食文化の欧米化、グルメ化の潮流から必然
的に惹起される国民の栄養、保健上の問題点の一つがコ
レステロールの過剰摂取とこれに由来する疾患である。

この解決の手段としては医学的手段や、食餌制限による
栄養学的コントロールら考えられるが、快適な文化的食
生活を崩すことなくこれらの問題を解決することが一層
望ましい。本発明は食品のコレステロール含量又はコレ
ステロールの消化、吸収をコントロールする手段を提供
することにより上記問題点の解決を図ることを目的とす
るものである。

（２）発明の構成 ｌｒ１題（をギ決するための手「 本発明者らはコレステロールの存在下で種々の微生物の
培養を行って、上記のようなコレステロール吸着物質を
産生ずる微生物の検索を行った。

すなわち本発明者らは、本発明の目的に適う微生１勿の
要件としてコレステロール吸着物質を菌体外すなわち培
養液中に産生ずることが重要であることに着目し、検索
の方法を種々工夫した結果、検索される微生物をコレス
テロール添加培地で培養し、その培養液を２通した後Ｐ
液中のコレステロール含量を分析する方法をコレステロ
ール吸着物質の検索方法として確立した。

すなわち、この方法により成る微生物の培養Ｆ液中に、
本来水に殆ど不溶なコレステロールが検出されるならば
、その微生物がコレステロールを可溶化する物質を培養
Ｐ液中に多量に産生した結果であるとの推論に基づくも
のである。

この方法による検索を鋭意つづけた結果、表−１に示す
ようにロードコッカス・ブロンキアリス（ＡＴＣＣ２５
５９２）がコレステロール吸着物質を大量に産生ずるこ
とを見出し本発明を完成した。

このＰ？’＆をさらに分子量３０万以上の物質を除去出
来る限外濾過膜で濾過したところ培地由来の不純物の大
部分が除去されて目的とするコレステロール吸着物質の
溶液を得られることが判った。

さらに精製物質を得るため培地より出来するコレステロ
ールの除去は培養Ｐ液を凍結屹煤した後溶媒、たとえば
酢酸エチルで抽出することにより達成されることを見出
した。

表−１使用菌株と培養Ｆ液中の コレステロール量 ５ｔｒａｉｎ　　　　　　　　　５ｐｅｃｉｅｓ　　　
　　　　　＊ｉｒｉ中のコレレスチロール量００１　　
　　　　Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　　ｅｑｕｉ　　　　
　　　　　　　　　　　　　　０．００００２　　　　
　　Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　　ｅｑｕｉ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　Ｏ，１０００３Ｒｈｏｄｏｃ
ｏｃｃｕｓ　　ｅｑｕｉ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　ｏ、ｏ！］００４　　　　　　Ｒｈｏｄｏｃｏ
ｃｃｕｓ　　ｅｑｕｉ　　　　　　　　　　　　　　　
　　　Ｏ，０７００５Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｑｕ
ｉ　　　　　　　　　Ｏ，０２００６Ｃｏｒｙｎｅｂａ
ｃｔｅｒｉｕｎ　　ｆａｓｃｉｅｎｓ　　　　　　　　
　Ｏ，００００７Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｎ　　
ｈｏａｇｉｉ　　　　　　　　　　　　Ｏ，００２３３
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　　ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ　
　　　　　　　　　Ｏ，１０２３６Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃ
ｕｓ　　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ　　　　　　　　　
Ｑ、１１２５１　　　　Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｂｒ
ｏｎｃｈｉａｌｉｓ　　　　　　Ｏ，８９２３Ｒｈｏｄ
ｏｃｏｃｃｕｓ　　ｅ　　ｕｉ　　ｆｒｏｌ　ｂｕｔｔ
ｅｒ　　　　　Ｏ，００このコレステロール吸着物質は
、セファロース４Ｂ、叶へＦセフアゾ・ンクスＡ−５０
、セファロースＣＬ−４８等を用いるクロマトグラフィ
ーによりさらに精製することが出来る。

作」■ このようにして得られたコレステロール吸着物質は何れ
らコレステロールを吸着することが実験により確認され
た。

ｖＩ製されたコレステロール吸着物質はプロナーゼＰ（
科研製薬（株）製）によって分解されず、８０℃３０分
熱処理によっても吸着したコレステロールは安定であり
蛋白質は含まれないものと思われる。また薄層クロマト
グラフィーの結果から糖類が構成成分として検出されて
いる。

火藷舅 次に本発明のコレステロール吸着物質の製造方法を実施
例によって詳細に説明する。

実施例１゜ １２１℃で、２０分間滅菌した表−２に示す組成の培地
を超音波処理してコレステロールを分散し２リットル容
ヒダ付きフラスコに４００　ｍｌ入れロードコツカス・
ブロンキアリス（−ＡＴＣＣ２５５９２）を保存斜面培
地より３白金耳接種し、３７℃で、９６時間振盪培養す
る。その結果、培養液のコレステロール吸着能は０．９
■／ｍｌであった。

表−２ 酵母工Ａス　　　　　５ｇ Ｎ１１　Ｎｏ　　　　　　　　　１　　　　ｇにｆｌＰ
ｏ　　　　　　　　　Ｏ，２５ｇＨｇＳＯ７１１００，
２５ｇ ＦｅＳＯ７１１００，００１ｇ 実施例２゜ 実施例１で得られた培養液４００　ｍｌを７，０００　
ｘ　ｇで、３０分間遠心分離した後、上澄を東洋濾紙Ｎ
ｏ、　２で濾過し、炉液を凍結乾燥することにより、コ
レステロール吸着物質含有固形物９５０■が得られた。

実施例３゜ 実施例１と同様の方法で得られた、培養ｉ　４００ＩＮ
１１を７，０００　ｘ　ｇで３０分間遠心分離した後、
上澄を東洋濾紙Ｎｏ、　２で濾過し、Ｐ液を限外濾過器
ＵＩＩＰ　−６２型（東洋枦祇社製）　３０万カッｌ−
膜ＸＨ−３００（東洋Ｐ紙社製）にて限外濾過しコレス
テロール吸着物質含有濃縮液１００　ｍｌ　（コレステ
ロール吸着能３．６１ａｇ／　ｍｌ　）が得られた。

実施例４゜ 実施例３で得られた濃縮液１００　ｍｌを凍結乾燥した
後、酢酸エチル１００ｍ１にて；ルステロールを溶解洗
浄する。その残渣を水１００ｍ１に溶解後、再び凍結乾
燥することにより粗コレステロール吸着物質５９３■が
得られた。

この■コレステロール吸着物質は１００■当り６０■の
コレステロールを吸着する。

実施例５゜ １２１°Ｃで２０分間滅菌した、表−１に示す組成の培
地を超音波処理して、コレステロールを分散し試験管に
１０ｍ１入れ、ロードコッカス・ブロンキアリス（ＡＴ
ＣＣ２５５９２’ｊ株を保存斜面培地より１白金耳接種
し、３７℃で７２時間振盪培養する。

次にこうして得られた菌体を、１２１℃で２０分間滅菌
した表−３に示す組成の培地４００　ｍｌ入りの２リッ
トル容ヒダ付きフラスコに植菌して、３７℃で９６時間
振盪培養する。その結果コレステロール吸着能が０．９
■／ｍｌの培養液が得られた。

表−３ 酵はエキス　　　　　　５ｇ ＮｌｌＮ０　　　　　　　　　１　　　　　ｇＫｔｌＰ
Ｏ０，２５ｇ ＨｇＳ０７Ｈ００゜２５　　　ｇ 実施例６゜ 実施例３の方法にて調整したコレステロール含有濃縮液
５　ｍｌを、予め０，１モル・ｐＨ６，０のリン酸緩衝
液にて平衡化したセファロース４Ｂ（ファルマシア社製
）のカラム（径２．０１３高さ５８３）に注加・吸着さ
れた後、前記緩衝液を流下してクロマト分離した。分離
液は１０ｍ１毎のフラクションに分画し、各フラクショ
ン液の吸光度を板長２８０１１ｍで測定した結果は図１
の通りであった。

得られたフラクションのニンヒドリン発色度をＹｅｎｌ
ｍ　−ｃｏｏｋ　ｉ　ｎｇ法の千谷−矢追変法により測
定し、さらにコレステロール含量をモノテスト（ベーリ
ンガー・マンハイム社製コレステロール測定試薬）によ
り測定した結果を図１に示した。

コレステロール含量が高いＮα５からＮ０１２までのフ
ラクションをまとめて、透析脱塩後、凍結乾燥してコレ
ステロール吸着物質の粉末２５■を得た。

実施例７゜ 実施例４で得られたそ■コレステロール吸着物質１００
■を０．０５モル・ｐＨ８，０のリン酸緩衝液５　ｍｌ
に溶解し、予め同緩衝液で平衡化したセファデックスｍ
−５０（ファルマシア社製）のカラム（径２．６■・高
さ３１個）に注加・吸着せしめた後、同緩衝液３００　
ｍｌで溶出し、溶出液３０００１１を得た、これを溶出
液（１）とする。

さらに同カラムに０．１モル・ｐＨ４，０のＮａＣｌ＃
酸アンモニウム緩衝液を流下せしめ、３００　ｍｌの溶
出液を得た。これを溶出液（２）とする。

溶出液（１）、溶出液（２）を常法により透析、凍結乾
燥して乾燥物を得た。それぞれを乾燥物（１）、乾す渠
１勿（２）とする。

次にこれら乾燥！Ｉ！Ｊ（１）及び（２）を、それぞれ
０．１モル・ｐＨ５，０の酢酸アンモニウム緩ＷＩ液５
山１に溶解し、それぞれを予め同Ｍ８Ｒ液で平衡化した
セファロースＣＬ−４８（ファルマシア社製）のカラム
（径２．２　ａｎ・高さ５７Ｃ１１）に吸着せしめた後
、同緩衝液にて溶出した。溶出液をそれぞれ溶出液（３
）及び（４）とする。溶出液（３）及び（４）はそれぞ
れ５　ｍｌ毎に分画して、糖濃度・吸光度（２８０ｎｕ
ｎ）を測定した、それぞれの結果を図２及び図３に示し
た。″ 溶出液（３）及び（４）のフラクションの中、吸光度が
ピークとなるフラクションについてコレステロール吸着
活性を測定したところ表−４の結果を得た。表−４の結
果から溶出液（３）についてはＮｏ、　２１からＮｏ、
３２までを、溶出液（４）についてはＮ０１４からＮ０
２１までをコレステロール吸着物質のフラクションとし
て、透析・脱塩の後、凍結乾燥しコレステロール吸着物
質の精製物を得た。溶出液（３）からの精製物（１）は
２０．　、溶出液（４）からの精製物（２）は６■であ
った。

表−４ ンγＩ出液Ｎα　　フラクション　　コレステロール吸
　　着　　活　　性 溶出液（３）　　　　Ｎｏ、２５　　　　　　　＋＋Ｎ
ｏ、３７　　　− 溶出液（４〉Ｎα１５＋＋ Ｎｏ、２０　　　　＋＋ Ｎｏ、２６　　　−４− Ｎ０２９　　　　± Ｎｏ、３７　　　　＋ Ｎｏ、４０　＋ （３）発明の効果 実施例２乃至実施例７で得られた、コレステロール吸着
物質は何れも、コレステロールの水懸濁液に加えるとコ
レステロールを可溶化することが出来る。。

本発明により食品中のコレステロールを低減し又はコレ
ステロールの消化・吸収を抑制する可能性をもった、新
規物質の製造方法を提供するものである。

【図面の簡単な説明】

図１は、実施例６のクロマトグラフィーを図示したもの
で、○印は２８０ＩＩＩＩＩの吸光度、・印はモノテス
トによるコレステロール定量時の５４６柑の吸光度およ
びΔ印はニンヒドリン反応の発色度を２８０市の吸光度
として表わした。また♂は吸光度が１．２を超えること
を示している。 図２及び図３は、それぞれ実施例７の溶出液（３）及び
（４）のクロマトグラフィーの図である。Ｏ印は２８Ｏ
ｎ＋ｒ＋の吸光度、・印はフェノール硫酸法による糖の
定量時の４９０市における吸光度である

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）ロードコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）に属
   する微生物を用いることを特徴とするコレステロール吸
   着物質の製造方法。
2. （２）ロードコッカス・ブロンキアリス（ＡＴＣＣ２５
   ５９２）を用いることを特徴とする特許請求範囲（１）
   のコレステロール吸着物質の製造方法。
3. （３）ロードコッカス属の培養液をろ過し乾燥すること
   を特徴とする特許請求範囲（１）のコレステロール吸着
   物質の製造方法。
4. （４）限外ろ過膜を用いることを特徴とする特許請求範
   囲（１）のコレステロール吸着物質の製造方法。
5. （５）培養ろ液を凍結乾燥した後、乾燥物を溶媒洗滌す
   ることを特徴とする特許請求範囲（１）のコレステロー
   ル吸着物質の製造方法。
6. （６）溶媒が酢酸エチルであることを特徴とする特許請
   求範囲（５）のコレステロール吸着物質の製造方法。