JPH0116389B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、エンドトキシン吸着材及びそれを用
いるエンドトキシンの除去方法に関し、さらに詳
しくは、固定化ポリミキシンからなるエンドトキ
シン吸着材及びそれを用いるエンドトキシンの吸
着除去方法に関するものである。 エンドトキシンは、グラム陰性菌細胞壁の外膜
を構成するリポ多糖と蛋白の複合体であり、人体
に侵入した場合に強い発熱作用やシヨツク症状を
示す物質として医療上注目を集めている。 このエンドトキシンの存在を確認する方法とし
て、カブトガニアメーバ様細胞抽出液（LAL）
を用いるリムルステストがこれまで活用されてき
たが、定量性、感度の点から充分とはいえなかつ
た。しかし、本発明者らの出願に係る合成基質を
用いる改良されたLAL−テストにより、エンド
トキシンの作用及び構造研究が一段と進展したき
た。 エンドトキシンは、耐熱性で化学的にも安定で
あり適当な失活の方法がなく、薬剤汚染やエンド
トキセミアの治療の壁になつている。加熱、酸、
アルカリ処理更に界面活性剤等によるエンドトキ
シンの不活化は、薬剤の本来の性質や生体構成物
質を損うことなく実施することはできない。 しかしながら、生理的な条件下でエンドトキシ
ンの活性を不活させるものとして、ポリミキシン
が知られている。ポリミキシンは、バチルス・ポ
リミキサ（Bacillus polymyxa）の産生するジア
ミノ酪酸を含む環状ペプチド性抗生物質で、ポリ
ミキシンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｍ及びＰが分
離されているが、いずれも生体内でエンドトキシ
ンの作用を中和することが知られている。しかし
ながら、これらは強い副作用を有する故に医薬と
して使用されるのはこのうちで１〜２種である。
また、このポリミキシンのエンドトキシン不活化
作用の機構解明は未だ確立されていない。 本願発明者らは、エンドトキシンの生理活性の
機構解明の一環としてエンドトキシン活性の不活
化の検討を行ない、抗生物質ポリミキシンによる
エンドトキシンの生体内活性の不活化がポリミキ
シンとエンドトキシンの強い親和性により強固な
複合体を形成し、結果的に、ポリミキシン及びエ
ンドトキシンの活性がそれぞれ不活化されるとい
う新規事実を見出した。この性質を利用すればエ
ンドトキシンを温和な条件下で分離除去すること
が可能となり、人体に直接、間接に適用される医
薬や医療用具からエンドトキシンの作用を除去す
ることが可能となる。 本発明の目的は、ポリミキシンを不溶性担体に
固定化することによるエンドトキシン吸着材の提
供と、該吸着材の利用法としてのエンドトキシン
の除去法の提供にある。 本発明のエンドトキシン吸着材はポリミキシン
とエンドトキシンの親和性を利用することを原理
とするものであり、その不溶性担体として、アガ
ロース、架橋アガロース、セルロース粉並びに成
形化セルロース誘導体、デキストランゲルの如き
多糖体系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂等の
多価アルコール性水酸基を有する球状又は不定形
のクロマトグラフイー用担体や繊維状、膜状医用
高分子が使用できる。また、これら不溶性担体と
ポリミキシンとの結合反応は、担体の有する水酸
基と、ポリミキシンの分子中に複数個存在するア
ミノ基との間の化学的共有結合化の公知の方法を
採用することができる。例えば、BrCN活性化
法、塩化シアヌール法、エポキシド等を用いるオ
キシラン開裂反応、ハロゲン化アセチル誘導体を
用いる直接担体に結合する方法でもよいし、又、
ヘキサメチレンジアミンをスペーサーとして用い
イソシアナート誘導体を中間体としてポリミキシ
ンを結合せしめる方法等も使用できるが、本発明
の目的とするところは、担体固定化ポリミキシン
によるエンドトキシンの吸着材であるので、本発
明の目的とする範囲を越えないエンドトキシン吸
着材の製造方法は全て適用できる。 エンドトキシン含有液中のエンドトキシンを除
去するには、上述した固定化ポリミキシンとエン
ドトキシンを接触させた後、固液を分離し、エン
ドトキシンを含まない液を得ることができる。接
触の方法は、例えば吸着材をエンドトキシン含有
液中に懸濁混合した後、別してエンドトキシン
を含まない液を得てもよいし、吸着材をカラムに
充填し、エンドトキシン吸着カラムを調製し、こ
れに、エンドトキシン含有液を通すことにより、
溶出液として、エンドトキシン・フリーの液を得
ることもできる。また、本発明の吸着材はそれ単
独で用いてもよいし、他の適当な担体と組合わせ
て用いてもよい。 本発明を実施例に基づき具体的に説明する。 実施例 １ エンドトキシン吸着材 ポリミキシン−セフアロース・CL−4Bの調製 架橋アガロース担体（Sepharose・CL−4B）
50mlに2.3ｇのBrCN／50mlH₂Oを加え４℃に冷
却した。5NNaOHをPH11±0.2に、温度を10〜15
℃に保ちながら８〜10分間で滴下して、活性化し
た。無菌冷水を用いて充分洗浄しブフナーロート
上の余分の水を除いた。無菌条件下に洗浄した
BrCN活性化架橋アガロース担体10ｇ（湿潤状
態）をカツプリング緩衝液（0.1M NaHCO₃、
0.5M NaCl、PH8.3）20mlに懸濁せしめ、次いで、
硫酸ポリミキシンＢ（台糖フアイザー製）1.0ｇ／
20ml緩衝液を加え室温下４時間撹拌反応せしめ
た。未反応の活性基を0.2Mグリシン・トリス−
塩酸（Tris−HCl）緩衝液（PH8.0）にて不活化
しブフナーロートを用いて過した後、酢酸緩衝
液（PH4.0）にて洗浄し、10mlのエンドトキシン
吸着材ポリミキシン−セフアロース・CL−4Bを
得た。 実施例 ２ エンドトキシン吸着剤 コリスチン（ポリミキシンＥ）・セルロースビー
ズの調製 市販セルロースビーズ（セルロフアイン 、チ
ツソ(株)製造）GC−700をグラスフイルター上で充
分水洗し、吸引過したビーズ（湿潤状態）２ｇ
当り２mlの１，４−ブタンジオールグリシジルエ
ーテル（Aldrich Chemicals Company、Inc製）
と２mgのNaBH₄を含む0.6M NaOH2mlを加え、
25℃の反応槽中で振盪した。８時間後グラスフイ
ルター上で吸引下水洗し、約1.6ミリモル（ｍ
mole）のエポキシ基を導入したエポキシ基導入
セルロースビーズを得た。 このエポキシ化セルロースビーズ２ｇに、コリ
スチン硫酸（特薬抗生製造）400mg／1M
Na₂CO₃4mlを加え25℃で16時間振盪反応せしめ
た。未反応のエポキシ基を1Mエタノールアミン
中、室温下で８時間処理し活性をなくした。反応
液からのコリスチンの回収率から逆算してほぼ
90％のコリスチンが結合したコリスチン・セルロ
ースビーズ（湿潤状態）約２ｇを得た。 実施例 ３ エンドトキシン吸着材によるエンドトキシンの
除去 実施例で調製したエンドトキシン吸着材の
カラム（１×５cm）にE.coli UKTBのエンドト
キシン生理食塩水溶液（10nｇ／ml）１mlを添加
し滅菌トリス−HCl（PH7.2、0.05M）で溶出した
が、溶出液中には、従来のゲル化によるリムルス
テストでも、発色性基質によるエンドトキシン測
定法でも、エンドトキシンは検出されなかつた。

【表】 実施例 ４ エンドトキシン吸着材によるエンドトキシンの
除去 実施例２で調製したエンドトキシン吸着材の
コリスチン・セルロースビーズ１ｇをトリス−塩
酸緩衝液（PH7.2、0.01M）＋NaCl（0.03M）約１
mlに懸濁し、これをカラムに充填して、水道水を
0.1ml／分の速度で通過せしめたところ、通過液
のエンドトキシンはほとんど除去されていた。

【表】 実施例 ５ エンドトキシン吸着材によるエンドトキシンの
除去 実施例１で調製したエンドトキシン吸着材
（Polymixin−Sepharose CL−4B）をトリス−
塩酸緩衝液（PH7.2、0.01M）に懸濁して10×500
cmのカラムを調製し、これに輸液調製用の精製水
を通過せしめてエンドトキシンの除去効果を確め
た。 その結果、同カラムを通過せしめた精製水を用
いて調製した輸液にはエンドトキシンは検出され
なかつたが、カラムを通過せしめなかつたもので
はエンドトキシンが検出された。 実施例 ６ エンドトキシン吸着材 シアノゲンブロマイド（ブロムシアン）活性化
セフアロース（フアルマシア社製）を用い、下記
に示す工程により、ポリミキシンと反応させ、ポ
リミキシンのγ−アミノ基をセフアロースに共有
結合させた。

【表】 ポリミキシンセフアロースは遊離polymixinが
検出されなくなるまで、滅菌蒸留水で洗浄した。 反応時にポリミキシンの濃度を高くすると結合
するポリミキシンの絶対量は多くなるが、逆に結
合率は低下する（次表参照）。

【表】

【表】 また、結合したポリミキシンとエンドトキシン
の結合率は次の表の通りであつた。

【表】 測定法 なお、実施例において用いる測定法について述
べる。 １ ポリミキシン測定法 イザーキ及びギル（Itzhaaki＆Gill）のミク
ロビユレツト法で測定した。 （文献：R.F.Itzhaaki＆D.M.Gill：Anal.
Biochem.９、401（1964）） ２ 発色性基質（Chromogenic substrate）によ
るエンドトキシンの測定法 測定試薬はパイロデイツク （生化学工業(株)
発売）を用いた。この試薬は、Ｎ−第三ブチル
オキシカルボニルロイシルグリシルアルギニン
パラニトロアニリド（Boc・Leu・Gly・Arg
−pNA）及びカブトガニ血球抽出液を含む製
剤で、岩永らの方法をもとに調製されており、
同法によつてエンドトキシンの定量が可能であ
る。 〔文献：中村（S.Nakamura）、森田（T.
Morita）、岩永（S.Iwanaga）、丹羽（M.
Niwa）、高橋（K.Takahashi）、J.Biochem.
81、1567（1977）；岩永（S.Iwanaga）、森田
（T.Morita）、原田（T.Harada）、中村（S.
Nakamura）、丹羽（M.Niwa）、高田（K.
Takada）、木村（T.Kimura）、榊原（S.
Sakakibara）、Haemostasis、７、183（1978）〕

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 固定化ポリミキシンからなることを特徴とす
   るエンドトキシン吸着材。 ２ 固定化ポリミキシンからなる吸着材をエンド
   トキシン含有液に接触させた後、該吸着材を分離
   することを特徴とするエンドトキシンの除去方
   法。