JPH01128935A - ｐｒｅＳ２＋Ｓ抗原の回収 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原遺伝子に隣接するーっのリ
ーディングフレームに結合しているＢ型肝炎ウィルスの
ｐｒｅＳ、抗原遺伝子はトランスホームされた宿主にお
いて発現されている。発現された蛋白質はＢ型肝炎ウィ
ルス起因疾患及び／あるいは感染に対する治療及び予防
としてのワクチン、またｉｎ　ｖｉｔｒ。

における診断用システムとして有効に使用される。しか
しながら、今までの、破砕細胞怨濁液あるいは細胞上清
液からの発現蛋白質の精製は、抗原の崩壊に伴ないその
産生量に多大な損失がみられていた。

よって、本発明の目的は高い収率でｐｒｅ　Ｓ２＋Ｓ抗
原を回収する為の方法を提供することにある。本発明の
他の目的はｐｒｅＳ、＋Ｓ抗原の精製を容易に行なう為
の方法を提供することにある。本発明のこれら及び他の
目的は以下の記載により明らかにされている。

ｐｒｅＳ２＋Ｓ抗原含有固型物を保有あるいは保有して
いない液相を２つの水溶液相に分離し、その後に、フュ
ームシリカに対して希望する抗原を吸着及び遊離するこ
とによって、最終濃度及び精製として適切である　５０
−１００倍（抗原：蛋白質の比率）に精製された産物と
して得られる。

本発明は破砕細胞懸濁液あるいは細胞上清液よりｐｒｅ
Ｓ、＋Ｓ抗原の回収及び精製に関するものである０本発
明に従い、フュームシリカに対して吸着及び遊離に供さ
れるｐｒｅ　Ｓ　Ｚ＋Ｓ抗原の２相水溶液抽出により前
述の目的が遂行された。

破砕細胞懸濁液あるいは細胞上清液は、それらにポリエ
チレングリコール（ＰＥＧ）及びデキストランを加える
ことにより２相に分離される。ＰＥＧ及びデキストラン
は２和水溶液層を形成し、ｐｒｅＳ、＋Ｓ　抗原は上層
ＰＥＧ含有層に移行する。むしろ界面活性剤は抗原の可
溶性を増大させるものである。Ｐ）ｌ緩衝液及び塩類は
好ましくは、抗原をＰＥＧ含有層への移行を高めるため
のものである。

適切なＰＥＧはＰＥＧ３３５０であり、適切なデキスト
ランとはデキストランＴ５００である。非イオン性界面
活性剤の一例としてトリトンＸ−１００がある。有効な
塩類としての例をあげると、ＮａＣＱ及びに２ＨＰＯ４
である。

破砕細胞懸濁液あるいは細胞上清液には前述添加成分が
含まれているが、これを遠心にかけ、上層液を取り出し
、稀釈してミ濾過する。

ミ戸液を濃縮し限外ミ濾過によりＰＥＧを除去する。残
留表面活性剤を除去し、少しだけＰＨを上げ、また温度
を下げ、抗原をフュームシリカに吸着させる。そして抗
原をフユームシリガより溶出、残留シリカの除去、濃縮
、限外ミ濾過（ダイアフィルトレージョン）、及び滅菌
チ過を行なう。

以下の実施例は本発明を説明するものであり、しかしな
がら、それにより限定するものではない。

去】１号 ｐ　ＨＢ　ｐ　ｒ　ｅ’　Ｓ　Ｇ　Ａ　Ｐ　　３４７　
／　１９　Ｔ　（ヨーロッパ特許比１１０１７．４４４
４において、ｐＨＢｐｒｅＳ５６ＧＡＰ３４７／３３と
して記載されている）は発現カセット構築の為に使用さ
れている。既に報告されているように［クニスケルン（
Ｋｎｉｓｋｅｒｎ）等、ジーン（Ｇｅｎｅ）。

第４６巻、第１３５頁−第１４１頁、１９８６］、（ａ
）約１０５０ｂｐのＧＡＰ４９１プロモーター、（ｂ）
一つの１０ｂｐ酵母由来フランキング配列、（ｃ）８４
６　ｂｐのＨＢＶ　　ｐｒｅＳ。

＋Ｓ遺伝子（血清型ａｄｗ）でありウィルス性フランキ
ング配列はもっていない、及び（ｄ）約３５ｏｂｐの酵
母ＡＤＨ１ターミネータ−より成るものである。この発
現カセットを酵母シャトルベクターｐｃｉ／１［ベグス
（Ｂｅｇｇｓ）。

ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第２７５巻、第１０４頁
、１９７８、ローゼンバーグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）等
、ネイチ’ｒ−（Ｎａｔｕｒｅ）　、第３１２巻、第７
７頁、１９８４］に挿入し、酵母株ＣＦ４２（トランス
ホーマント　ＰＹＧｐｒｅＳ、Ｓ−１とする）のトラン
スホームに使用する。対照実験として、プラスミドｐＨ
ＢｐｒｅＳＧＡＰ３４７／１９Ｔを用いる。親株ＣＦ４
２を以下により獲得する。酵母株２１５０−２−３（エ
ル、ハートウェル（Ｌ、　Ｈａｒｔｔｙｅｌｌ）、ニー
。

オブワシントン（Ｕ、　ｏｆ　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）
より贈与）の自然的ｕｒａ３変異株を選択する［ボーケ
（Ｂｏｅｋｅ　）等、モル、ジエン、ジェネット。

（Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、）、第１９７巻、
第３４５頁−第３４６頁、１９８４コ。得られた株（Ｍ
ＡＴ　　ａ、ａｄｅ　１，１ｅ１Ｌ２−０４．ｕｒａ３
、Ｃｉｒ”）はプラスミドＹＣＰ５０−ＨＯのトランス
ホームにより２倍体形成される［ジエンセン（Ｊｅｎｓ
ｅｎ）等、ピー、エヌ。

ニー、ニス、（Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、）、ニー。

ニス、ニー、第８０巻、第３０３５頁−第３０３９頁、
１９８３］。この機能酵母遺伝子ＨＯは細胞の接合型を
スイッチさせるものである。よって単細胞トランスホー
マントからの子孫は“ａ”及び″α″接合型の混合体で
あり、コロニー形成中に接合されてくる。

二倍体クローン分離菌はプラスミドを救済するものであ
りＣＦ４２（ＭＡＴ　ａ／ａ、ａｄｅｌ、ｌｅｕ　　２
−０４．ｕｒａ３）と表示される。これらのトランスホ
ーマントは、評価及び後の実験の為に凍結保存菌として
確立された。

上述凍結保存菌からの組換え体酵母をＹＥＨＤ培地で培
養する。増殖が静止期に入ったら、酵母細胞を破砕する
。

０．５％のトリＩＮンＸ−１００を含む酵母株ＣＦ４２
の破砕細胞懸濁液８　ｍ　Ｑに１ｍＡのＰＢＳ　（リン
酸緩衝塩類）、０．７ｇのに２ＨＰ　０４　、　ｌ　ｍ
　Ｑの５Ｍ　ＮａｃＱ、　６℃ｍＱの２０％ＰＥＧ３３
５０溶液、及び４ｍｆｌの２０％デキストランＴ５００
溶液を加える。この混合物を２５００ｘｇ、４℃、１５
分間の遠心にかける。

上層の抗原含有ＰＥＧ３３５０（１２−１３ｍＱ）を取
り出し、ＰＢＳで１＝２に稀釈し０．２μ　フィルター
で一過する。このミ戸液を濃縮し、アミコン１０″分子
量カットオフ　メンプランに対して１０容量のＰＢＳで
ＰＥＧ３３５０除去の為の限外ミ濾過を行なう。残留ト
リトンＸ−１００をＸＡＤ−２レジンで除去し、レジン
粒子をミ濾過により分離。

ミ戸液をアｚｏシル（Ａｅｒｏｓｉｌ）　　３８０　（
表面積３８０ｍ”／ｇ保有）に対してｐＨ７，５−７，
６、温度２−８℃、２．５時間で吸着し、次に２，５０
０　Ｘ　ｇ、４℃、１５分間の遠心にかける。使用する
アエロジル３８０の量は次の式により決定される二重量
ｃｇｍ）アエロジル＝０．０２５９ｘ　（７液容量ｍ１
ｌｌ）Ｘ　（Ａ２８°Ｏ−Ａ　３５０）、式中（Ａ２８
０−Ａ３５０）とはミ戸液を１：１０に稀釈してλ２８
０とλ３５０における吸光度の差を示すものである。

よって、加えられたアエロジル３８０の量は過程中にお
ける不用蛋白質の除去、等などと同様に細胞を破砕する
一つの作用を担うものである。

抗原をアエロジル３８０　１ｇに対してｐＨ８，７，１
５＋ｎＱの硼酸緩衝液を加えることによってアエロジル
３８０より溶出する。溶出ステップは１度反復され結合
溶出液を３０分間、１１．ＯＯＯｘｇ　の遠心にかけ微
細アエロジル３８０粒子を除去し、アミコン１０５分子
量カットオフ　メンプランに対して、硼酸緩衝液で限外
ミ濾過し、０．２２μ　フィルターを用いた滅菌ミ濾過
を行なう。反復操作における炉液中の蛋白質に対するｐ
ｒｅＳ２＋Ｓ抗原としての抗原の割合は１２−２０％で
あり、総抗原量としてはその中で３０−６５％が獲得さ
れ、この過程中では重大な崩壊のないことを示している
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、液相からの酵母産生ｐｒｅＳ＿２＋Ｓ 抗原の単離方法において、ｐｒｅＳ＿２＋Ｓ抗原を含む
   疎水性相である上層と、新水性相である下層としての液
   相の形成、下層から上層を分離、抗原含有相における抗
   原をフュームシリカに吸着、及び吸着抗原の遊離よりな
   る方法。 ２、遊離抗原を限外濾過する請求項１記 載に従う方法。 ３、抗原の限外濾過を硼酸緩衝液で行な う請求項２記載に従う方法。 ４、限外濾過の後に、抗原を滅菌濾過す る請求項２記載に従う方法。 ５、疎水性相よりフュームシリカに吸着 しているその抗原を遊離し、約３０％から約６５％の産
   生物として、重大な崩壊を伴なわないように抗原を回収
   することより成る酵母産生ｐｒｅＳ＿２＋Ｓ抗原の単離
   方法。