JPH01124397A - アスペルギルスに対するヒト・モノクローナル抗体とその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ａ、産業上の利用分野 本発明は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）
、に対するヒ１〜・モノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌ
ｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　、以下ＭＣＡと略記する
）とそれを産生ずるハイブリドーマ並びにモノクローナ
ル抗体の製造法に関する。その目的とするところは、ア
スペルギルスの感染によって引き起こされるアスペルギ
ルス症の診断や治療のための抗アスペルギルス・ヒｊ−
Ｍ　ＣＡを提供することにおる。

ｂ、従来の技術 アスペルギルスは世界中の土壌や空中に存在し、最も普
遍的な真菌の１つでおる。アスペルギルス症に（まＡ、
　ｆｕｎ　ｉ　ｇａｔｕｓ、八、ｆｌａｖｕｓ、　Ａ、
ｎ１ｄＵｌａｎＳ、　Ａ。

ｎｉｇｅｒ、　Ａ、ｔｅｒｒｅｔ＋Ｓ等１５０種以上等
閑５０種以上、病原体として最も重要な菌種はＡ、　ｒ
ｕｍｔｇａｔｕｓで必る。アスペルギルスの菌糸は右隅
性で分枝し、分生子柄が気中に伸び、その先端には亜球
状に肥大した迫真がある。迫真の表面にはフラスコ形の
分生子形成細胞が並んでいる。ここで分生子が産生され
る。

アスペルギルス症（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ）とは
、アスペルギルスの感染によって引き起こされる疾患で
あり、主な病原菌種はＡ、　ｆｕｍｉｇａｔｌＪｓであ
る。アスペルギルス症の中で最も頻度高く見られる疾患
が肺アスペルギローマで必る。肺結核でできた空洞に、
Ａ、　ｆＬＩＩＩｌｉ（］ａｔｕＳが侵入繁殖する。ま
た、抵抗力の弱まった患者、例えば、白血病や腎臓移植
患者等でアスペルギルスが感染増殖し、肺炎を起すこと
もある。これらの他に、アレルギー性気管支肺アスペル
ギルス症、播種状アスペルギルス症、外耳道真菌症およ
び角膜真菌症もアスペルギルスが病原体となる。

一般に、アスペルギルス症を含めた深在性真菌症は抗生
物質、抗腫瘍剤、ステロイドホルモン剤の使用が普及す
るにつれて急増している。剖検で見られた真菌症の内訳
は、カンジダ、アスペルギルス、クリプトコツカスがほ
ぼ３０％、　２０％、１０％の割合である。

アスペルギルス症を含む深在性真菌症の治療には、アン
フオテリシンＢ、フルシトシン、ミコナゾール、ケトコ
ナゾール等が必る。アスペルギルス症の場合には、主に
アンフＡテリシンＢとフルシトシンの併用がよく行われ
る。しかし、アンフォテリシンＢは腎毒性、貧血、胃腸
障害等の副作用が強く、フルシトシンは比較的毒性は低
いが、白血球減少と胃腸障害の副作用があると共に、耐
性菌が出現し易いといった欠点がある。このように、現
在の治療方法は決して満足できるものでない。

また、アスペルギルスに対する抗体の検出には、八、　
ｆｔＪｍｉ（ｌａｔｕｓの培養上清やその抽出物を抗原
として用いた、ラテックス凝集反応、補体結合反応。

寒天ゲル内二重拡散法、皮内反応等の試験法がある。こ
れらの方法で、免疫応答能の維持されている患者の場合
には、診断が可能でおる。しかし免疫応答能のない患者
に多発する、侵襲性肺アスペルギルス症では抗体が産生
されにくく、診断がつぎにくい。そこで、抗原の検出が
必要となるが、検出感度の高い方法は今のところ確立さ
れていない。

深在性真菌症は抵抗力の弱った患者、例えば白血病、癌
、後天性免疫不全症候Ｕ（エイズ）、臓器移植、免疫抑
制剤を投与される自己免疫の患者等に多く発生し、主な
病原体はカンジダ、アスペルギルス、クリプトコツカス
である。これらの真菌を検出するためには、抗体を用い
た免疫学的手段が取られる。従来、動物にこれらの真菌
を免疫して得た血清抗体を用いてきた。１９７５年にＭ
ｉｌｓｔｅｉｎとＫＯｈ　ｌ　ｅｒによってマウスのＭ
ＣＡが初めて作製された。ＭＣＡは、従来の血清抗体よ
りも（１）特異性が高い、（２）抗体価が高い、（３）
再現性が良い、（４）ＭＣＡを産生ずる細胞（ハイブリ
ドーマ）を増殖させることによって犬■のＭＣＡか取れ
る、等の長所を持っている。現在までに多くの生物学的
物質に対するＭＣＡが作製され、医療に役立てられてい
る。真菌でも、カンジダに対するマウスＭＣＡは、例え
ば、特開昭６２−６２０００号公報Ｌ　ｒ＃ｌ　示され
ている。しかし、アスペルギルスに対するＭＣＡの報告
は全くない。もしアスペルギルスに対するＭＣＡが得ら
れるならば、アスペルギルス症の診断に有用である。ざ
らに、ヒトのＭＣＡが得られるならば、副作用の非常に
低い、かつ強力な抗アスペルギルス治療薬になると考え
られる。治療薬としては、ヒ１〜のＭＣＡが必要で、マ
ウスのＭＣＡでは良くない。ぞの理由はマウスのＭＣＡ
を患者に投与したとぎ、患者の免疫応答が起こり、異種
のマウス蛋白に対して抗体ができ、マウスＭＣＡの作用
を阻害してしまうのみならず、生じた免疫複合体により
副作用が生じるからであり、治療を目的にヒトに投与す
るためには、ヒトのＭＣＡである必要がおる。

従って、診断にはヒ１〜であれマウスであれＭＣＡは有
用性がおるが、治療にはヒトのＭＣＡの開発が望まれて
いる。

一般にヒト由来のＭＣＡはマウス・ミエローマ細胞、ヒ
１〜・ミエローマ細胞あるいは他のリンパ系樹立細胞と
ヒト・リンパ球とを細胞融合して得られるハイブリドー
マから産生される。あるいはヒト・リンパ球をＥＢウィ
ルスによって形質転換させたリンパ芽球細胞からも産生
される。１９８０年から現在まで、多くのヒトＭＣＡ作
製の試みがなされてきたが、いずれの方法もそれぞれ固
有の問題をかかえている。マウス・ミエローマとヒト・
リンパ球との細胞融合で得られたハイブリドーマのＭＣ
Ａ産生は不安定であるし、ヒト・ミエローマ細胞とヒト
・リンパ球との細胞融合は極めて効率が悪い。またＥＢ
ウィルスによって得られるリンパ芽球細胞のＭＣＡ産生
は旧が少なく、かつ不安定である。その上、ＥＢウィル
スは腫瘍を引き起こす能力を有しており、安全性上大き
な問題がある。

このように、ＭＣＡ産生細胞を樹立する技術において大
きな障害がある。さらにもう一つ、アスペルギルスに免
疫されたヒト・リンパ球を如何にして得るかという問題
がある。！ｌ：＋−・リンパ球は末梢血を採血したり、
手術により摘出された牌臓。

リンパ節あるいは扁桃を用いたり、時には骨髄を取り出
すことによって得られる。一般に末梢血は容易に入手で
きるが、他の組織の入手は厳しい制限がある。しかし末
梢血リンパ球にはＢリンパ球が少なく、抗原で活性化を
受けたＢリンパ球は末梢血に少なく、固型のリンパ組織
に集まってしまう。従って、末梢血を用いてもアスペル
ギルス特異的Ｂ細胞はほとんど得られない。固型リンパ
組織を用いた場合でも、アスペルギルスに免疫が充分か
かっているリンパ球提供者は極めて希である。

このような２つの大ぎな障害があり、今までにアスペル
ギルスに対するヒトＭＣＡは全く作製されていなかった
。

ｄ０問題点を解決するだめの手段 本発明者らは、抗アスペルギルス・ヒトＭＣＡを取得す
ることを目的として鋭意研究を行った結果、次のような
方法によってその目的を達成した。

まず扁桃炎に罹った患者から手術で摘出したヒト扁桃を
多数側収集し、それらの扁桃からリンパ球を分離する。

アスペルギルスに対する免疫応答は、それぞれの扁桃提
供者毎に大きく異なる。そこで、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの
アスペルギルスに対する抗体産生能の高いリンパ球ソー
スをスクリーニングする。そして、アスペルギルスに対
する抗体産生能が最も高いリンパ球ソースを用いて、次
の２つの方法で抗アスペルギルス・ヒトＭＣＡ産生細胞
株を樹立する。（１）その扁桃由来のリンパ球を、ｉｎ
　ｖｉｔｒ。

でＢリンパ球活性化因子によって刺激したのら、ミエロ
ーマ細胞（細胞融合パートナ−）と融合する。融合した
後約３ないし５週に生じたハイブリドーマの培養上清を
取り出し、アスペルギルスに対する抗体の有無を調べる
。そして、特異抗体を産生しているハイブリドーマをク
ローニングし、抗体産生能の優れたクローンを選ぶ。（
２）第２の方法として、上記扁桃由来のリンパ球にＦＥ
３ウィルスを感染させ、リンパ球を形質転換する。アス
ペルギルスに対する抗体産生能の高い扁桃リンパ球を用
いたときには、高率にアスペルギルス特異抗体産生クロ
ーンが出現するが、抗体産生の不安定なりローンが多い
ので、軟寒天培地中でフィーダー細胞を加え、タイミン
グよくクローニングする必要がある。このようにして得
られた抗アスペルギルス・ヒトＭＣＡ産生細胞を培養し
、その上清を収集し、カラムクロマ１〜グラフイー等に
よってヒトＭＣＡを精製する。

かくして本発明は、アスペルギルス （＾ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）に対するヒト・モノクロー
ナル抗体におる。

更に、又本発明は、ヒト・リンパ球とマウス・ミエロー
マ細胞等のリンパ系樹立細胞との細胞融合によって形成
される。アスペルギルスに対するヒト・モノクローナル
抗体を産生ずるハイブリドーマ及び／又はそれに由来す
る細胞株、又は、ヒト・リンパ球をＥＢウィルスで形質
転換して得られる、アスペルギルスに対するヒト・モノ
クローナル抗体を産生ずる形質転換細胞及び／又はそれ
に由来する細胞株である。

本発明において用いられるリンパ球はヒトの牌臓、リン
パ節、扁桃、アデノイド、骨髄、末梢血等の中に含まれ
ている。本発明のためには、いかなるソースのリンパ球
でも用いることができるが、望ましくは扁桃、アデノイ
ド、牌臓、リンパ節。

骨髄といった固型リンパ組織由来のリンパ球である。特
に望ましくは、リンパ球をｉｎ　ｖｉｔｒｏでリンパ球
活性化因子及び／又はアスペルギルス抗原と共に培養し
たときに、アスペルギルスに対する抗体を多く産生ずる
能力を持つリンパ球ソースである。

かくして選別されたリンパ球ソースから得たリンパ球を
用いてハイブリドーマを作製する場合には、さらに細胞
融合前にそのリンパ球をＢリンパ球活性化因子及び／あ
るいはアスペルギルス抗原で刺激することが望ましい。

Ｂリンパ球活性化因子としては、Ｂリンパ球の増殖を促
進させるものならば何でもよいが、例えば、ボークｒク
イードマイトジエン（ＰＷＭ）、Ｂ細胞増殖因子（Ｂｃ
ｅｌｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｓ、　Ｂ　ＣＧ　Ｆ　
）　、プロティンＡ、フイトヘムアグルチニン（ＰＨ，
Ａ）、コンカナバリンＡがおる。好ましいのは２〜２０
０μ（］　／ｄのＰＷＭあるいは１００分の１容から３
分の１容のＢＣＧＦである。アスペルギルス抗原として
は、アスペルギルスの菌体そのものあるいはアスペルギ
ルスより抽出した抗原が用いられる。菌体の場合は１×
１０５〜１Ｘ１０８個／威が適当である。刺激の方法条
件は特に限定されるものではないが、ＢＣＧＦの濃度１
００分の１容から３分の１容と、リンパ球１×１０５〜
１×１０７個／ｍｌ＠混合し、培養温度は３５〜４０℃
で、培養時間は３〜１０日、好ましくは４〜６日である
。培養液は人、牛、馬等の血清を含むものなら何でもよ
いが、特に胎児牛血清（ＦＣＳ＞を含む培養液（例えば
　ＲＰＭ　Ｉ　１６４０）が好ましい。本発明において
用いられるミエローマ細胞は、ヒト・ミエローマ細胞、
ヒ１〜Ｂリンパ芽球細胞、ヒトＢリンフオーマ細胞、マ
ウス・ミエローマ細胞おるいはヒト・リンパ球とマウス
・ミエローマ細胞のハイブリドーマ由来のいわゆるヘテ
ロ・ミエローマ細胞である。特に細胞融合効率の高いマ
ウス・ミエローマとして、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８株、Ｐ３−
Ｎｓ１／１−Ａｇ４−１株、ｐ３Ｘ６３Ａｇｕ　１株、
　Ｓ　Ｐ２１０　Ａｑ１４株、　Ｐ３ｘ６２Ａｑ８．６
．５．３株、ＭＰＣＩＩ−４５，６，ＴＧｌ、７株、５
Ｐ−１株等が望ましい。しかし本発明において、ミエロ
ーマ細胞の種類は基本的にいかなる株も使用し得る。

ヒト・リンパ球とミニ１−マ細胞との融合は次のように
行われる。例えば、抗体産生細胞とミエローマ細胞を１
０：１〜１：１０、好ましくは１：１〜１：３の比率で
混合し、適当な細胞融合溶液、例えば約３５％ポリエチ
レングリコール（分子量１．０００〜６．０００程度）
および約７．５％ジメヂルスルホキシドを含むＲＰ　Ｍ
　Ｉ　１６４０を加えて、室温〜３７°Ｃで１〜数分間
攪拌し、その後１０％ＦＣ３かＲＰＭ　１１６４０で徐
々に希釈し、ＨＡＴ（ヒボキサンチン−アミノプテリン
−チミジン）選択培谷液にて細胞濃度が１〜５ｘ１０５
個／ｄとなるように調整する。これを０．２ｄずつ、例
えば９６穴プレートに分注し、５％ＣＯｚを含む空気中
で３５〜３８°Ｃで２・〜３週間培養する。ＨＡ　Ｔ培
養液中ではハイブリドーマのみが生存し、８−アザグア
ニン耐性のミエローマ細胞及びミエローマ同志の融合細
胞は生存し得ない（未融合の抗体産生細胞は数日で死滅
する）。

培養後、培養液中の抗体価をチエツクし、目的とする抗
体を産生じているハイブリドーマのみを選択し単離する
（クローニング）。培養液中の抗体価のチエツクはラジ
オイムノアッセイ（ＲＩＡ＞、酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ
）あるいは菌体凝集法等で行うことができる。クローニ
ングによって選択された、本発明の抗アスペルギルス・
ヒｌ−Ｍ　ＣＡを産生するハイブリドーマは、凍結して
保存することができる。かかるハイブリドーマのセルラ
イン（細胞株）及び／又はそれに由来する細胞株を適当
な方法で大過に培養すると、培養上清から本発明の目的
とするヒトＭＣＡを得ることができる。また、このハイ
ブリドーマを動物に移植して腫瘍化し、その腹水や血清
からヒトＭＣＡを得ることもできる。

ＥＢウィルスによる形質転換法を用いて形質転換細胞を
得る場合には、前記のようにして抗アスペルギルス抗体
のために選別されたソースから得られるリンパ球を、Ｅ
Ｂウィルスによって形質転換する。その方法は基本的に
公知である（例えば、′。

Ｓｔｅｉｎｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ　２６９．４２０．
１９７７）。ＥＢウィルスとしてはいかなるウィルス株
も用いることができるが、例えばＢ９５−８細胞を１０
％ＦＣ３添加ＲＰＭＩ培地中で培養し、その培養上清を
ＥＢウィルス源として複数のバイアルに入れ、−８０℃
に保存してあく。使用時にウィルス液を溶解し、リンパ
球１Ｘ１０７個に対してＥＢウィルスを、望ましくはｍ
、ｏ、ｉが０．０１から１．０で感染させる。感染は３
５〜３８°Ｃで１時間インキュベートすることによって
行う。その後リンパ球を遠心洗浄し、感染リンパ球を３
７℃で培養する。培地としては、例えば２０％ＦＣ３添
加ＲＰＭ　Ｉ　１６４０培地を用い、望ましくはマウス
腹腔細胞等のフィーダー細胞を加える。

リンパ芽球細胞が十分に増殖してきた時点で、その培養
上清を取り出し、アスペルギルスに対する抗体活性の有
無をチエツクする。目的とする抗体を産生じているリン
パ芽球細胞を選択し、軟寒天培地中でのクローニングあ
るいは限界希釈法によるクローニングを行ない、抗体産
生の安定なりブクローンを得る。こうして得られたリン
パ芽球細胞の抗体産生を改善することを目的として、ミ
エローマ細胞とさらに細胞融合し、抗アスペルギルス・
ＭＣＡ産生ハイブリドーマを得ることもできる。

ｅ３発明の効果 以上のようにして得られた抗アスペルギルス・ヒトＭＣ
Ａは、クラスがＩｇＧ　、　ＩＱＨまたは■９八で多く
の実験用アスペルギルス株及び臨床分離株に共通に反応
する。診断ａ３よび治療という目的から考えたとき、Ｉ
（ＩＧ型のものが好ましい。

ｆ、実施例 以下、実施例により本発明を詳述する。

実施例１ （１）アスペルギルスの培養 Ａ、　ｆｕｍｉｑａｔｕｓ　　（ＩＦＯ４０５７）のス
ラン１〜（斜面培養物）にり一白金耳を取り、１００　
ｄの培地（０，５％酵母エキス、１％ポリペプトン及び
２．０％グルコース）に接種し、３０’Ｃで振盪しつつ
、好気的に１晩培養した。この培養液１００μｌを、２
（７の平板プレート（上記培地＋１．５％寒天）に接種
し３０℃で２晩培養する。この平板プレートに、１％ホ
ルムアルデヒドを含むＰＢＳを１０ｍ１加え、室温で１
時間反応させた。プレートより菌体を分離しその後、２
０００ｘ　ｇで１０分間遠心し、沈澱したアスペルギル
スに１０戒のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加えて
分散し、遠心することによって菌体を洗浄した。これを
もう−度繰返し、４０７！蒸溜水で菌体を分散し、ワー
リングブレンダーで３分間破砕する。この破砕液を遠心
洗浄し、１０ｍ１の蒸溜水に懸濁し凍結保存した。他の
アスペルギルス菌株も同様にして抗原材料を作製した。

（２）酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ） 上記保存菌体液を融解し、この菌体液２ないし３ｄに純
水５００　ｍｌを加えて、ＥＬＩＳＡプレート（Ｆａｌ
ｃｏｎ　３９１２　Ｈｉｃｒｏｔｅｓｔ　Ｉｎｆｌｅｘ
ｉｂｌｅ　ａｓｓａｙｐｌａｔｅ、　９６　ｗｅｌｌｓ
）に、０．０３ｄ／穴ずつ入れた。このプレートを６５
℃で５時間加温し液を蒸発さけた後、０．１％グルタル
アルデヒド０．０５ｄを８穴に入れて、室温で１０分間
反応させ、次いて、上清液を除去した。次に０．１％Ｎ
ａＮ３　と１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰ
ＢＳを、０．１５７ずつ８穴に入れ、３７℃で１時間放
置後、４℃で保存した。

これを抗アスペルギルス抗体測定用プレートとした。こ
のプレートにハイブリドーマ培養上清６０μｌを加えて
、室温で１時間放置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０
を含むＰＢＳで３回洗浄の後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体あ
るいはＩｇＨ抗体−アルカリフォスファターゼ（２００
０倍希釈液）を６０μｌ加えて、室温で１時間反応させ
た。ざらにＰＢＳで３回洗浄したのち、Ｐ−ニトロフェ
ニルフォスフニー］・を１Ｍジェタノールアミン＋１ｍ
Ｍ）１ｇα２のｐ１１９゜８溶液に０．６　ｍ（］／ｄ
の割合で溶かした溶液１００μｌを加えた。３０分から
６０分後に４０５ｍμの吸光度を測定した。

ハイブリドーマ及びＥＢウィルス形質転換リンパ芽球細
胞のスクリーニングには、Ａ、　ｒｕｍｒｇａｔｕｓ（
ＩＦＯ４０５７Ｓ株）を用いた。

（３）ヒ１〜扁桃リンパ球 手術によって摘出されたヒト扁桃を、水冷したＲ　ＰＭ
　Ｉ　１６４０中でピンセラ１〜とハサミによってほぐ
し、細胞を分散させた。この細胞を氷冷ＲＰＭ１１６４
０に分散させ、遠心沈澱することによって２回洗浄し、
最終的に２０％ＦＣ３，１０％ジメチルスル小キシド及
び抗生物質を含むＲＰＭ　Ｉ　１６４０培地に、約５Ｘ
１０７細胞／ｄになるように分散し、１威ずつバイアル
に分注し、液体窒素中に保存した。

使用時に融解し、フィコールパック（Ｐｈａｒｍａｃ　
ｉ　ａ社製）上にその細胞分散液を乗せて２０００ｐｐ
ｍで３０分間遠心し、フィコールパックの上層に集まっ
た単核細胞をリンパ球として用いた。

（４）　ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの抗アスペルギルス抗体産
生能の比較 ３４例の患者から摘出された扁桃のリンパ球を、２Ｘ１
０６個／ｄになるように培養液△（ＲＰＭ１１６４０＋
１０％ＦＣ８＋２０ｍＭ　　ＨＥＰＥＳ＋２ｍＭグルタ
ミン＋１ｍＨＮａピルビン酸＋０．０２ｍ（］／　７！
セリン＋８０μｇ／ｍｉゲンタマイシン）に分散させて
、ＰＷＭ２０μ（］　／ｒｎｌまたはＢＣＧＦＩＯ分の
１容を加えて６日間培養した。その培養上清を取り、（
２）項に述べたＥＬＩＳＡ法で抗アスペルギルス抗体（
ＩｇＧ）を測定した。第１表は各扁桃リンパ球の１ｎＶ
ｉｔｒＯでの、抗アスペルギルスＩｇＧ抗体産生量を示
す。値は４０５ｎｍの吸光度（相対値）である。この結
果から抗アスペルギルスＩｇＧの産生量の多い扁桃は、
６．１１．．１５．２１および３３であることが判った
。

（５）細胞融合 ヒ１への扁桃（第１表の１１．２Ｌ　３３）より得たリ
ンパ球を、２Ｘ１０６個／ｍｉの細胞密度で培養液Ａに
分散ざｔ！、ＢＣＧＦを１０分の１容添加し、３７℃で
５％ＣＯ２で５日間培養した。このリンパ球とマウス・
ミエローマ細胞とを以下のように細胞融合した。前もっ
てマウス・ミエローマ細胞ｐ３ｘ６３Ａ（１８Ｕ１細胞
を、培養液（培養液ＡからＨＥＰＥＳを除いたもの）中
で培養しておいた。このミエローマ細胞１Ｘ１０７個と
ＢＣＧＦ刺激リンパ球５×１０６個とを混合し、無血清
ＲＰＭ　Ｉ　１６４０培地で１回洗浄後、最終的に１５
０Ｏｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨てた。この細胞ベ
レットを、試験管をたたくことによって、よく分散させ
た。これに１．Ｏｄのポリエチレングリコール液（ＲＰ
Ｍ　Ｉ　１Ｂ４０５．７５ｍ１２＋ポリエチレングリコ
ール１０００３．５ｄ＋ジメチルスルホキ１ノイド０．
７５７！＞　　（ＰＥＧ液と略記する）を加えて、細胞
をゆるやかに浮遊させた。

１分後に１．０威ＲＰＭ　Ｉ　１６４０を加え、ざらに
１分後に２．０　ｄＲＰＭ　Ｉ’、ざらに２分後に４゜
０７！の叶ＡＴ培養液（ＲＰＭ　Ｉ　ｌ６４０＋１０％
胎児生血清＋８０μＣＩ　／ｒｎ１ゲンタマインシン＋
９５μＭヒポキサンチン＋０．４μＭアミノプテリン＋
１．６μＭチミジン）、ざらに２分後には８．０ｒＩＩ
ＩｌのＨＡＴ培養液を加えた。最後に、ＨＡＴｌａＭ液
で１２５　ｄ細胞浮遊液とした。これを培養プレート（
９６穴）５枚に蒔いて、３７℃、５％ＣＯ２含有空気中
で培養した。１週間毎に半量の培養液を新しいトＩＴ培
養液（ＨＡＴからＡを除去したもの）で交換していきハ
イブリドーマを得た。

ハイブリドーマの抗アスペルギルスＩｇＧ産生はＥＬＩ
ＳＡによってスクリーニングした。第２表にＥＬＩＳＡ
の結果の１部を示した。かなり効率よく抗アスペルギル
スＩ（ＩＧ抗体産生ハイブリドーマ（クローン）が生じ
ているのが判る。

第２表 （＊）各プレー１〜は９６穴ずつ必る。

（６）ハイブリドーマのクローニング クローニングは限定希釈法を用いた。抗アスペルギルス
抗体陽性の穴より細胞を取り出し、細胞数を数え、培養
液としてＲＰＭ　Ｉ　１６４０＋　１０％ＦＯ３＋２ｍ
Ｍグルタミン＋１ｍＨＮａピルビン酸＋０．０２ｍ（Ｊ
／　ｍ１セリン＋８０μ（Ｊ　／ｄゲンタマイシン（培
養液Ｂ）を用い１個／穴あるいは１００個／穴細胞を蒔
いた。２週間後に細胞が十分増殖したので、その上清に
抗アスペルギルス・ＭＣＡがあるか否かをＩ＝ＬＩＳＡ
によって測定し、抗アスペルギルス・ＭＣＡ産生ハイブ
リドーマを選別した。

こうしてハイプリドーマへＡＥ６Ａ１１．　ＰＬＲ２０
Ｂ２゜ＰＮＯ４Ａ２．　ＰＬＴ３１１９及びＰＮ）１４
Ｇ４が樹立された。これらのハイブリドーマは安定にヒ
１〜ＭＣＡを産生し続けている。（７）、抗アスペルギ
ルス・ヒトＭＣＡの特異性 ヒトＭＣＡ、　ＰＬＲ２０Ｂ２．　ＰＮＯ４Ａ２．　Ｐ
Ｌ丁３１１９及びＰＮＨ４Ｇ４はＩＣ１Ｍ抗体で必り、
ＡＡＥ６Ａ１１はＩｇＧ抗体であることがＥＬＩＳＡに
よって判った。そこで種々のへ、　ｆｕｍｉｇａｔｕｓ
株に対する反応性をＥＬＩＳＡで検討した。その結果を
第３表に示した。

１、　　Ａ、ｆｕｍｉｃ＋ａｔｕｓ　　　Ｉ　ＦＯ４０
５７２，ｌ／〃４３９９ ３、　　　　　　　　　　　　　　〃４４００４、　　
　　　　　　　　　　　　ｎ　　　５８４０５、　　　
　　ｌ／ＩＡＭ２０４６ ６、　　　　　　　　　　　　　ｎ　　　２１７Ｂ７・
　　　　　　″　　　　　　＃　　２５３０８、　　　
　　　　　　　　　７／　　３００６９、　　　　　　
　　　　　Ａ　Ｈｕ７３２３１０、　　　　　　　　　
　　　　ｊ、　　　７３２４１１、　　　　　　　　　
　　　　／、　　　７３３７１２・　　　　　　　　　
　　　ｌ／７３８７１３、　　Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂ
ｉｃａｎｓＪ１０１２１４、菌無添加 （８）ヒｌ−Ｍ　ＣＡの精製 ハイブリドーマＡＡＥ６八１１を培養液Ｂに分散し、１
Ｘ１０５細胞／ｍｌから１０Ｘ１０５細胞／ｄの細胞密
度に保らつつ培養した。その培養上清７４０威をプロテ
ィンＡ−セファロース（サイズ１．７ｃｍ　ｘ３．６ｃ
ｍ）にか（プ、ＰＢＳと純水で洗浄後、希塩酸（ｐ（１
２，５）でヒトＭＣＡを流出させた。ただちに１０１８
濃度ＰＢＳを１／１０容加えてｐＨを中和した。こうし
て約４．６ｍ（ｌの蛋白を得た。この蛋白は電気泳動に
よって純粋な抗体く分子量的１６万）であり、ＥＬＩＳ
Ａでアスペルギルスに対する抗体であることが判った。

実施例２ （１）ＥＢウィルスによる形質転換 ヒト扁桃リンパ球を実施例１の（３）項のようにして取
り、１Ｘ１０６個／ｍ１になるように実施例１の（６）
項に記述しである培養液Ｂに分散した。この分散液１０
ｒｎｆｌと、Ｂ９５−８細胞培養上清（ＥＢウィルスを
含む）２ｄとを混合し、３７°Ｃで１時間インキュベー
トした。その後、１５００ｒｐｍで５分間遠心し、細胞
ペレットを得、これに２０％ＦＣ３を含む培養液Ｂをｉ
ｏｏ　ｍｌ加えた。このリンパ球分散液を平底９６穴プ
レ一ト１０枚に蒔いた。なお、このプレートには前もっ
てマウス腹腔浸出細胞をフィーダーとして入れておいた
。

これらのプレー１−に蒔かれた細胞は、３７℃で５％Ｃ
Ｏ２を会心湿潤な空気中で培養した。培養液は７ないし
１０日間毎に半量だけ新鮮なものと交換した。約４週間
後に、ＥＢウィルス形質転換したリンパ芽球細胞のコロ
ニーが、約９０％の穴に出現した。この培養上清を取り
出し、ＥＬＩＳＡによってアスペルギルスに対するヒト
抗体（Ｉ（ＩＧとＩｇ）ｆの両方）をスクリーニングし
た。その結果を第４表に示した。第４表から明らかなよ
うに多くの高い値を示すクローンが見い出された。

第４表 （＊）８プレート、すなわら７６８穴から出現した抗体
産生クローンの数を示す。

（２）ＥＢウィルス形質転換細胞のクローニング実施例
１の（６）項で記述した限界希釈法を用いた。ただし、
細胞は５個／穴ないし５０個／穴で蒔いた。その上清に
、抗アスペルギルス抗体が含まれるか否かをＥＬＩＳＡ
で測定した。１６種の親細胞をクローニングし、ＡＡＧ
５Ｂ１のザブクローンが持続的にアスペルギルスに対す
るＩｇＨ抗体を産生じていた。

（３）抗アスペルギルスＭ　ＣＡ　−ＡＡＧ５Ｂ１の特
異性実施例１の（７）項と同様にして特異性を調べた。

この結果を第５表に示したが、ＡＡＧ５Ｂ１はアスペル
ギルスの菌株に広く反応するが、カンジダには反応しな
いことが判った。

第５表 （＊）第３表参照

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）に対す
   るヒト・モノクローナル抗体。 ２、ヒト・リンパ球とリンパ系樹立細胞との細胞融合に
   よって形成されるハイブリドーマ及び／又はそれに由来
   する細胞株によつて産生される、アスペルギルスに対す
   るヒト・モノクローナル抗体。 ３、リンパ系樹立細胞がマウス・ミエローマ細胞である
   特許請求の範囲第２項記載のアスペルギルスに対するヒ
   ト・モノクローナル抗体。 ４、ヒト・リンパ球とリンパ系樹立細胞との細胞融合に
   よって形成される、アスペルギルスに対するヒト・モノ
   クローナル抗体を産生するハイブリドーマ及び／又はそ
   れに由来する細胞株。 ５、ヒト・リンパ球とリンパ系樹立細胞との細胞融合に
   よって形成される、アスペルギルスに対するヒト・モノ
   クローナル抗体を産生するハイブリドーマ及び／又はそ
   れに由来する細胞株を培養し、培養物からヒト・モノク
   ローナル抗体を採取することからなる、アスペルギルス
   に対するヒト・モノクローナル抗体の製造法。 ６、ヒト・リンパ球をＥＢウィルスで形質転換して得ら
   れる形質転換細胞及び／又はそれに由来する細胞株によ
   って産生される、アスペルギルスに対するヒト・モノク
   ローナル抗体。 ７、ヒト・リンパ球をＥＢウィルスで形質転換して得ら
   れる、アスペルギルスに対するヒト・モノクローナル抗
   体を産生する形質転換細胞及び／又はそれに由来する細
   胞株。 ８、ヒト・リンパ球をＥＢウィルスで形質転換して得ら
   れる、アスペルギルスに対するヒト・モノクローナル抗
   体を産生する形質転換細胞及び／又はそれに由来する細
   胞株を培養し、培養物からヒト・モノクローナル抗体を
   採取することからなる、アスペルギルスに対するヒト・
   モノクローナル抗体の製造法。