JPH02276572A - カンジダ・アルビカンスの細胞質抗原に対するモノクローナル抗体及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の属する技術分野〕 本発明は徽カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｌｄａｍ
ｌｂｉｅａｎｓ　）の１群の細胞質抗原に対するモノク
ローナル抗体を産生ずるハイブリッド細胞ライン、この
ように産生される抗体、並びにこの抗体を用いる診断及
び治療法に関するものである。さらに、本発明はこれら
１詳の細胞質抗原における１成分の精製、との−抗原に
対するモノ特異性のポリクローナル抗体の産生、並びに
この抗体を使用する診断及び治療法に閃するものである
。

〔従来技術とその問題点〕

１９７５年＆：、コーラ−及びミルシュタイン（ネイチ
ャー、第２５６巻、第４９５−４９７負）は、骨髄腫細
胞とネズミの免疫脾細胞との散会を記載している。これ
らのハイブリッド細胞ライン（すなわちハイブリドーマ
）は、親骨髄腫細胞にも免疫脾細胞にも存在しない特性
を有し、これらのハイブリッド細胞は均質（モノクロー
ナル）抗体を連続的に産生ずることができる。これ以前
には、ボリク四−ナル血清のみが得られていた。単一の
抗原のみと反応しうる抗体を得るには、免疫化用の高度
に精製された抗原を得るために面倒な精−技術が必要と
された。たとえ成功したとしても、これらの方法は、ハ
イブリドーマ細胞ラインから産生されるモノクローナル
抗体のように均質かつ充分規定された抗体を与えなかっ
た。サイエンテイフイク・アメリカン（第２４５巻、第
６６−７４頁、１９８０）におけるミルシュタインによ
る論文は、ウサギ、ヤギ及びその他の実験動物において
生成する慣用のポリクローナル・モノ特異性抗体に比較
したモノクローナル抗体の利点を要約している。６槍の
抗原に対するモノクローナル抗体の産生については、現
在多くの化学的文献が存在する。幾つかの文献は、モノ
クローナルム１゜体の産生及び使用につき一連の論文を
含んでいる〔たとえば、カレント・トピックス・イン・
マイク田バイオａジー・アンド・イミュノｐジー、第８
１＠、「リンパ球ハイブリドーマ」、エフ・メルヒエル
ス（Ｆ’９Ｍ・１ｅｈｅｒｓ　）、エム・ボッター（Ｍ
、　Ｐｏｔｔ＠ｒ　）及びエヌ・ワーナー編（Ｎ、Ｗａ
ｒｎ＠ｒ）、スラリンガー出版社（１９７Ｂ）並びにモ
ノクローナル抗体、ハイブリドーマ：生物学的分析にお
ける新規なデメンシ冒ン、アール・ケネット（Ｒ９Ｋ＠
ｎｎ＠ｔｔ　）　、ティー・リュー・ヤツクカーン（Ｔ
。

Ｊ、Ｍｅｋ・ａｒｍ　）及びケー・ビー・ベヒトール（
Ｋ、Ｂ。

Ｂ＊ｃｈｔｏｌ　）４１１プレナムプレス社（１９８０
））。

ハイブリドーマ生成に関する概念上の基礎は現在充分に
理解されているが、任意所定の抗原に対するモノクロー
ナル抗体の腫生はまだ実ｗ！段階にある。たとえば微生
物の抗原のような抗原の＠Ｉ１１！ｒ混合物に対する抗
体を作成するよう試みる場せ、その結果はまだ不礒定で
ある。Ｃ・アルビカンスの場合、アクセルセン（Ａｘ＠
１ｍｍｍ　）は７８を越える異なる有力な抗原檎〜を一
別しうると推定している〔インフエクショナル・イミュ
ノロジー、第７巻、第９４９−９６０頁、（１９７３）
）。この理由で、診断及び治療目的に極めて有用な抗体
を産生ずるには、イミエーノジエンの選択が重要である
。

カビＣ・アルビカンスの細胞質抗原に対するモノクレー
ナル抗体の産生については、従来報告がない。事実、侵
食性カンジダ症を有する患者の血清において抗体により
識別されるカンジダ抗原の特性に関し、殆んど報告がな
されていない。本出願人による研究〔グリニー（Ｇｌｏ
ｗ）等、アメリカン・ジャーナル・メデイスン、第８４
巻、第５８６−５９１頁、（１９７８））は、抗−細胞
種マンナン抗体が恐ら＜＊＊な診断上の標識でないこと
を確認した。何故なら、殆んどの個体は、現在又は過去
のＣ・アルビカンスによる感染とは関係なしに、その威
清中に抗マンナン抗体を有するからである。後の研究が
示すところでは、細胞質抗原は恐らく現在麺患している
カンジダ１０染を診断する上でより重要である〔アール
・イー・ジベルソン（Ｓｙｖ＠ｒｓｏｎ　、　Ｒ，Ｅ、
）及びエフ　ｆ　・７−　ｋ　−Ａックレー（Ｂｕｅｋ
ｌｓｙ、　Ｈ，Ｒ，）、ジャーナル・クリニカル・バソ
ロジー、第６８巻、第２９−３８頁（１９７８））。最
近の研究〔ストロツクパイン（Ｓｔｒｏｅｋｂ１ｍ＠）
、ラーゲン（Ｌａｒｇ＠ｎ　）、ツパイベル（Ｚ　Ｗ＠
ｌｂ＠１　）及びパラクレー、容認、Ｉｎｆ、　＆。

１ｍｍ、　）は、感染カンジダ症を有する患者の血清に
おいて抗体により識別される数種の抗原を確認した。４
８−５２キロダルトン（Ｋｄ）の抗原に対する抗体レベ
ルが、侵食性カンジダ症を有する患者、非侵食性の表在
性カンジダ症を有する患者、他の菌感染症を有する患者
及び正常な健康個体における血清で定電されな。この研
究の結果は、侵食性カンジダ症を有する患者がｐ〈α０
０１のレベルにおいて、すなわち高度の有ｘｉをもって
比ｒＩｎよりも４８−５２Ｋｄｆ白質に対し著しく高い
抗体レベルを有することを示した。

感染カンジダ症は、免疫抑制患者及び＃Ｐ脈カテーテル
を備えな個体において重大な臨床上の間烏である〔アー
ル・マイエロビッッ（Ｍｙ・ｒｅｖｉｔｚ　。

Ｒ１）等、ジャーナル・クリニカル・パソロジー第６８
巻、第２９−５８頁（１９７７））。カンジダはしばし
ばコロニー発生部位から培養しつるが、血液培養物はし
ばしば陰性である。治療過程はなとえは、テンフオテリ
シンＢのような薬剤の投与を含み、これは病原体に対し
ては有効であるが、しばしば重大な腎＃ｌ１ｍ＋害をも
たらす。したがって、医者にとって重要なことは、カン
ジダの伝染が生じているかどうかをａｔｉｔすることで
ある。

たとえば酵母菌症、アスペルギルス病、ヒストプラズマ
症及びコクジオイデス症のような他のカビ病（ｆａｎｇ
ｍｌ　ｄｌｓ＠ａｓ＊　）のお断に役立てるには、免疫
学的方法を使用することができる〔マ二り２ル・オプ・
クリニカル・！イクロパイオロジー、イー・エッチ・レ
ネット（Ｋ、　Ｔ１．　Ｌｅ難ｍ＠ｔｔ会）、ニー・バ
ロース（Ａ、　１ｌａｌｌｏｖｓ　）、ダブリュー・リ
ュー・ハウスラー（Ｗ、　Ｊ、　Ｈａｕｓｌ・ｒ）及び
リュー・トルラアント（Ｊ０丁ｒｕａｎｔ　）　４１１
アメリカン・ソサエティー・７オー・マイクロバイオロ
ー／　−（１９８０））。

免疫学的方法は、その特異性により診断試験において極
めて重要であり、上記したようにモノクローナル抗体は
慣用のポリクローナル抗体よりもずっと特異性である。

カンジダ症を有する患者の抗体が反応する抗原の１角章
及び特性化は、たとえば、酵素結分免疫吸収分析（ＥＬ
Ｉ８Ａ　Ｌ放射線免疫分析（ＲＩＡ）又はラテックス膠
着のような、個体が抗原特異性の抗体を有するかどうか
を試験するための免疫学的試験を設計することを可能に
する。陽性反応は、現在進行中のカンジダ感染を示しか
つ薬側泊療を指示するであろう。しかしながら、上記し
たように、感染カンジダ症は、その病気のため、或いは
現在進行中の治療の結果、幻とえば化学治療を受けてい
る癌患者の場曾のように、免疫抑制されているｍｓにお
いてしばしば生ずる。したがって、カンジダに対する抗
体の検出は非実際的である。

カンジダに対する抗体検出方式に伴なう他の間違は、宿
主における免疫反応に必要とされる遅延時間である。

本発明によれば、免疫学的方法を使用して、たとえば血
清、尿、背髄液のような体液、或いは粘膜分泌物に存在
しうる抗原（抗体ではない）を検出することができる。

抗原検出法は、これら体液中に検出しうるレベルで存在
する抗原に対し特異的な抗体を必要とする。本明細書中
に記載する抗原は検出用の良好な候補である°。感染カ
ンジダ症を有する免疫競合性個体はこれら抗原に対し免
疫反応を示し、これら蛋白質が充分濃度で免疫系に存在
して免疫反応を引起こすことを示している。

現在、感染カンジダ症の診断に関し抗体検出及び抗原検
出の両者につき種々の試験が科学文献に記載されている
が、現存する抗体を使用するこれら試験のいずれも、臨
床上有用となりつる積極的な信頼性及び予測価値も持た
ない。これらの試験のいずれにおいても、適切な抗原が
詳細に記載されていない。

〔発明の要点〕

本発明によれば、ドデシル硫酸ナトリウム−ぎりアクリ
ルアミドのゲルＩＥ気泳動により廁定して、分子１１１
２０−１５５キａ　ｌｋ　）　＞　（ＫＡ）、４８−５
２　Ｋｄ及ＵＳ５−５８Ｋａｔｔ有する一群の近ｍな細
胞質抗原に対する新規なＩｇＧクラスのモノクローナル
抗体を産生しつる細胞ラインを与える２ｆａの新規なハ
イブリドーマが見出された。このハイブリドーマは、ネ
ズミの骨髄腫に融せしたＢＡＬＢ／Ｃネズミ脾細胞の融
合細胞ハイブリッドからなっている。供与体のネズミは
、予めＣ・アルビカンスの細胞質抗原で免疫化される。

これらハイブリドーマはそれぞれＡＴＣＣＡＨＢ−８５
９７及びｋＴｃｃＡＨＢ−Ｂ５９８である。このように
産生される抗体は、近縁の細胞質抗原が共有する単一の
決定子に対しモノ特異性である。これらのモノクローナ
ル抗体は、その他任意のカンジダ抗原に関する他の免疫
グロブリンで汚染されていない。

さらに本発明によれば、これらモノクリ−ナル抗体によ
り識別される蛋白質抗原の１種（４８−５２Ｋｄ）の生
化学的に純粋な調製物の製造方法も見出された。この純
粋な１１１１１Ｉ物な使用して、モノクローナル抗体と
同じ３梗の抗原を識別するモノ特異性、ポリクローナル
抗体をｌｌ製する。得られるモノ特異性・ポリクローナ
ル抗体を単独で又はポリクローナル抗体と組み甘せて使
用することができる。モノクローナル抗体とポリクロー
ナル・モノ特異性抗体との両者はＣ・アルビカンスの特
異性抗原の検出を可能にし、これは感染カンジダ症の診
断において重要と思われる。

本発明によるハイブリドーマ細胞ラインは、特異性Ｃ・
アルビカンス抗原の検出に対し均質かつ再現性ある新規
な試薬源（モノクローナル抗体）を提供する。この抗原
の生化学的精製は、これに対するポリクローナル・モノ
特異性抗体の産生と共に、従来技術では可能でなかった
抗原の原料及び抗体の代替源を提供する。

本発明のハイブリドーマ細胞ラインは、ネズミをＣ・ア
ルビカンスの細胞質抽出物で免疫化し、脾細胞を取り出
してその懸濁物を作ることにより作成される。これら脾
細胞をｗＡ甘せ進剤の存在下でネズミの骨髄腫細胞と融
合させる。融せ細胞を希釈して、非融合骨髄腫又は牌ｍ
胞を支持しない培地中において別々の穴部で培養する。

各穴部における上澄液を、Ｃ・アルビカンスの細胞質抗
原に対する抗体の存在につき測定する。Ｃ・アルビカン
スの細胞質抗原３５−１８に４．４８−５２Ｋｄ又は１
２０−１３５Ｋｄと反応する抗体を産生ずるハイブリド
ーマを選択して、これをクローン化する。抗体をとのり
四−ンの上演液から回収する。

或いは、これらクローンをネズミの腹腔内に移植し、そ
して得られた所望の抗体を含有する悪性腹水又は血清を
回収する。

Ｃ・アルビカンスの３５−５８Ｋｄ、　４８−５２Ｋｄ
又は１２０−１３５Ｋｄの細胞質抗原に対するポリクロ
ーナル・モノ特異性抗体の製造方法も提供される。動物
をこれら抗原の１檎の生化学的に純粋なｆｌｌｉｔｌｌ
ｌ物で免疫化し、そしてポリクローナル抗体を動物の血
清から回収する。

モノクローナル抗体を作成するための病原性カンジダ棟
の部分精製された細ｌｌ１１′ｊｔ抗原の鋳造方法も提
供される。真菌類の菌糸又は酵母の細胞質抽出物を親和
性クロマトグラフィーにより分画して、細ＩＩに壁マン
ナン、グリカン及びマンノ−／グルコー蚤白質複合体を
除去する。さらに、マンナン除去された抽出物をさらに
イオン交換クロマトグラフィーにより分画する。溶出液
のフラクションを、ハイブリドーマの生成につき使用さ
れる脾細胞を有する動物供与体を免疫化するために選択
する。

さらに、モノクローナル又はモノ特異性・ポリクローナ
ル抗体を作成するための病原性カンジダ種の生化学的に
純粋な細胞質抗原の製造方法も提供される。菌糸又は酵
母のマンナン−除去された細胞質抽出物を前記と同様に
イオン交換クロマトグラフィーにより分画する。溶出液
のフラクションを選択する。その成分蛋白質種をゲル電
気泳動により分離する。所望の抗原檎へをほぼ純粋な形
で含有する分子重帯域を選択する。

〔発明の目的〕

したがって本発明の１つの目的は、Ｃ・アルビカンスの
３ｔ１１の近縁な１群の細胞質抗原に対する抗体を産生
じ、したがってカンジダ感染症の免疫診断において有用
なハイブリドーマを提供することである。

さらに本発明の他の目的は、イミエーノジェンの部分精
製方法及びこのイミューノジェンを使用してこれらハイ
ブリドーマを作成する方法を提供することである。

本発明の他の目的は、Ｃ・アルビカンスのこの細胞質抗
原群に対し実質的に均質な抗体を提供することである。

さらに本発明の目的は、モノクローナル抗体を作成する
ための病原性カンジダ檀の部分精製された細胞質抗原の
製造方法を提供することである。

本発明の他の目的は、この精製蛋白質を使用してモノ特
異性・ざリフローナル抗体を作成しつるような、病原性
カンジダ槙の細胞質抗原の生化学的精製方法を提供する
ことである。

本発明の他の目的は、この精製蛋白質を使用してモノ特
異性・ポリクローナル抗体を作成しうるよつな、病原性
カンジダ檀の細胞質抗原の生化学的精製方法を提供する
ことである。

さらに本発明の他の目的は、Ｃ・アルビカンスの所定の
細胞質抗原に向けられたモノクローナル及びポリクロー
ナル・モノ特異性の抗体を使用する病気の診断若しくは
治療方法を提供することである。

〔発明の説明〕 本発明の他の目的及び利点は、以下の記載から明らかと
なるであろう。

パイブリドーマは、全般的にコーラ−（Ｋｏｈｌ・ｒ）
及びミルシュタイン（Ｍｉｌｓｔ＠ｌｎ　）の方法〔ネ
イチャー、第２５６巻、第４９５−４９７頁〕にしたが
って作成された。Ｃ・アルビカンス細胞質抗原の部分精
製されたマンナンを含まない調製物でネズミを免疫化し
た後、この免疫化脾細胞をネズミ骨髄腫ｍ胞ラインと融
付させ、そして得られたハイブリドーマを免疫化に使用
した部分精製抗原調喪物に反応する抗体につきスクリー
ニングした。感染カンジダ症を有する患者からの抗体に
より専ら識別されることが従来判明している抗原〔スト
ロツクパイン、ラーゲン、ツバイペル及びバラフレＩｎ
ｆ、　＆、　Ｉｎｍ、　］に対する抗体を産生ずるこれ
らのハイブリドーマを同定するため、陽性ハイブリドー
マを免疫沈澱によりスクリーニングした。

この抗原に対する抗体を産生ずる２ａｔＩのハイブリド
ーマを次いでクローン化しかつ特性化した。さらに、こ
れらのモノクローナル抗体は他の２種の近縁な細胞質抗
原が共有する決定子を識別することが判明した。したが
って、２檎のハイブリドーマラインを、次いで単離し、
これらはＣ・アルビカンスの３種の近縁な絽胞質抗原群
を識別する。

免疫学上重用な抗原の岡定は、モノクローナル抗体を生
成させる前に、これらの方法を成功させるのに重要な７
アクタであった。しかしながら、特に部分精製されたイ
ミューノジエンについては所望の抗体を生成させ得ない
と推定される。さらに、モノクリ−ナル抗体は、上記の
全ての利点を用するが、しばしばポリクローナル抗体に
伴なわない限界を有する。このため、ポリクローナル・
モノ特異性抗体の作成にイミューノジエンとして使用す
るための明らかに生物学上純粋な抗原の製造を可能にす
るような方法を誘導した。このイミューノジエンを精製
するのに必要とされる一連の完全な精製工程の方法は、
従来存在しなかった。

モノ特異性ポリクローナル抗体を産生ずるため、この均
質なイミューノジエンが使用されていた。

これは、さらにモノクローナル抗体の産主に対する有効
なイミューノジエンにもなりうる。

本発明のハイブリドーマの製造方法は一般に次の工程か
らなっている： ＢＡＬＲ／ｃネズミを、Ｃ・アルビカンスの細胞質抽出
物から精製した抗原で免疫化した。この抗原は、Ｃ・ア
ルビカンスからの菌糸相の細胞を機械破壊して作成した
。次いで、得られた細胞質抽出物を遠心分離して細胞壁
、膜及び細胞内機能質を除去し、次いで親和性クロマト
グラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーにより分
画した。

抗原＃ｌ製法の詳細な記載は、後記実施例１のＡ部に示
す。Ｃ・アルビカンス並びに他のカンジダ柵の酵母相細
胞からの細胞質抽出物も抗原の製造に使用しつると思わ
れる。さらに、他の細飽破嬢技術及び分画技術を使用し
て、この抗原を製造しつると信じられる。ＢＡＬＢ／、
ｃネズミはバイブリド確約実験法に関する雑誌及び書物
に記載されている。

ると判明した。

３７〜５０μ２の蚤白質を０．４３．１５７及び２４７
日目に次のようにして４回接樟した：０及び１５７日目
には不完全７０インドアジユバントにおいて皮下投与に
より、４３日目にはアラムにて腹腔内投与により、さら
に２４７日目には食塩水にて腹腔内に投与しな。最終免
疫化の４日後に、バイブ＋１ドーマを作成するなめネズ
ミを殺した。

牌誠１個当り約３ｉの培地で充分である。これら実験技
術は周知されており、免疫学における基杆！ｌｌｌ１ｓ
合促進剤はポリエチレングリコール１０００（平均分子
量１０００−４０００、ＰＥＧ１０００として市販され
ている）であるが、他の融合促進剤も使用することがで
きる。好適融合技術は付着性単一層において骨酋腫ｆＩ
Ｉ胞と脾細胞とを用いて行なわれるが、当業界で知られ
た他の融合技術（たとえば、懸濁若しくはペレットｍ合
技術）も使用することができる。最適な４ｔＩｌ胞比は
、骨請腫細胞１個当り約２〜３個の牌４４ｊｉ胞である
が、この比は脾細胞源又は骨伽腫細胞源に応じてそれよ
り大きくても小さくてもよし）。多くのネズミ骨餉脾細
胞ラインが知られており、一般に学術団体或いはたとえ
ばメリーランド州・ロックビル在・アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクションのような桟々の寄託出画か
ら入手することができる。好ましくは、使用する細胞ラ
インは、いわゆる「薬剤耐性」型のものとすべきである
。これは、非散会骨１ｌｉｉ１１細胞が選択培地中で生
存せず、ハイブリッドが生存するので望ましい。最も一
般的な種類は８−アザグアニン耐性のｆｉｌ１ｍライン
であって、酵孝ヒボキサンチン・グアニン・ホスホリボ
シル・トランスフェラーゼを欠如し、したがってＨＡＴ
（ヒダキサンチン、了ミノプテリン及びチミジン）培地
により支持されない。さらに、使用する骨髄腫細胞ライ
ンはいわゆる「非分泌」捜（たとえば骨髄腫細胞自身が
抗体を産生じないもの）とするのが一般に好適であるが
、分泌型のものも使用することができる。しかしながら
、成る種の場合には、分泌型の骨髄腫ラインが好適であ
る。

後に使用される。非融台骨包腫細胞は悪性でないため、
所定数のみの世代を有し、７−１０日後には増殖しなく
なり最終的に死滅する。他方、融百細胞は、悪性の骨髄
腫源を有しかつ選択培地において生存する脾細胞の能力
を有するので増殖し続ける。したがって、Ｒ１！ｉ会後
、これら細胞を選択培地（たとえば、ＨＡＴ培地）に再
懸濁させて、これを別々の容！（たとえば、９６穴のミ
クロ測定板の各穴部）に加える。これら細胞を所定容置
の希釈剤で再懸濁して、それぞれ別々の容器（たとえば
ミクロ測定板の各穴部）において所定数の細ＷｆＡ（？
−と、ｔｌｆ穴１［当り１〜４ｍｍＦｍ）を単ａｔべく
統計計算する。

この選択培地は薬剤耐性（たとえば８−アザグアニン耐
性）の非融仕骨髄腫細胞を支持しない。

この選択培地は、非融せ骨ｆ＋！！腫細胞を死滅させう
るのに充分な時間（約７−１０日間）融せさせ々使用し
たスクリーニング法は、酵素結合免疫吸収分析（ＥＬＩ
ＳＡ　）としたが、他のスクリーニング分析（たとえば
ＲＩＡ）も使用することができる。

Ｆ、所望抗体を産生ずるハイブリドーマの選択による） 所望のハイブリドーマを選択しかつクローン化させた後
、得られた抗体を２櫨の方法の１つで産生させることが
できる。最も純粋なモノクローナル抗体は、適当な培地
において所望のハイブリドーマを適当な長さの時間にわ
たり試験管内で培養し、次いで所望の抗体を上澄液から
回収することにより産生される。適する培地及び適する
培養時間は公知であり、或いは容易に決定される。この
試験管内の技術は、他の抗カンジダ免疫グロブリンを殆
んど含有しないほぼモノ特異性のモノクローナル抗体を
産生ずる。培地は外因性の血ｍ（たとえば胎児牛血清）
を含有するので、少−の他の免疫グロブリンも存在する
。この試験管内の方法に対する１つの欠点は、成る目的
のための充分ｋ又は充分濃度の抗体を産生じえないこと
である。

何故なら、モノクローナルの濃度が僅か約５０μ２／−
であるからである。

それより大きい濃度の僅かに純度の低いモノクローナル
抗体を産生ずるには、所望のハイブリドーマをネズミ中
に、好ましくは有性生殖の或いは生育性生殖のネズミに
注入することができる。このハイブリドーマは、抗体産
生性の癌腫を適当な培養時間後に生成し、宿主ネズミの
血流及びｐｆＭ腔滲出液（腹水）に所望の抗体の高濃度
をもたらす（約５〜２０岬／Ｍｔ）。これらの宿主ネズ
ミはその血液及び腹水中に正常の抗体をも有するが、こ
れら正常抗体の濃度はこれら体液における全抗体濃度の
僅か約５％である。さらに、これら正常抗体はその特異
性において抗カンジダ性でないため、回収した腹水或い
は血清から得られるモノクローナル抗体は殆んど汚染性
の抗カンジダ免疫グロブい一傘去陣を有する（１：３ｏ
、ｏｏｏ若しくはそれ以上の希釈率にて活性）。ハイブ
リドーマの生成に使用する骨髄腫細胞ラインが「非分泌
性」ラインである場合、産生される全抗体はその抗原に
対し反応性である。「分泌性」骨髄腫源から生成される
ハイブリドーマについては、これらハイブリッド細胞に
より分泌される抗体は、脾細胞により産生される軽鎖で
なく、骨髄腫細胞により産生され軽鎖を有するであろう
。骨髄腫軽鎖を有する抗体は非特異性の「ナンセンス」
抗体であって、抗体特異性を失なうことなく機能的に活
性なモノクローナル抗体を希釈するのみである。分泌性
骨ｌ！！Ｉｉ腫ラインを使用する場曾、腹水及び血清は
高比率の特異性対非特異性の免疫グ四プリンを含有する
。

〔発明の実施例〕

以下、実施例により本発明を説明する。

例　　！ モノクロ−ナル抗体Ａ２Ｃ７及びＣ２Ｃ７の産生 人、抗原作成 カンジダ・アルビカンスの血清型Ａ（ハーゼンフレバー
Ｂ５１１、ＮＩＩ（）をサボー四−ドのスラント上に２
５℃にて１８〜２４時間増殖させた。

１本のスラントからの増殖物を５０艷の液体合成培地〔
り一等、サボーｐ−シア、第１３巻、第１４８−１５５
頁、（１９７５））を含有する数個のフラスコに接種し
、１５０　ｒｐｍの回転振とり機ニて２５℃で１８時間
培養した。これらフラスコからの増殖物の１部（約１−
）を、１００−の上記液体培地を含有する新たなフラス
コに加え、１５０　ｒｐｍにて３７℃で２４時間回転し
た。これら細胞を遠心分離により回収し、かつ緩衝液（
（ＬＯ５Ｍの）すＸ−ＭＣＩ　（ｐ　Ｈ７，４）、αｏ
２Ｗ／マ％ＮａＮ１）で再懸濁させた。これら条件下で
増殖した細胞は９０％の菌糸と１０％の酵母細胞であっ
た。

この細胞スラリーを、ガラス正対細胞スラリーの１：１
混合物を用いてブラウンホモゲナイザにより機械的に８
分間破壊した。破壊されない細胞と細胞残骸とを１ａＯ
Ｏ’ＯＸｆにて４℃で３０分間遠心分離して除去した。

上澄液を集め、そしてペレットを上記と同様に遠心分離
により緩衝液（（１０１Ｍ燐酸す）　！Ｊ　ウｈ＊衝ｏ
、ｐ　Ｈ７，４）　１．：おいて３回洗浄した。凍上澄
液と洗浄上５１欲とを集め、そして８ＣＬＯ口０×ｔに
て４℃で９６分間遠心分離した。この上ｔｆｌ液を集め
て、注射器により試験管の表面における脂質層を除き、
薄い緩衝Δｋ（１００１Ｍ　の　ト　リ　ス　−ＭＣＩ
、　　　ｐ　　１１　７．　４　　、　　（１０２Ｗ／
Ｖ％Ｎ　ａ　Ｎ　３を含有する）に対して透析した。蛋
白買含有ｌを、ラウリー等の方法〔ジャーナル・バイオ
四ジカル・ケミストリー、第１９３−８、第２６５−２
７５頁、（１９５１））により測定した。高速度遠心分
離の後に溶液中に残存する物質を、苗糸相のｇＡ胞資質
抽出物ＭＣＩ）と命名した。

このＭＣＥを次いで親和性クロマトグラフィーにより分
画した。ＭＣＥ（４２−１１４岬蛋白寅）をコンカナバ
リンＡの親和性カラムに通して細胞壁マンナン、グルカ
ン及びマンノ−／グルコー蛋白’ｉｔ　１１　分体を除
去した。コンＡ−セファロース４８（スエーデン国・ウ
プサラ在・ファルマシア社）のカラム（５ｏｒＲｔ床容
鼠）が好適である。

α００１〜αｍ１ＪＪ１度の次の陽イオンを含有するｐ
Ｈ約４５〜約７．５の充填用緩？＃液を使用する：２＋ Ｍｎ　　ｓＭｆｌ　　及びＣｍ　　。好適な充填用緩＠
げは（１０５Ｍの）リス−ＨＣＩ（ｐＨ７４）ｒあッテ
、α００１ＭのＭｇＣ１，とα００１ＭのＭｎＣ１１と
（ＬＯＯＩＭのＣａＣ１ｇとを含有する（緩衝液入）。

ＮａＮ１を保存料として存在させることもできる。

未結合のマンナン除去された物５ｉｔ（ＭＤ−ＭＣＥ）
を集め、凍結乾燥しうるＰＨ７〜８の緩衝液に対して透
析し、かつ凍結乾燥させた。好適な凍結乾燥しうる緩衝
液は（ＬＯＯＩＭの重炭酸アンモニウム緩衝液（ｐ　Ｈ
７，４）である。カラム上に充填された約６０≦の物質
を未結合フラクションとして回収した。

このＭＤ−ＭＣＩをさらにＤＥＡＩイオン交侠クロマト
グラフィーにより分画した。ＭＤ−ＭＣＥ蚤白質（８α
７岬）を流適用駿衝液（α０５Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐ
ｌ’１７．８）に溶解させ、干してＤＥＡＲイオン交換
カラムに加えた。Ｉ）ＦＪＡＥ−セファセル（ファルマ
シア社）カラム（７ｏ−床ｇ菖）が好適である。他の適
するカチオン性の流過用緩衝液はアンモニウム、イミダ
ゾールなどを包含する。これら蛋白質を流過用緩衝液に
おけるいて溶出させた＄→′オン寺Ｊ＝とじてはＮａＣ
１が好適である。α０２８〜α０６６ＭのＮａＣ１にて
溶出する７ラクシヨンを集め、（ＬＯＯＩＭのトリス−
ＭＣＩ（ｐＨ１４）に対し透析し、蛋白質につき分析し
た。これら７ラクシヨンからの蛋白質を使用して、ハイ
ブリドーマの生成に対するネズミを免疫化した。第１図
は、ドデシル硫酸ナトリウム−ダリアクリルアミドのゲ
ル電気泳動により分析しかつ銀技術で染色した、α０２
−１０６Ｍ　　ＮａＣｌにおけるＤＥＡＥイオン交換カ
ラムから溶出された７ラクシヨンを示している。

ｄ　Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃネズミ（フォックス・チェ
ース・インスチチューツ・フォア・カンサー・リサーチ
、ペンシルバニア州、フイラデルフイア在）を０８目に
不完全７０インドアジエバントにおいて５０ｐｔの蛋白
質を皮下投与しかつ４３日目にアラムにおいて５０ｐｆ
の蛋白質を腹腔的投与して免疫化した。１５７日目に、
これらネズミに不完全７０インドアジユバントにおいて
３７μＶの蛋白質を皮下投与して接種し、かつ２４７日
目にこれらネズミに食塩水中の５ｏｐｔの蛋白質を腹腔
的投与した。最後の免疫化の４日後（２５１日目）に、
これらネズミを頚動脈切除により殺し、解繊を融合用と
して、無菌除去した。バンクの調和塩溶液にューヨーク
州、グランＦアイクンド在、ギブフ社）における単一細
胞懸濁物を、無菌鉗子で解繊を引き裂いて作成した。

１１７Ｍの塩化アンモニウムにより氷上で１０分間分解
することにより、赤白球を除去した。未分解の脾細胞及
び８　Ｐ　２　／　Ｏ−Ａ　ｇ　１４の骨髄腫細胞（シ
ェルマン、ネイチャー、第２７６巻、第２６９−２７０
頁）を血清を含まない培地中で激しく５回洗浄して、融
合工程を阻害する血清蚤白質を除去した。

ＳＰ２１０−Ａｇ１４骨髄腫細胞とネズミ脾細胞との細
胞融合は、マツクカーンの変法〔モノクローナル抗体、
ハイブリドーマ：生物学的分析における新規なディメン
ション、アール・エッチーケネット（Ｒ，Ｈ，Ｋｓｎｎ
＊ｔｔ　）　、ティー・ジエー・−ｒ７カーン（’ｌ’
、　Ｊ、　Ｍｅｋ＠ａｒｎ　）及びケー・ビー・ベヒト
ーｙｖ　（Ｋ、Ｂ、　Ｂ＠ｅｈｔｏｌ　）　ｉ！、プレ
ナムプレス社、第３６８−３６９頁、（１９８０）及び
ゴパラクリシナン（Ｇｏｐａｌａｋｒｉｓｈａａｍ　）
、ジャーナル・セル・バイオロジー、第８５巻、第４４
８１頁（１９７９））にしたがって行なった。細胞を、
コン人被覆した組織培養皿（マサチ二−セツツ州、ケン
ブリツチ在、プスター社、Ａ３０４０）の付着性単一層
において、５０マ／マ％のポリエチレングリコール１ｏ
ｏｏにュージャージイー州、フイリイプスブルグ在、ジ
エー・ティー・ペーカー・ケミカルス社）と５０マ／マ
ーのジュルペツコ改変イーグル培地（ギブフ社、ＤＭＥ
Ｍ）との溶液に５０〜４５秒間露出し融合させｔｏこれ
らｊｌｉｌｌ＃！。

を。骨髄腫細胞１個に対し２〜３個の脾細胞の比率にて
混合し、７〜１０Ｘ１Ｇ’個の全細胞を各融合皿に加え
た。これら融合血は、組織培養皿を１５η／ｄのフンＡ
（カリ７オル二ア州、ラン１−ラ在、カルビオヘムーベ
ーリング社）を含有する（１１Ｍの酢酸ナトリウム（ｐ
ＨＬ８）１−及び５０ｑ／−のカルざジイミド（カルビ
オ７工ムーベーリング社）を含有するα１Ｍの酢酸すＹ
リウム（ｐＨ４８）１−と共に揺動台上で室温にて１時
間培養することにより作成した。次いで、これら皿をバ
ンク調和塩溶液（ギプコ社）で３回洗浄し、使用するま
で一２０℃にて空貯蔵した。

Ｃ６腹水液の選択、スクリーニング及び生成細胞融合の
後、これら細胞をＨ人〒培地（２０マ／マ襲の胎児牛血
清（ペンシルバニア州、デンバー在、ダツチランド・ラ
ボラドリース社）を含有する４゜５ｔ／Ｌのグルコース
、１ｙｂｐｆ／−のヒボキサンチン（カルピオヘムーベ
ーリング社）、１８μｔ／−のナトリウムメトトレキセ
ート（カルビオヘムーベーリング社）、Ｓ、Ｂ７ｐｔ／
ｌのチミジン（カルピオヘムーベーリング社）、α２２
５μｆ／−のグリシン〔オハイオ州、クリーブランド在
、ＩＣＮニュートリショナル・バイオケミカルス社）、
（Ｌ１５岬／−のオキザル酢酸塩（ミズリー州、セント
ルイス在、シグマ・ナミカルス社）、α０５岬／−のピ
ルビン酸塩（シグマ社）、α２Ｕ／−の牛イン（バージ
ニア州、マツクリーン在、フロー・ラボラドリース社）
、５０ＩＵ／−のペニシリン（フロー社）、及び５０μ
ｆ／−のストレプトマイシン（フロー社）を含むＤＭＥ
Ｍ）において３７℃で５％のＣＯＩと共に湿潤雰凹気中
で培養した。融合してから７〜１０日後、細胞をＨＴ培
地（１０マ／マ％の胎児牛血清のみを含有し、ナトリウ
ムメトレキモートを含まないＦＩＡＴ培地）に移して、
さらに培養しかつりａ−ン化した。融合してから約２〜
３週間後、ハイブリドーマを含有する培養物からの上澄
液１００／ＪＡを取り出し、そしてカンジダ特異性の抗
体につきスクリーニングした。

細胞培養物上澄液を、酵素結合免疫吸収分析（ｒ：ｔｘ
ｓＡ）により特異性抗体につきスクリーニングした。こ
の分析は、９６穴の組織培養板（フスター社Ａ３５９４
）をα０１５Ｍの炭＠堰珈衝液（ｐＨ９６’Ｊにおける
部分精製したカンジダ蚤白買の１μｆ／−溶液５０μｔ
で４℃にて１晩被濱して行なった。これらプレートを１
０１５Ｍの炭酸塩緩衝液（ｐ　Ｈ９，６）における牛血
清アルブミンの３ｖ／マ％溶叡２ｏｏμｔにより４℃に
て１晩ブロツクした。上澄液を取り出し、プレートをα
Ｂｙ／ｖ％のＮａ１ｌとＣＬｏｓｗ／ｖ％のツイーン２
０（ＰＢ８Ｔ）とを含有するα０５Ｍの燐酸塩緩衝液（
ｐＨ７，４）で４回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダ
ーゼで標識した抗ネズミ１　ｇＧ＋Ｉ　ｇＭ（Ｈ＋Ｌｉ
ＩＩ）（メリーランド州、ガイサースブルグ在、カーケ
ガード・アンド・ベリー・ラボラドリース社）の１μｆ
／ｗ溶液５０μＬを各穴部に加えて、３７℃で３時間培
養した。この第２の抗体を取り出し、プレートを上記と
同様に洗浄した。

１００μｔの基質（α０２％Ｈ！０２を含有する（ＬＩ
Ｍのクエン１！ｌＩ塩＆衝液ｐ　Ｈ４，０におけるα２
ミリＭの２．２′　−アジノージ（３−エチルペンズチ
了ゾリンスルホネート）（シグマ社））を各穴部に加え
、そして室謳で３０分間反応させた。抗体を含有する穴
部を肉眼観察した。

陽性のハイブリッドを増殖させ、抗体産生につき再試験
し、そして制限希釈により２回サブクローン化した。腹
水は、プリスティン（ウィスコンシン州、ミルウオーキ
ー在、アルドリッチ・ケミカル社の２．＆ＩＱ、１４−
テトラメチルペンタデカン）において１０７個のハイブ
リドーマ細胞の腹腔内注射により（５００ｔ）で予備処
理し九ＢＡＬＤ／ｅネズミから作成した。腹水及び血清
を集め、８００Ｘｆでの遠心分離により清澄化させ、−
８０℃にて貯蔵した。免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を、
半飽和の硫酸アンモニウム（Ｐ）１７．０）による沈Ｗ
に続き、（Ｌ（１４Ｍ（Ｆ）燐酸塩緩衝液（ｐＨ４８）
で透析して培養上Ｕ液から作成した。ｍ水と向潰と濃厚
＃ｆ養上好液とを試験して、下記例２に記載したように
それらの反応性につき特性化した。検体、すなわちモノ
クローナル抗体Ａ２Ｃ７及びＣ２Ｃ７を標帛技術（ミズ
ウリー州、ケンシントン在、リットン・ピオネティック
ス社の特異性抗体による免疫拡ｈ）により、ＩｇＧｍ鎖
とカッパＫ）軒鎖との両者であることが示された。

検体のハイブリドーマ細胞ラインは、メリーランド州、
ロッタビル在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クションに１９８３年１１月１日付けで寄託した。検体
細胞ラインにはＡＴＣＣＡＨＢ−８３９７及びＡＴＣＣ
ＡＨＢ−８５９８がそれぞれ付与された。

例　　■ 中　法度化法 Ｃ・アルビカンスからの部分精製し九景白質〔例１のＡ
部に記載したようにＤＥＡＥカラムから０．０２　ｖ／
ｖ％Ｎ　ａ　Ｎ　ｇを含むα０５Ｍのトリス−ＨＣＩ（
ｐＨ７，８）における（ＬＯ２８〜α０６６ＭのＮａＣ
１で溶出させた多白質〕の沃素化は、法度化ｆｆｍ（７
レーカー及びスペック、バイオケミカル・バイオフイジ
オロジカル・リサーチ・コミューニケーション、第８０
巻、第８４９−８５７頁（１９７Ｂ））により行なった
ｏ　２００　／Ｊ　Ｌ（Ｄクロロ、ホルムに溶解したイ
オドゲン〔イリノイ州、ロック７オード在、ピアス・ケ
ミカル・カンパニー社、ｔ　３．４．６−テトラクロル
−３α、６α−ジフエニルグリクリル〕１０μｔを綺麗
なガラス壜（平底）の表面上に蒸漬させた。カンジダ蛋
白質（ａ、　１Ｍｇ４醇塩緩衝液（ｐＨ７，４）２００
Ｐｔ’Ｆ２００μ？〕とａＩＮＮａＯＨにおける１　ｍ
ｃｉ０軸Ｉ”〔マサチューセッツ州、ポストン在、ニュ
ーイングランド、ヌクレア社〕とをこの壜に添加し、そ
して定期的に回動させながら室温にて１時間培養した。

６Ｍし九蚤白質をＧ−２５セフアデツクス（ファルマシ
ア社）カラム（１０Ｘ２００ｄ）を通すゲル濾過によっ
て未反応沃化物から分離した。

ゼラチン燐酸塩緩衝液（（Ｌ２Ｗ／マ％ゼラチンとａ　
０２　Ｗ／ｖ％ＮａＮｇとを含有するα１Ｍの燐酸塩緩
衝液ｐ　Ｈ７，４）を平衡化及び流過用緩衝液として使
用した。排出したピーク（標識蚤白質）を集め、−８０
℃にてこれら部分を貯蔵した。

（１１）免疫沈澱 ケスラーにより実質的に記載されたように免疫ｔＪ：、
ρも行なった〔ジャーナル・イミュ・ノロジー第１１５
巻、第１６１７−１６２４頁（１９７５））。

洗浄用緩衝液はＲＩＰＡとした〔α０１Ｍのトリス−Ｈ
ＣＩ（ｐ）１７．４）、α５Ｍｃ７）ＮａＣ１，（１０
０１Ｍのエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ｔ
ｏｗ／ｖ％のトリトンＸ−１０口゛、ｔｏｗ／ｖ％のデ
スオキシコール酸ナトリウム、α１ｗ／ｖ％のドデシル
硫酸ナトリウム（８ＤＳ）及びα０２　ｖ／マ％のＮ　
ａ　ＮＨ）。標識された抗原抽出物を、熱滅菌しかつホ
ルマリン処理し九Ｓ・アウレウス・コーワンｔ（ｓＡＣ
）（パンツルピン、カルピオヘムーベーリング社）の１
０ｖ／マ襲懸濁液Ｂ−からのベレットに加えて予励清澄
させた。抗原とＳＡＣとを氷上で定期的に回動しながら
１時間培養し、そして細菌を遠心分離により除去した。

次いで、標識した抗原〔予備清匿された毎分１〜５Ｘ１
０・のトリク四ル酢醗−沈澱性カウント）を、１ｏ口μ
ｔの硫酸アンモニウム−濃厚モノクローナル抗体液、ハ
イブリドーマを有するネズミからの血清１．０／Ｉｔ又
はハイブリドーマを有するネズミからの腹水１゜ｐｔに
加えて４℃で１８時間培養した。

第２の抗体（ウサギ抗−ネズミＩｇＧ、ＩｇＭ及びＩｇ
Ａ、カルビオヘムーベーリング社）の５μｔを各試験管
に加え、４℃で１８時間培養した。過剰の５ＡＣ（５０
０μｔ）を加え、さらに４℃で２時間培養した。遠心分
離により細菌を集め、そしてＲＩＰＡ緩衝液で４回洗浄
した。次いで、ベレットを２×電気泳動試料緩衝液に再
懸濁させ、レムリーにより記載されたような５Ｄ８−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）〔
ネイチャー（ＵＳＡ）第２２７巻、第６８０−６８５頁
（１９７０）〕の準−をした。遠心分離により細菌を除
去し、そして上澄液をＳＤＳ１２Ｗ／マ％ポリアクリル
アミドゲルに加えた。免疫沈澱物の電気泳動の後、これ
らゲルを固定化し、かつクーマシー−９（１０マ／マ％
メタノール、１゜Ｖ／マ％氷酢学及び８０マ／マ％蒸留
水におけるクーマシー＃Ｇ２５０のａ　５　ｗ／ｖ％溶
液）で４５分間染色し、染料を含まない上記溶剤にて染
色除去し１、戸紙上で乾燥させ、そしてデュポン・クロ
ネックス・ハイ−プラス強化スクリーン（プラウエア州
、ウイルミントン在、デスぎン・インストルーメンツー
ＡＣＡ社）を用いて又は用いずにコダックＡＲ−５フィ
ルムにューヨーク州、ロチニスター在、イーストマン・
コダック社）に露出した。この実験からのデータを第２
図に示す。

例ｍ モノクローナル抗体Ａ２Ｃ７及びＣ２Ｃ７の反応性を、
カンジダ症を有する患者の血清における抗体の反応体と
、スタフＡ免疫沈澱により比較し方法における相違点は
、５μｔのヒト血清を毎分ｌＸ１０’のトリクロル酢酸
−沈澱性カウントのｒ１２ｓ−標識した抗原と共に培養
しかつ抗ネズミの第２抗体を省略した点である。５１欄
のヒト血清を分析した。これら血清を次のような４群に
分割した： ｔ　深部８１細、すなわち感染カンジダ症。

これらの血清は深部組織、すなわち感染カンジダ症を有
すると診断された患者からのものとした。

（ｉｉ）正常な無菌体液（尿を除く）からの或いは深部
組織材料から無菌的に得られるカンジダｓｐｐ。

の単離、（ｉｉ）非無菌表面と接触しない深部組織材料
の組織学的証明、又はＧｖ）典型的なカンジダ症の視鏡
所見とカンジダ感染症に一致する臨床状態とな伴なう肉
眼球炎を含む。この群には、局部的な侵食性カンジダ症
を有する患者からの２ｍの血清と、Ｃ・バラプシロシス
（Ｃ−ｐａｒａｐａｌｌｏｓｉｍ）による心内膜炎を有
する患者からの２ａｌｉの血清とが含まれた（２５種の
血清を群１に入れた）。

２　非侵食性カンジダ症。

これらは、血清を抜き取った際に感染カンジダ症を発生
する危険があるが、明らかに感染していない患者からの
ものとした。この群における患者は、その３１！質状態
として手術、やけど、傷又は癌を有した。カンジダｓｐ
ｐ、をこれら患者の粘膜表面及び尿から分離した（１０
柚の血清を＆ｖ２に入れた）。

五　他の菌感染症。

これらの血清は、ヒストプラスマ・カブスラツム（Ｈｌ
ｇｔａｐｌａａｍａ　ｅａｐｓｕｌａｔｕｍ　）、クリ
プトフッカス・ネオホルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｅｏｅｅ
ｕａ　ｎａｏｆｏｒｍａｎ＊）、コツキジオイデス・イ
ミチス（ＣｏｃｅｌｄＬｏｉｄ＠ａｉｍｍｌＨｍ　）　
及びアスペルギルス・スペシース（Ａｓｐ＠ｒｇｉｌｌ
ｕａ　ｓｐｐ、　）に基づ（菌感染症を有する患者から
のものとした（１０種の血清を群３に入れた）。

４、　正常な健全個体。

これらの血清は、健全な入院してない男女からのものと
した（６種を群４に入れた）。

第３図は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分向された免疫沈澱
物の放射能写真を示す。４８−５２Ｋｄの見かけ分子坦
をもって移動する免疫沈′ＭＩｗ域を切除し　１１２５
をγカウンターで計数した。この分析の結果を第４図に
示す。

例　　■ 親和性クロマトグラフィー、ＭＣＥ　（４２〜１１４Ｗ
Ｉの蛋白質）を例１−Ａと同様にコンカナバリンＡ親和
性カラムに通した。結合しない物質、たとえばマンナン
除去された成分を県め（２−７ラクシヨン）、２８０ｎ
ｍにおける光学密度を分光光度法により測定した（ボッ
シュ・アンド・ロブ社、ニューヨーク州、ロチェスタ）
。マンナン除去され九物寅を集め、凍結乾燥しうるｐＩ
（約７〜約８のＵ＆液に対し透析し、そして凍結乾燥し
た。

好適な凍結乾燥しうるＶ極液はＱ、ＱＱＩＭの（ＮＴ（
４）ｚＨｃＯ３（ｐ　Ｈ７，４）である。フンカナバリ
ンＡのカラムに充填された蛋白質の約６０％を未結合フ
ラクションとして回収し、これをコンＡの存在下で交差
免疫親和′電気泳動法によりマンナンの存在につき試験
した。未結合物質が検出しうるマンナンを含有した場合
、この試料を単味のコンＡ　　ＡＢカラムに再び通した
。この方ラムは、結合マンナンを緩衝液Ａにおけるα０
５モルのα−メチルアンノシド（アルＦリッチ社）で溶
出させた後に緩衝液入のみにより数回溶出させて再生し
た。

マンナン除去した細胞質抽出物（ＭＤ−ＣＥ）１５２１
ＩＦ／ｆｒ白質を、約ｐＨ４５にて緩衝能力を有する緩
衝剤で約１０５Ｍの緩衝イオン濃度に平衡化したカルボ
キシメチルセルロース（［ＣＭＪ）イオン交侠カラムに
通した。α０５Ｍのイミダゾ−／Ｉ／（ｐ　Ｈ４５）が
好適である。他の有用なアニオン性ａ！衝剤は酢酸塩、
バルビッール酸塩、クエン酸塩、燐酸グリシンなどを包
含する。ＣＭ−セファロースカラムが好適なカルボキシ
ルメチルセルロースカラムである。非結合物質をイミダ
ゾール緩徴液によりカラムから洗浄除去し、そして０〜
α５ＭＮａＣ１の濃度勾配を用いて結合蛋白質を溶出さ
せた。ナトリウム若しくはカリウムの他の塩も使用する
ことができる。非結合物質及びＮａＣ１１ｍ度勾配の最
初のピークをアミコン濾過により濃縮し、次いで１２％
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分解した。８Ｄ８−ＰＡＧＥ分離の
後、ゲルを蒸留水で洗浄し、そして氷冷した（１２５Ｍ
のＫＣＩ／１ミリＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）に
よりバンドが不明瞭になるまで染色した。適切な分子型
のバンドを切り取って、これをチアミンチューブ内に入
れ、ここで洗浄しかつ２回染色除去し、次いで水冷した
１ミリＭＤＴＴにおいて２０分間培養した。５−の溶出
緩衝液（５ミリＶ　　ＤＴＴ。

α　１５　ミ　リ　−１の　ＮａＣ１、α　１　ミ　リ
　Ｍの　ＥＤＴＡ。

００５Ｍのトリス−ＭＣＩ並びにα１％ＢＤＢ及びＦＭ
ＳＦ１ミリＭ）をチューブに加え、そして乳棒を用いて
このゲルを破砕した。蛋白質をゆっくり攪拌しながら室
温で２時間溶出させ、次いで４℃にて１晩置いた。この
物質を５００口ｒｐｍにて一２℃で１５分間遠心分ポす
ることにより、アクリルアミドを沈澱ＳＯ８との両者を
単離蛋白質から分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行な
って、蛋白質純度を検査した。第５図は、製造用ゲルか
ら溶出させ、次いでウサギ接種に使用した蛋白質につい
て行なったＳＤＳ−ＰＡＧＥの例を示している。これら
のゲルをクーマシー青Ｇ２５０で染色する。分子鼠標準
は右側の帯であり、左側の帯は精製した４８−５２Ｋｄ
の蛋白質を含む。

Ｃ０抗体産生 二ニーシーラント産の白色ウサギ（体重５ｋｑ　”）を
使用して、４８−５２Ｋｄ蛋白質に対する抗体を産生さ
せた。不完全フロイントアジバントにおける２００〜５
０Ｑｐ９の蛋白質な鰻初に皮下注射した後、不完全７０
インドアジバントにおける１５０μｔの蛋白質を２週間
毎に３ケ月間注射し、次いで毎月１回注射した。これら
ウサギを毎週出血させて、抗体レベルをロケット免疫電
気泳動により測定した。

スタフ免疫沈澱は、Ｃ・アルビカンスの３７℃ハイ７ア
ル高速度上澄液調製物のパルス標識したし−（Ｃ１４）
ロイシン溶解物（ＰＬＬ）につき行なつた〔アーレンス
等、ジャーナル・ジェネラル・マイクロパイオルジー、
第１２９巻、第１１３３−１１５９頁（１９８３））。

２ａａｐｔのＰＬＬを１００μＬの正常ＩｇＧと共に５
７℃で１５分間培養することにより予備清浄した。５ａ
ａｐｔのスタフ人を混合物に加え、３７℃で１５分間及
び４℃で６０分間培養した。遠心分ｓ後、上澄液をデカ
ントし、そしてこれを５ｏｏｐｔのスタフ人及び１ミリ
Ｍの弗化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）に加え
、そして３７℃で１５分間及び４℃で６０分間培養した
。この物質を遠心分離し、インターテクニック３００Ｏ
８Ｌ型の液体シンチレーションカウンターで計数するこ
とにより全分解物を毎分測定した。分析に使用した免疫
グロブリンは、４８−５２Ｋｄｆ白質を接種したウサギ
からのものとした。４ηの免疫グロブリンを５０μｔの
予備清浄したＰＬＬに加え、そして３７℃で１５分間及
び４℃で１２時間培養した。５００μＬのスタフＡ及び
ＰＭＳＦを加え、次いでこの物質を遠心分離し、上澄液
を計数し、そしてペレットを緩衝液で洗浄した。ペレッ
トを電気泳動緩衝液に再懸濁し、モしてレムリにより記
載されたように５Ｄ８−ＰＡＧ）ｉ：の準備をした〔ネ
イチャー（ＵＳＡ）、第２２７巻、＠６８０−６８５頁
（１９７０））。遠心分離により細菌を除去し、そして
上澄液をＳ　Ｄ　８１２　ｖ／マ％メリアクリルアミド
ゲルに加えた。免疫沈澱物の電気泳動の後、ゲルを固定
し１クーマシー青〔１０マ／マ％メタノール、１０マ／
マ襲氷酢酸及び８０マ／マ≦蒸留水におけるａ　３　ｗ
／ｖ％　Ｉ−ｒシー青Ｇ２５０）で４５分間染色し、染
料を含まない上記溶剤中で脱色し、２紙で乾燥させ、そ
してデュポン・クロネツクス・ハイ−プラス強化スクリ
ーン〔プラウエア州、ウイルミントン在、デュポン・イ
ンストルーメンツーＡＣＡ社〕を用いて又は用いずにコ
グツクＡｌ１−５フイルム〔ニューヨーク州、ロチニス
ター在、イーストマン・コダック社）に露出した。

この実験からのデータを第６図に示す。

例　　Ｖ モノクローナル抗体Ａ２Ｃ７及びＣ２Ｃ７、或プチド地
図 免疫沈澱により同定された■１意＊標識した蛋白質抗原
の制限蛋白分解切断を、クリーブランド等により実質的
に記載されたように行なった〔ジャーナル・バイオロジ
カル・ケミストリー、ｗＥ２５２巻、第１１０２−１１
０６頁（１９７７））。小力の刃を用いて乾燥ゲルから
バンドを切り取り、蒸留水中７マ／マ％氷酢酸の溶液中
で１晩再水和した。ゲルスライスにおける蛋白質の切断
法は、α１５μｆ（α１０Ｈの酵素活性）のＳ・アウレ
ウス（Ｓ、　ａｕｒａｕｓ　）　Ｖ　８プｐテ了−ゼ（
マイルス・ラボラドリース・エルトハルト社）を用いて
行なった。基質（ｉｌ！ＳＭＡ該蛋白質）及び酵素を、
積層した分離ゲルの界面において４５分間培養した。

レムリにより記載されたように〔ネイチャー、第２２７
巻、第ｔ５８０−ｔｓ８５頁（１９７０））、１５ｗ／
マ％アクリルアミドゲルを用いてＳＯ８−ＰＡＧＥによ
りペプチド断片を分離した。ゲルを固定し、染色し、炉
祇で乾燥させ、かつ例Ｉに記載したようにデュポン・ク
ロネツクス・へイープラス強化スクリーンを用いてコダ
ックＡＲ−５フィルムに露出した。これら分析からのデ
ータを第７図に示す。

データの説明 第４図は、５Ｏ８−ＰＡＧＥにより分析されたα０２−
α（１６ＭＮａｃ１を含有する流過用緩衝液によりＤＥ
ＡＲ−セファセルカラムから溶出された７ラクシヨンを
示している。これら７ラクシヨンにおける蛋白質を使用
して、ハイブリドーマ生成用としてネズミを免疫化した
。ゲルを銀技術により染色した。

第２図は、スタフＡ免疫沈澱を用いてモノクルーナル抗
体Ａ２Ｃ７及びＣ２Ｃ７により識別されたＩｔｔｓ標励
抗原の放射能写真を示している。部分精製したカンジダ
抗原をイオドゲン技術により１１！６により標識した。

帯１ａ及び１ｂはそれぞれ、免疫沈澱における抗原とし
て使用した■ｔｌｓ−１ｅＡ識領域Ａの蛋白質の１分間
当り２．５　Ｘ　１０１及び５　Ｘ　１０Ｓのトリク゛
ロル酢酸−沈澱性カウントを示している。帯２〜１２は
ウサギ、ヒト及びモノクルーナルの抗体により沈澱した
抗原を示している。

帯２１及び２ｂは、それぞれ免疫ウサギ血清により識別
された抗原の７０時間及び２４時間露出を示している。

帯３は正常なウサギ血清により沈澱された抗原を示して
いる。帯４はＣ・バラプシロシスに基づく心内膜炎を有
する患者からの血清（＆６１　Ｂ　）により沈澱し九抗
原を示している。

帯５ａ及び５ｂはそれぞれ侵食性カンジダ症を有する。

働者からの血清（Ｃ−２１）により誦別された抗原の７
０時間及び２４時間篇出を示し、帯６は正常な健全個体
からの血清を示している。帯７及び８はそれぞれハイブ
リドーマＡ２Ｃ７及びＣ２Ｃ７を接種したネズミからの
悪性腹水により沈澱した抗原を示している。帯９及び１
０は、Ｃ・アルビカンスに対するモノクルーナル抗体（
ＩｇＧ＋／カッパ）を分泌する他のハイブリドーマ、或
いは不明確な特異性を有するモノクルーナル抗体を分泌
するハイブリドーマからの培養土液液をそれぞれ接種し
たネズミからの悪性腹水により沈澱した抗原を示してい
る。帯１１及び１２は抗原及び第２抗体（ウサギ抗−ネ
ズミ）と共に培養したＳ・アウレウス細胞、並びに抗原
のみと共に培養したＳ・アウレウス細胞によりそれぞれ
沈澱させた蛋白質を示している。

第３図は、ヒト血清における抗体によりＤＥＡＥカラム
から溶出した部分精製カンジダ蛋白質のスタフＡ免疫沈
澱物の放射能写真を示している。カンジダ蛋白質は、イ
オドゲン技術により種晶した。

各群における血清からの代表的放射能写真を示す。

＃１は感染カンジダ症を有する患者からの血清を含み、
群２は非侵食性の表在性カンジダ症を有する廖者からの
血清を含み、群３は他の菌感染症を有する患者からの血
清を含み、さらに群４は健全な入院してない男女からの
血清を含んでいる。パネルＡはＩＥＬ５〜２３時間露出
した放射能写真全示し、パネルＢはパネルＡにおける群
１からの血清の６７時間露出を示し、パネルＣはＳ・ア
ウレウスｗＵ胞のみ及び１ｌＺＳ−標識カンジダ蚤白質
により沈澱させた抗原の２１時間露出である。

第４図は、ヒト血清における抗体によりＣ・アルビカン
スの４８−５２ＫｄのＳ・アウレウス免疫法ρを示して
いる。この抗原は、イオドゲン技術によりＩｔｚｓで標
識した。データは、４８−５２Ｋｄ抗原を５Ｄ８−ＰＡ
ＧＥゲルから切り取りかつこれをｒカウンタで計数して
得られた。各点は４８−５２Ｋｄ抗原につき沈澱した特
定カウントを示し、すなわち１分間当りの試料カウント
（ｅｐｍ　）マイナスＳ・アウレウス細胞のみのｅｐｍ
である。群１は感染カンジダ症又は侵食性カンジダ症を
有する患者からの２５Ｗ１の血清を含む。胃は局部的侵
食性カンジダ症を有する２人の患者からの血清を示し、
口はＣ・バラプシロシスに基づく心内膜症を有する患者
からの血清を示す。群２はカンジダ症の危険性を有する
患者からの１０種の血清を含む。

これらの患者は非侵食性の表在性カンジダ症を有した。

群３は他の菌感染症を有する患者からの１０椀の血清を
含む。群４は健全な入院してない男女から６Ｍ１の血清
を含む。幾何平均及び平均からの標章偏差は次の通りで
ある：群１　＝　ｔｏｏ［１Ｌ２４（２１２，９０〜４
．＋５９９．４５）　　ｃｐｍ；詳２＝ｔ９７（ｔ０７
〜１６５）ｃｐｍ；詐３＝ｆｂ２２（ｔ９６〜１９．７
３　）　ｃｐｍ　”、及び群４＝Ｏ（０）　ｅｐｎ＋０
−定効果による変動の片側分析を用いて得られたＦ値は
２α２７であり、これはｐ〉α００１をもって高度に有
意である。

第５図は、製造用ゲルから溶出されかつウサギ接種に使
用した４８Ｋｄ蛋白質のＳ　ＯＳ　−ＰＡＧＥ分析を示
している。左側の帯は４８Ｋｄ−ｉ白質を示し、かつ右
側の帯は分子輩標準を示している。

第６図は、ａａｘａ’ｌ白質に対し免疫化したウサギか
らの血清のスタフ免疫沈澱の４週間放射能写真を示して
いる。全ての帯は穴１個当り毎分７０ＯＯｆｉの分解物
を含む。帯１及び２はＣ１０−ロイシンでパルス標識し
た高速度上澄抽出液の１分当り７０００個の分解物を示
し、帯５は分子−標準を示す。帯４及び５は４８Ｋｄ蛍
白質で免疫化したウサギからの血清により沈澱させた抗
原を示している。

第７図は、Ａ２Ｃ７及びＣ２Ｃ７，２種のヒト血清並び
に４４８−５２Ｋのカンジダ蚤白質に対し免疫化したウ
サギからの血清によって免疫沈澱させた３種の抗原（４
８〜５２．Ｋｄ蛋白質、１２０〜１３５Ｋｄ蛋白質及び
５５〜３８Ｋｄ蛋白質）の制限蛋白分解を示している。

各血清により免疫沈澱させ九３ａｌの抗原を初期ゲルか
ら切り取り、かつＳ・アウレウスのプｐテアーゼで処理
した。酵素切断により生じた断片を１５％アクリルアミ
ドＳＤＳ−ゲルで分離した。主要なペプチド断片のパタ
ーンを図示する。６帯及びその内容は次の通りである；
帯１はＳ・アウレウス細胞のみにより沈澱した４８−５
２Ｋｄの抗原であり、帯２は侵食性カンジダ症を有する
患者からの血清（Ｃ−２１）により沈澱した４８−５２
Ｋｄの抗原であり、帯３は免疫ウサギからの血清により
沈澱した４８−５２Ｋｄの抗原であり、帯４はＣ・バラ
ブシロシス（ｐａｒａｐｓ五１ｏｓｉａ　）に基づく心
内膜炎を有する患者からの血清（Ａ６１　Ｂ　）により
沈澱した４８−５２Ｋｄの抗原であり、帯５はＣ２Ｃ７
により沈澱した４８〜５２Ｋｄの抗原であり、帯６はＡ
２Ｃ７により沈澱した４８−５２Ｋｄの抗原であり、帯
７はＡ６１８により沈澱した１２０〜１３５Ｋｄの抗原
であり、帯８はＣ２Ｃ７により沈澱した１２０〜１５５
　Ｋｄの抗原であり、帯９はＣ−２１により沈澱した１
２０−１５５Ｋｄの抗原であり、帯１ｏは免疫ウサギか
らの血清により沈澱した１２０−１３５Ｋｄの抗原であ
り、帯１１はＡ２Ｃ７によす沈澱した１２０−１３５Ｋ
ｄの抗原であり、帯１２はＡ２Ｃ７により沈澱した３５
−３８Ｋｄの抗原であり、帯１３は免疫ウサギからの血
清により沈澱した３５〜３８　Ｋｄの抗原であり、帯１
４は分子旭範囲３５−３８Ｋｄのムロ１８により沈澱し
たダブレットの上方バンドであり、帯１５は分子鼠範囲
３５−３８Ｋｄの墓６１８により沈澱したダブレットの
下方バンドであり、帯１６はｃ−２１により沈澱した５
５−３８Ｋｄの抗原であり、帯１７はＣ２Ｃ７により沈
澱し九３５−５８Ｋｄの抗原である。帯１及び２は４０
０時間の露出を示し、帯３ａ〜６ａは２２．５時間の露
出を示し、帯５ｂ−６ｂは７時間の露出を示し、帯７及
びＢは４００時間の露出を示し、帯９〜１１は２１５時
間の露出を示し、帯１２及び１５ａ〜１６１は２１５時
間の露出を示し、帯１３ｂ−１６ｂ及び１７は９１時間
の露出を示す。全ての露出は強化スクリーンの存在下で
行なった。

スタｙＡ免疫沈澱を行なって、モノクローナル抗体Ａ２
Ｃ７及びＣ２Ｃ７により識別された抗原の見かけ分子量
を特性化した。第２図におけるデータは、モノクローナ
ル抗体Ａ２Ｃ７及びＣ２Ｃ７の両者が５Ｏ８−ＰＡＧＥ
により１２ｖ／ｖ％アクリルアミドゲルで測定（この方
法の説明については例「参照）して１２　（１−１５５
Ｋｄ１４８−５２Ｋｄ及び５５−３８Ｋｄの見かけ分子
量を有する３種の蛋白質の最小量を免疫沈澱させること
を示している。これらモノクローナル抗体により識別さ
れ４８−５２Ｋｄの蛋白質は、抽出物からなるこれら７
ラクシヨンの銀染色ゲルから判るように、Ｃ・アルビカ
ンスの部分精製した抽出物における主要な蛋白質である
（第１図参照）。

モノクローナル抗体Ａ２Ｃ７及びＣ２Ｃ７により識別さ
れる３種の抗原の関係を、Ｓ・アウレウスｖ８ブリテア
ーゼを用いる制限蛋白分解により検討した。この分析に
よる結果を第７図に示す。

３種の抗Ｉｆ白質（１２Ｇ−１５５Ｋａ、　４ａ−５２
Ｋｄ及び３５−３８Ｋｄの蛋白質）の制限蛋白分解切断
は、これら５１ｊ１の蛋白質が著量の主ｗ４造を共有す
ることを示している。さらにこのデータは、Ａ２Ｃ７及
びＣ２Ｃ７の両者が同じサブ群のカンジダ蛋白質を識別
することを示している。これら３棚の蛋白質の間の共有
主構造は、２種のモノクローナル抗体により識別される
抗原決定子を規定することができる。同−若しくは類似
の主構造を有する他のカンジダ蛋白質もモノクローナル
抗体Ａ２Ｃ７及びＣ２Ｃ７により識別されると思われる
。

これらモノクローナル抗体の血清診断能力を、カンジダ
症を有する患者からの血清における抗体をスタフＡ免疫
沈澱により特性化して検討したＣ例［）。この検討のデ
ータを第３図−及び第４＠に示す。第４図に示したデー
タは、侵食型のカンジダ症を有する患者が非侵食性のカ
ンジダ症を有する患者、他の菌感染症を有する患者又は
正常な健全個体よりも著しく高いレベル（一定効果によ
る変動の片側分析を用いてｐ＜α００１）の４８−５２
Ｋｄカンジダ蚤白質に対する抗体を有することを示して
いる。侵食性カンジダ症を有する２人の患者の血清にお
ける抗体により免疫沈澱させ九同じ見かけ分子量の抗原
を、例■に記載したように制限蛋白分解により検討した
。これらのデータ（第７因）は、侵食性カンジダ症を有
する患者の２棹の血清における抗体で識別された抗原が
モノクローナル抗体人２０７及びＣ２Ｃ７により識別さ
れた同じ抗原であることを示している。これらのデータ
は、モノクローナル抗体がＣ・アルビカンス（ａｌｂｌ
ｃａｎ＊　）からの血清診断上ｍ要な抗原（４８−５２
Ｋｄ）を識別することを確認した。この抗原は、他のカ
ンジダスペシースの抽出物においても検出しうると思わ
れる。何故なら、Ｃ・パラブシリシスに基づく心内膜炎
を有する患者からの血清がＣ・アルビカンスからの４８
−５２Ｋｄ抗原を識別するからである。

４８−５２Ｋｄｆ白質を明らかな均質性まで積重しく第
５図）、これを使用してウサギを免疫化した。得られた
モノ特異性ボリクＵ−ナル抗体の特異性につき、Ｃ１４
−標識した細胞ｆｆ景白質の免疫沈澱により検査した。

第６図に示したように、４８−５２Ｋｄの単一バンドが
免疫沈澱された。制限蛋白分解により示すように、この
４８−５２Ｋｄ蛋白質は、モノクワ−ナル抗体及び感染
カンジダ症を有するヒトの血清により沈澱したものと同
じであった（第７図）。さらに、この抗血清は１１２５
標識した１２０−１５５Ｋｄ及び３５−３８Ｋｄの分子
量を有する領域Ａの蛋白質を沈澱させ、これは上記した
ように４８−５２Ｋｄｆ白質と極めて類似したペプチド
地図を有する。

本Ｍ明のモノクローナル及びｌリフローナル抗体は、カ
ンジダ抗原を識別する診断用途を有する。

これらの抗体は、限定はしないが、ラテックス膠着、放
射線免疫分析（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸収分析（ＥＬ
ＩＳＡ　）又はその他の適当な抗原検出方式を包含する
各種の標準分析を用いて、免疫抑、１１」された患者に
おける体液の抗原を検出するのに有用である。と思われ
る。患者の体液を抗体と接触させ、これに結合した物質
を測定する。

精製法にりき本明１ｔａｉｉに開示したカンジダ抗原も
診断用途を有する。従来の研究（ストロツクパイン、ラ
ーゲン、ツパイベル及びバラフレー、容Ｍ、Ｉｎｆ、　
＆　Ｉｎｎ、　）に示したように、感染カンジダ症を有
する患者の血清における抗体はこれらの抗原を識別する
のに対し、（１）正常個体、（２）カンジダのコロニー
を有するが侵食性の病気をもたない患者、及び（３）他
の１ｉｉｌｉ感染症を有する患者、の血清における抗体
はこれら抗原を識別しない。たとえばＥＬＩ８Ａ、ＲＩ
Ａ、ラテックス膠着、免疫プロット分析又は他の適当な
分析方式のような検出方出を使用して、上記抗原に対す
る抗体を検出することができる。

それぞれＣ・アルビカンスの細胞質抗原に対する単一の
モノクローナル抗体を産生ずる２Ｆ４のハイブリドーマ
についてのみ記載したが、本発明はここに記載した特徴
を示す全てのモノクローナル抗体を包含すると考えられ
る。

さらに本発明には、ここに説明したハイブリドーマ技術
を用いる上記モノクローナル抗体の＠遣方法も包含され
る。２つのハイプリ「−マの例のみをここに説明したが
、当業者はここに示した免疫化、融合及び選択法にした
がって、ここに記載した反応特性を有する抗体を産生じ
つる他のハイブリドーマも得ることができることが了解
されよう。公知のネズミ骨髄腫細胞ライン及び公知種類
のネズミからの脾細胞から得られた個々のハイブリドー
マはとのハイブリドーマにより産生される抗体を参照す
る以外には同定しえないので、上記反応特性を有する抗
体を産生ずる全てのハイブリドーマは本発明の範囲内に
包含され、このハイブリドーマを使用するこの抗体の製
造方法も同様に包含されることが了解されよう。

本発明によるモノクローナル抗体の産生に使用するイミ
ヱーノジエンの部分精製は、Ｃ・アルビカンスの細胞質
抗原の部分ｔ＃製により示される。

しかしながら、この新規な方法は、他の病原性カンジダ
棟の細胞質抗原の部分精製についても応用できる。

本発明によるモノクセ−ナル抗体及びモノ特異性ボリク
Ｕ−ナル抗体の産生に使用するほぼ生化学上純粋なイミ
ューノジエンの製造方法をＣ・アルビカンスの４８−５
２Ｋｄ細胞質抗原につき説明した。しかしながら、細胞
質抗原を単塩するためのこのＭ＠法は、他の病原性カン
ジダ種についても応用できると信じられる。

本発明はその思想及び範囲を逸脱することなく他の特定
形態で実現化することもでき、したがって上記の説明は
本発明の範囲を限定するものでない。

【図面の簡単な説明】

第１図はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析しかつ釦染色した
α０２−α０６ＭＮａＣｌを含有する流適用緩１Ｎ液に
よりＤＥＡＥイオン交換カラムから溶出させたカンジダ
・アルビカンスのマンナン除去された菌糸相の細胞質抽
出物の７ラクシヨンを示し、 第２図は本発明のモノクローナル抗体Ａ２Ｃ７及びＣ２
Ｃ７によりスタフＡ免疫沈Ｖを用いて識別される！１＠
Ｓ標識した抗原の放射能写真を示し、第３図はヒト血清
中の抗体により部分精製されたカンジダ（ＤＩＡＩイオ
ン交換クロマトグラフィーによる）のスタフＡ免疫沈澱
から、の放射能写真を示し、 第４図はヒト血清中の抗体によるＣ・アルビカンスの４
８−５２Ｋｄ抗原のＳ・アウレウス（Ｓ・ａｔｔｒ＠ｕ
ｓ　）免疫沈澱のプロットであり、第５図は製造用ゲル
から溶出されかつウサギ接種に使用する４８−５２Ｋｄ
蚤白質の８ＤＳ　−ＰＡＧＥ分析を示す略図であり、 第６図は４８−ｓ２Ｋｄ！白寅に対し免疫化したウサギ
からの血清のスタフ人免疫沈捗に閃する４週間の放射能
写真を示し、 第７図はＡ２Ｃ７、Ｃ２Ｃ７，２種のヒト血清及び４８
−５２Ｋｄカンジダ沓白質に対し免疫化したウサギから
の血清によって免疫沈澱させた４８−５２Ｋｄ螢自白質
１２０−１３５Ｋｄ景白實及び５５−３８．Ｋｄｆｄ質
の制限螢白質分解を示す。 ズ羊２゜ ＦＩＧ、　４ ｆ、￥３゜ １、明細書７５頁７．１０〜１１及び最下行の「放射能
写真」を「フラクション」に訂正する。 ２、同同頁下から４行の「示す」の後に「フラクション
の」を加入する。 ３、同７６頁５行の「制限蛋白質分解」の後に「のフラ
クション」を加入する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒトにおいて播種性カンジダ症の間に検出し得るが
   非侵食性Ｃ・アルビカンス感染の間に検出し得ないＳＤ
   Ｓ−ＰＡＧＥにおける見かけ分子量４８〜５２ＫｄのＣ
   ・アルビカンスの細胞質抗原に対する種類ＩｇＧのモノ
   クローナル抗体を産生する連続細胞ラインを含み、ネズ
   ミ骨髄腫に融合したＣ・アルビカンスの細胞質抗原によ
   り予め免疫化されたＢＡＬＢ／ｃネズミ脾細胞の細胞ハ
   イブリッドと、このハイブリッドに対する培地とを含む
   組成物。 ２、ネズミ骨髄腫がＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４である特許請
   求の範囲第１項記載の組成物。 ３、モノクローナル抗体が見かけ分子量１２０−１３５
   Ｋｄ、４８−５２Ｋｄ及び３５−３８Ｋｄの３種の細胞
   質抗原のいずれかと結合した特許請求の範囲第１項記載
   の組成物。 ４、モノクローナル抗体がＩｇＧ＿１カッパサブクラス
   である特許請求の範囲第１項記載の組成物。 ５、細胞ラインがＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ−８３９７及び
   ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ−８３９８よりなる群から選択さ
   れる特許請求の範囲第２項記載の組成物。 ６、ヒトにおいて播種性カンジダ症の間に検出し得るが
   非侵食性Ｃ・アルビカンス感染の間に検出し得ないＳＤ
   Ｓ−ＰＡＧＥにおける見かけ分子量４８〜５２ＫｄのＣ
   ・アルビカンスの細胞質抗原に対するポリクローナル・
   モノ特異性抗血清。 ７、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて１２０−１３５Ｋｄ、４
   ８−５２Ｋｄ及び３５−３８Ｋｄの見かけ分子量を有す
   るＣ・アルビカンスの３つの細胞質抗原と反応する特許
   請求の範囲第６項記載の抗血清。 ８、ヒトにおいて播種性カンジダ症の間に検出し得るが
   非侵食性Ｃ・アルビカンス感染の間に検出し得ないＳＤ
   Ｓ−ＰＡＧＥにおける見かけ分子量約４８〜５２Ｋｄの
   生化学的に純粋な無細胞壁のＣ・アルビカンス細胞質抗
   原。 ９、ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ−８３９７及びＡＴＣＣＮｏ
   ．ＨＢ−８３９８よりなるハイブリドーマの群から選択
   されるハイブリドーマにより産生されたモノクローナル
   抗体と特異的に反応する特許請求の範囲第８項記載の抗
   原。 １０、ａ、血清において播種性カンジダ症の間に検出し
   得るが非侵食性Ｃ・アルビカンス感染の間に検出し得な
   いＣ・アルビカンスの細胞質抗原を含有する組成物と血
   清とを接触させ、該抗原はＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて１
   ２０−１３５Ｋｄ、４８−５２Ｋｄ及び３５−３８Ｋｄ
   の見かけ分子量を有する抗原群から選び、 ｂ、該細胞質抗原への抗体の結合性を検出 することを含む感染又は侵食性カンジダ症の存在を検出
   するための診断方法。 １１、測定手段をラテックス膠着、放射線免疫分析酵素
   結合免疫吸収分析及び免疫プロット分析よりなる群から
   選択する特許請求の範囲第１０項記載の診断方法。 １２、細胞質抗原がＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ−８３９７及
   びＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ−８３９８よりなるハイブリド
   ーマの群から選択されるハイブリドーマにより産生され
   るモノクローナル抗体によって認知される特許請求の範
   囲第１０項記載の診断方法。