JPH01112995A - 高級ｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造法 - Google Patents
高級ｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造法Info
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- JPH01112995A JPH01112995A JP27095687A JP27095687A JPH01112995A JP H01112995 A JPH01112995 A JP H01112995A JP 27095687 A JP27095687 A JP 27095687A JP 27095687 A JP27095687 A JP 27095687A JP H01112995 A JPH01112995 A JP H01112995A
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
ｆＪＪ、−上辺上月分１
本発明は、医薬品として何用な高級Ｎ−７セチルキトオ
リゴ糖の製造法に関する。
リゴ糖の製造法に関する。
高級Ｎ−アセチルキトオリゴ塘は、ペンタオース、ヘキ
サオース、ペンタオースなど５ＷＩ以上のＮ−アセチル
キトオリゴ糖を指し、臨床検査におけるリゾチーム活性
の測定基質として有用で、また、Ｎ−７セチルヘキサオ
ースは、免疫機能増強作用、抗腫瘍効果などがあり、生
理活性物質としても有用である。
サオース、ペンタオースなど５ＷＩ以上のＮ−アセチル
キトオリゴ糖を指し、臨床検査におけるリゾチーム活性
の測定基質として有用で、また、Ｎ−７セチルヘキサオ
ースは、免疫機能増強作用、抗腫瘍効果などがあり、生
理活性物質としても有用である。
え米五且ｌ
従来、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造法としては、酸
によるキチンの限定加水分解［バイオケミ力・バイオフ
ィジカ・アクタ（Ｉ３ｉｏ−ｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ、Ａｃｔａ） ８３． ２４５−２５５ （１
９６ｔ）］ 、キチナーゼなどの酵素によるキチンの加
水分解［ネイチャー（Ｎｅｔｕｒｅ） ２００．１１２
８ （１９６３）］、キチナーゼ、リゾチームなどの糖
転移反応を利用した製造方法（特開昭６２−１４６５９
８）などが知られている。
によるキチンの限定加水分解［バイオケミ力・バイオフ
ィジカ・アクタ（Ｉ３ｉｏ−ｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ、Ａｃｔａ） ８３． ２４５−２５５ （１
９６ｔ）］ 、キチナーゼなどの酵素によるキチンの加
水分解［ネイチャー（Ｎｅｔｕｒｅ） ２００．１１２
８ （１９６３）］、キチナーゼ、リゾチームなどの糖
転移反応を利用した製造方法（特開昭６２−１４６５９
８）などが知られている。
しかしながら、酸によるキチンの限定加水分解では、２
〜４Ｗｔの低級Ｎ−アセチルキトオリゴ糖を比較的高い
収率で得ることができるが、５種以上の高級Ｎ−アセチ
ルキトオリゴ糖の収率は非常に低い。
〜４Ｗｔの低級Ｎ−アセチルキトオリゴ糖を比較的高い
収率で得ることができるが、５種以上の高級Ｎ−アセチ
ルキトオリゴ糖の収率は非常に低い。
またキチナーゼなどの酵素によるキチンの加水分解では
、５ｍ以上のＮ−アセチルキトオリゴ糖を特異的に生産
する酵素は発見されていない、リゾチームの糖転移反応
では、リゾチームが２〜４糖の低級Ｎ−アセチルキトオ
リゴ糖に対し、糖転移活性が弱いため、５糖以上の高級
Ｎ−アセチルキトオリゴ塘の生成量はきわめて少ない１
本発明者らは、キチナーゼの糖転移反応がリゾチームの
糖転移反応よりも強いことを見出し、キチナーゼを用い
た高級Ｎ−アセチルキトオリゴ糖の効率的な生産を開示
した（特開昭６２−１４６５９８）、 Ｌ、かし、この
方法は、３糖以上のＮ−アセチルキトオリゴ塘に作用し
５糖以上のＮ−アセチルキトオリゴ糖を生成するもので
、２９以上のＮ−アセチルキトビオースにはほとんど作
用しない欠点がある。
、５ｍ以上のＮ−アセチルキトオリゴ糖を特異的に生産
する酵素は発見されていない、リゾチームの糖転移反応
では、リゾチームが２〜４糖の低級Ｎ−アセチルキトオ
リゴ糖に対し、糖転移活性が弱いため、５糖以上の高級
Ｎ−アセチルキトオリゴ塘の生成量はきわめて少ない１
本発明者らは、キチナーゼの糖転移反応がリゾチームの
糖転移反応よりも強いことを見出し、キチナーゼを用い
た高級Ｎ−アセチルキトオリゴ糖の効率的な生産を開示
した（特開昭６２−１４６５９８）、 Ｌ、かし、この
方法は、３糖以上のＮ−アセチルキトオリゴ塘に作用し
５糖以上のＮ−アセチルキトオリゴ糖を生成するもので
、２９以上のＮ−アセチルキトビオースにはほとんど作
用しない欠点がある。
本発明は、これらの欠点を解決するため種々研究した結
果、２〜４＠の低級Ｎ−アセチルキトオリゴ糖を基質と
し、リゾチームを親水性有機溶媒存在下で作用させると
縮合反応あるいは転移反応により効率的に５１以上のＮ
−アセチルキトオリゴ糖が生成されるという知見に基い
ている。
果、２〜４＠の低級Ｎ−アセチルキトオリゴ糖を基質と
し、リゾチームを親水性有機溶媒存在下で作用させると
縮合反応あるいは転移反応により効率的に５１以上のＮ
−アセチルキトオリゴ糖が生成されるという知見に基い
ている。
が ′しようとする。題へ
従って、本発明の目的は、２〜４ｗｉの低級Ｎ−アセチ
ルキトオリゴ糖を用いて効率的に５糖以上の高級Ｎ−ア
セチルキトオリゴ塘を生産する改良された製造法を提供
することにある。
ルキトオリゴ糖を用いて効率的に５糖以上の高級Ｎ−ア
セチルキトオリゴ塘を生産する改良された製造法を提供
することにある。
Ｕ顕弘を ”するための
本発明は、低級Ｎ−アセチルキトオリゴ糖を基質とし、
リゾチームを親水性有機溶媒存在下で作用させることを
特徴とする高級Ｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造法を提
供する。
リゾチームを親水性有機溶媒存在下で作用させることを
特徴とする高級Ｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造法を提
供する。
本発明に使用する低級Ｎ−アセチルキトオリゴ糖は、例
えば、カニ、エビの甲殻から調製したキチンを酸や酵素
で加水分解して得たものを用いることができる。実用的
なｎ製法の一例を示すと、カニの甲殻を希塩酸処理によ
って脱灰後、希アルカリ処理で除蛋白して得たキチンに
濃塩酸を加え、３０〜５０℃で１〜６時間部分加水分解
する。得られた分解物を水酸化ナトリウムで中和後、残
漬を吸引濾過して除去し、濾液な活性炭カラムに展開し
、エタノール直線濃度勾配法で溶出し、Ｎ−アセチルキ
トビオースからＮ−アセチルキトテトラオースの低級Ｎ
−アセチルキトオリゴ糖をそれぞれ分離することができ
る。また、これらの低級Ｎ−アセチルキトオリゴ塘の混
合物でも本発明に用いることができる。
えば、カニ、エビの甲殻から調製したキチンを酸や酵素
で加水分解して得たものを用いることができる。実用的
なｎ製法の一例を示すと、カニの甲殻を希塩酸処理によ
って脱灰後、希アルカリ処理で除蛋白して得たキチンに
濃塩酸を加え、３０〜５０℃で１〜６時間部分加水分解
する。得られた分解物を水酸化ナトリウムで中和後、残
漬を吸引濾過して除去し、濾液な活性炭カラムに展開し
、エタノール直線濃度勾配法で溶出し、Ｎ−アセチルキ
トビオースからＮ−アセチルキトテトラオースの低級Ｎ
−アセチルキトオリゴ糖をそれぞれ分離することができ
る。また、これらの低級Ｎ−アセチルキトオリゴ塘の混
合物でも本発明に用いることができる。
本発明に用いるリゾチームは゛、市販の卵白リゾチーム
などを用いることができ、反応溶液中の親水性有機溶媒
は、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソ
プロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ジメ
チルスルホキサイド、ジオキサン、ホルムアミド、アセ
トンのうち１種類上を用いることができ、親水性有機溶
媒は２０〜８０％、好ましくは３０〜７０％の濃度にな
るように水または緩衝液を加え調整する０反応に用いる
低級Ｎ−アセチルキトオリゴ糖のｌは、反応溶液の飽和
濃度付近が好ましく、またリゾチームの量は、用いた低
級Ｎ−アセチルキトオリゴ１１１ｍｇに対し、リゾチー
ム活性としてｌ、 （ｌｏｏ〜Ｉｎ、 ０ＯＯＵが好ま
しい（リゾチーム活性： Ｍ、 １ｕｔｅｕｓの細胞壁
を基質とし、３５℃、ｐＨ６，２で５４０ｎｍにおける
吸光度を１分間にｏ、 ｏｏｔ減少させる酵４ｆｆｔを
ＩＵとする）。
などを用いることができ、反応溶液中の親水性有機溶媒
は、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソ
プロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ジメ
チルスルホキサイド、ジオキサン、ホルムアミド、アセ
トンのうち１種類上を用いることができ、親水性有機溶
媒は２０〜８０％、好ましくは３０〜７０％の濃度にな
るように水または緩衝液を加え調整する０反応に用いる
低級Ｎ−アセチルキトオリゴ糖のｌは、反応溶液の飽和
濃度付近が好ましく、またリゾチームの量は、用いた低
級Ｎ−アセチルキトオリゴ１１１ｍｇに対し、リゾチー
ム活性としてｌ、 （ｌｏｏ〜Ｉｎ、 ０ＯＯＵが好ま
しい（リゾチーム活性： Ｍ、 １ｕｔｅｕｓの細胞壁
を基質とし、３５℃、ｐＨ６，２で５４０ｎｍにおける
吸光度を１分間にｏ、 ｏｏｔ減少させる酵４ｆｆｔを
ＩＵとする）。
反応時間は、２０〜６０℃、好ましくは３０〜５０℃で
、反応ｐＨは４〜７が好ましい。反応時間ｉ酵素量、反
応温度、ｐＨによって異なるが、通常は１２応１２０時
間で目的とする反応生成物が最大量となる。
、反応ｐＨは４〜７が好ましい。反応時間ｉ酵素量、反
応温度、ｐＨによって異なるが、通常は１２応１２０時
間で目的とする反応生成物が最大量となる。
目的とする５ｖＩ以上のＮ−アセチルキトオリゴ糖は、
非常に溶解度が低く、反応液中に析出されるので、反応
の進行状況が確認でき、分離と回収とが容易である。加
熱などによって酵素反応を停止した後、例えば、遠心分
離、濾過等によっで回収できる０回収された生成物は、
５糖以上のＮ−アセチルキトオリゴ糖を多く含む混合物
である。
非常に溶解度が低く、反応液中に析出されるので、反応
の進行状況が確認でき、分離と回収とが容易である。加
熱などによって酵素反応を停止した後、例えば、遠心分
離、濾過等によっで回収できる０回収された生成物は、
５糖以上のＮ−アセチルキトオリゴ糖を多く含む混合物
である。
このようにして得られる反応混合物からの５糖以上のＮ
〜ルアセチルキトオリゴの分離、精製は、周知の分離精
製手段により行なうことができる０例えば、活性炭に反
応混合物を吸着させ、アルコール濃度勾配法により分離
溶出する方法や、ゲル濾過、高速液体クロマトグラフィ
ー等の手段により分離、精製することができる。
〜ルアセチルキトオリゴの分離、精製は、周知の分離精
製手段により行なうことができる０例えば、活性炭に反
応混合物を吸着させ、アルコール濃度勾配法により分離
溶出する方法や、ゲル濾過、高速液体クロマトグラフィ
ー等の手段により分離、精製することができる。
次に、本発明の実施例についてさらに具体的に説明する
が、これらの実施例によって本発明が何ら限定されるも
のではない。
が、これらの実施例によって本発明が何ら限定されるも
のではない。
叉１ｕ引上
Ｎ−アセチルキトビオース（Ｉｇ）なの０．１Ｍ酢酸緩
衝液（ｐＨ，５，５： ７ｍ１）のメタノール（７ｍｌ
）混合した溶液に溶解し、４０℃に保った後、市販の卵
白リゾチーム（６回結晶、生化学工業社製）を２．５Ｘ
ＩＯ’Ｕ添加して４０℃で９６時間反応させた。反応終
了後、１００℃で１０分間加熱し反応を停止させた。生
成した不溶物を遠心分離によって回収し、ついで少量の
熱水に懸濁し、再び遠心分離によって分離した０分離し
た不溶物を凍結乾燥機を用いて乾燥し、白色粉末（２０
０ｍｇ）を得た。この白色粉末の生成物組成を、高速液
体クロマトグラフィーによって確認したところ、Ｎ−ア
セチルキトオクタオース１６％、Ｎ−アセチルキトヘプ
タオース３５％、Ｎ−アセチルキトヘキサオース２１％
、Ｎ−アセチルキトペンタオース７％が含まれていた。
衝液（ｐＨ，５，５： ７ｍ１）のメタノール（７ｍｌ
）混合した溶液に溶解し、４０℃に保った後、市販の卵
白リゾチーム（６回結晶、生化学工業社製）を２．５Ｘ
ＩＯ’Ｕ添加して４０℃で９６時間反応させた。反応終
了後、１００℃で１０分間加熱し反応を停止させた。生
成した不溶物を遠心分離によって回収し、ついで少量の
熱水に懸濁し、再び遠心分離によって分離した０分離し
た不溶物を凍結乾燥機を用いて乾燥し、白色粉末（２０
０ｍｇ）を得た。この白色粉末の生成物組成を、高速液
体クロマトグラフィーによって確認したところ、Ｎ−ア
セチルキトオクタオース１６％、Ｎ−アセチルキトヘプ
タオース３５％、Ｎ−アセチルキトヘキサオース２１％
、Ｎ−アセチルキトペンタオース７％が含まれていた。
及ｉ勇ｌ
Ｎ−アセチルキトトリオース（６００ｍｇ）を０．３Ｍ
酢酸緩衝液（ｐＨ５，５； ｌ ０ｍ１）とメタノール
（１０ｎ＋１）と水（１０耐）とを混合した溶液に溶解
し５４０℃に保った後、市販の卵白リゾチーム（６回結
晶、生化学工業社製）を２．５ＸＩＯ’Ｌｌ添加して、
４０℃で７２時間反応させた０反応終了後、１００℃で
′ｌＯ分間加熱し、反応を停止させた。生成した不溶物
を遠心分離によって回収し、ついで少量の熱水に懸濁し
、再び遠心分離によって分離した。分離した不溶物を凍
結乾燥機を用いて乾燥し、白色粉末（１２９Ｂ）を得た
。
酢酸緩衝液（ｐＨ５，５； ｌ ０ｍ１）とメタノール
（１０ｎ＋１）と水（１０耐）とを混合した溶液に溶解
し５４０℃に保った後、市販の卵白リゾチーム（６回結
晶、生化学工業社製）を２．５ＸＩＯ’Ｌｌ添加して、
４０℃で７２時間反応させた０反応終了後、１００℃で
′ｌＯ分間加熱し、反応を停止させた。生成した不溶物
を遠心分離によって回収し、ついで少量の熱水に懸濁し
、再び遠心分離によって分離した。分離した不溶物を凍
結乾燥機を用いて乾燥し、白色粉末（１２９Ｂ）を得た
。
この白色粉末の生成物組成を、高速液体クロマトグラフ
ィーによって確認したところ、Ｎ−アセチルキトオクタ
オース１８％、Ｎ−アセチルキトヘプタオース３９％、
Ｎ−アセチルキトヘキサオース１８％、Ｎ−アセチ・ル
キトペンタオース５％が含まれていた。
ィーによって確認したところ、Ｎ−アセチルキトオクタ
オース１８％、Ｎ−アセチルキトヘプタオース３９％、
Ｎ−アセチルキトヘキサオース１８％、Ｎ−アセチ・ル
キトペンタオース５％が含まれていた。
ｌ肛互激】
本発明により、５糖以上の高級Ｎ−アセチルキトオリゴ
糖を効率的に製造することができる。
糖を効率的に製造することができる。
Claims (2)
- （１）低級Ｎ−アセチルキトオリゴ糖を基質とし、リゾ
チームを親水性有機溶媒の存在下で作用させることを特
徴とする高級Ｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造法。 - （２）親水性有機溶媒として、メタノール、エタノール
、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノー
ル、イソブタノール、ジメチルスルホキサイド、ジオキ
サン、ホルムアミド、アセトンのうち１種類以上を用い
る特許請求の範囲第１項記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27095687A JPH0646953B2 (ja) | 1987-10-27 | 1987-10-27 | 高級ｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27095687A JPH0646953B2 (ja) | 1987-10-27 | 1987-10-27 | 高級ｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01112995A true JPH01112995A (ja) | 1989-05-01 |
| JPH0646953B2 JPH0646953B2 (ja) | 1994-06-22 |
Family
ID=17493363
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27095687A Expired - Lifetime JPH0646953B2 (ja) | 1987-10-27 | 1987-10-27 | 高級ｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0646953B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010178642A (ja) * | 2009-02-04 | 2010-08-19 | Yaizu Suisankagaku Industry Co Ltd | 高級ｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造方法 |
-
1987
- 1987-10-27 JP JP27095687A patent/JPH0646953B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010178642A (ja) * | 2009-02-04 | 2010-08-19 | Yaizu Suisankagaku Industry Co Ltd | 高級ｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0646953B2 (ja) | 1994-06-22 |
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